MenSCs對PCOS大鼠卵巢損傷修復(fù)、生殖系統(tǒng)及HSP90表達(dá)的影響*

常慶玲 蔡文濤 陳麗華

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院生殖科,河南 洛陽 471000;2.慈銘博鰲國際醫(yī)院生殖中心,海南 瓊海 571442;3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院生殖科,河北 張家口 075000)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的內(nèi)分泌紊亂疾病,其發(fā)病率高達(dá)5%～10%,是女性無排卵不孕的的最常見原因[1]。PCOS通常在青少年時(shí)期開始出現(xiàn),其臨床表現(xiàn)具有顯著的差異性,常見的臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、不孕、多毛、痤瘡等。此外,PCOS還常伴有高血壓、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等多種并發(fā)癥。相關(guān)調(diào)查顯示[2],育齡期女性PCOS發(fā)病率接近15%,在無排卵性不孕患者中該病的發(fā)病率在90%以上,是目前致使女性不孕的主要原因。PCOS引起的無排卵性不孕是婦科的研究難點(diǎn),也是我國生育保健的難題。研究發(fā)現(xiàn)[3],抑制干細(xì)胞后改善局部微環(huán)境及病理狀態(tài),能提升機(jī)體相關(guān)器官的功能,且對受試者無不良影響。目前,關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于婦科內(nèi)分泌疾病治療的研究逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)[4],將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs)移植到卵巢早衰大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)可緩解順鉑引發(fā)的顆粒細(xì)胞凋亡;另外,研究將經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞(Menstrual blood mesenchymal stem cells,MenSCs)移植到Asherman綜合征大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)在移植后可增強(qiáng)血管生成因子和抗炎性因子的分泌,提高Asherman綜合征大鼠的妊娠率以及產(chǎn)仔率[5]。MenSCs是從育齡女性的經(jīng)血中提取出的,易于收集,來源豐富,其免疫原性與炎性反應(yīng)較低,顯著優(yōu)于其他類干細(xì)胞,同時(shí)還具有較高的組織容受性,增殖及自我更新能力較好,還可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)[7],MenSCs在特定條件下還可分化為卵巢顆粒樣細(xì)胞并具有該細(xì)胞的相關(guān)功能,具有修復(fù)損傷卵巢組織并促進(jìn)再生的作用。另外,熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)也參與PCOS的產(chǎn)生與發(fā)展,并在其中發(fā)揮著重要的作用。HSP90隸屬于HSP家族,具有分子伴侶等多種功能,參與免疫調(diào)控、抗細(xì)胞凋亡等過程。研究顯示[8],PCOS是由于機(jī)體處于長期應(yīng)激或卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞/顆粒細(xì)胞不正常凋亡所致,而這兩種狀態(tài)均有HSP的參與。目前有關(guān)運(yùn)用MenSCs治療PCOS的相關(guān)文獻(xiàn)較少,具體的治療機(jī)制尚未完全掌握。因此,本文通過構(gòu)建PCOS動(dòng)物模型,研究MenSCs移植對PCOS大鼠HSP90表達(dá)、卵巢損傷修復(fù)及生殖系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康SPF級SD雌性大鼠40只,體質(zhì)量200～300 g,由長沙市海天勤公司提供[生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)-2019-0014]。大鼠于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)室保持整潔、通風(fēng),維持晝夜規(guī)律,室溫在20～22 ℃,相對濕度在55%左右,每個(gè)鼠籠中飼養(yǎng)5只大鼠,鼠籠中保持充足的飲用水及營養(yǎng)飼料,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號:19081123)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 FSH、LH、LH試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)公司),PPARG1、NCOR1、HDAC3引物序列(上海齊源生物公司),來曲唑(上海滬崢生物科技有限公司,貨號:Hhzy-2885),羥甲基纖維素鈉(武漢榮燦生物科技有限公司,貨號:9085-26-1),PCR儀(北京福意電器公司,型號:431L),HSP90一抗(中國,碧云天生物公司),辣根過氧化物酶二抗(北京博爾西科技公司)。

1.3 細(xì)胞來源及培養(yǎng) MenSCs細(xì)胞株由杭州易文賽生物技術(shù)有限公司提供。將MenSCs細(xì)胞放入含有10%胎牛學(xué)清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)傳代,取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。顯微鏡下觀察MenSCs呈梭狀,成旋渦狀排列,貼壁生長,具有典型的MSCs的細(xì)胞特征(圖1)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測了其表面分子標(biāo)志物,顯示在該細(xì)胞中存在CD29、CD73、CD90、CD105的表達(dá),不表達(dá)CD34、CD45、CD117和HLA-DR,符合國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)建議的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 MenSCs細(xì)胞形態(tài)

1.4 模型建立及分組 40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字方法分為健康組、模型組、治療組及對照組,每組10只。除健康組外,剩余30只大鼠均建立PCOS模型[9]:給予1 mg·kg-1·d-1來曲唑(溶于0.5%羥甲基纖維素鈉1 mL)灌胃,高脂飼料喂養(yǎng),直至出現(xiàn)多囊卵巢樣改變以及高表達(dá)的睪酮(testosterone,T)提示建模成功。10只PCOS模型大鼠為模型組;10只PCOS模型大鼠于大鼠尾部靜脈注射200 μL(5×107個(gè)/mL)MenSCs懸液[10],共飼養(yǎng)2周為治療組;10只PCOS模型大鼠予二甲雙胍20 mg·kg-1·d-1灌胃,共飼養(yǎng)2周為對照組。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 ELISA檢測性激素水平 取4組大鼠外周血2 mL,離心5 min,1 250 r/min,后取血清。ELISA試劑盒檢測促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinising hormone,LH)、睪酮(T),實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 陰道涂片觀察動(dòng)情周期 每日上午8:00時(shí)用棉簽將大鼠陰道口處贓物擦凈,運(yùn)用無菌柔軟的習(xí)慣吸取0.5 mL的生理鹽水放于陰道口0.5 cm處進(jìn)行吹打,并沖洗,吸出沖洗液,離心1 min,3000 r/min,吸取50 μL液體放入載玻片上,涂勻后晾干。4%PFA滴至涂片上固定標(biāo)本 30 min。 PBS 浸泡,搖床振動(dòng),清洗后涂在載玻片上,吉姆薩染色,沖洗后光鏡下觀察,根據(jù)細(xì)胞種類、形態(tài)判斷動(dòng)情周期。動(dòng)情前期:有大量核上皮細(xì)胞,圓形深染;動(dòng)情期:大量角化細(xì)胞,無核片狀;動(dòng)情后期:可見上皮細(xì)胞,角化細(xì)胞,白細(xì)胞,各占三分之一;動(dòng)情間期:有大量白細(xì)胞。見圖2。

圖2 健康大鼠與模型大鼠陰道涂片

1.5.3 RT-PCR檢測生殖功能相關(guān)指標(biāo)PPARG1、NCOR1、HDAC3 mRNA表達(dá)水平 取4組大鼠卵巢組織,剪碎、研磨、離心后,Trizol提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,36個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。以U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.4 HE染色觀察卵巢病理形態(tài)并計(jì)數(shù) 取4組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死,取卵巢組織,手術(shù)刀剪成小塊,甲醛固定,沖洗1 h,脫水,浸蠟,包埋,切5 μm片,HE染色后中性樹膠封固,光鏡下觀察卵巢組織病理學(xué)形態(tài)并計(jì)數(shù)卵泡數(shù)。

1.5.5 免疫印跡檢測HSP90 取4組大鼠卵巢組織剪碎后研磨,裂解液裂解,冰浴中靜置20 min后,離心取上清,BCA測定蛋白濃度,電泳儀電泳,后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜終止后,PBS沖洗5 min,用麗春紅染膜,觀察轉(zhuǎn)膜效果,然后用PBS將麗春紅沖洗干凈,用封閉液封閉1.5 h,按照一定比例稀釋一抗,加入稀釋的HSP90(1∶500)一抗,孵育過夜,PBS清洗,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶2000),孵育1 h后清洗,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光顯影3 min,計(jì)算HSP90蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 MenSCs對4組大鼠動(dòng)情周期的影響 健康組大鼠動(dòng)情周期穩(wěn)定;與健康組相比,模型組大鼠動(dòng)情周期無規(guī)律,動(dòng)情前期、動(dòng)情間期時(shí)間延長,動(dòng)情期時(shí)間縮短(P<0.05);與模型組相比,治療組與對照組小鼠動(dòng)情周期數(shù)、動(dòng)情期時(shí)間增加,間期時(shí)間減少,周期相對規(guī)律(P<0.05);治療組與對照組動(dòng)情周期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 MenSCs對4組大鼠動(dòng)情周期的影響

2.2 MenSCs對4組大鼠性激素水平的影響 與健康組相比,模型組FSH降低、LH與T升高(P<0.05);與模型組相比,治療組FSH升高、LH與T降低(P<0.05);治療組與對照組FSH、LH、T水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 4組大鼠性激素水平比較

2.3 MenSCs對4組大鼠生殖功能相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響 與健康組相比,模型組PPARG1 mRNA降低,NCOR1 mRNA 、HDAC3 mRNA升高(P<0.05);與模型組相比,治療組PPARG1 mRNA升高,NCOR1 mRNA 、HDAC3 mRNA降低(P<0.05);治療組與對照組各指標(biāo)mRNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

表4 4組大鼠生殖功能相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)比較

2.4 MenSCs對4組大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響 健康組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)紊亂,可見較多閉鎖壞死卵泡、較多卵泡囊性擴(kuò)張、 顆粒細(xì)胞疏松且層數(shù)減少、成熟卵泡內(nèi)未見卵母細(xì)胞、放射冠消失,發(fā)育期卵泡與黃體數(shù)量明顯減少;與模型組相比,治療組與對照組大鼠卵巢組織有所改善,見圖3。與健康組相比,模型組原始卵泡、生長卵泡數(shù)量減少,閉鎖卵泡數(shù)量增加(P<0.05);與模型組相比,治療組與對照組生長卵泡數(shù)量增加、閉鎖卵泡數(shù)量減少(P<0.05);治療組與對照組生長原始卵泡數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5。

表5 4組不同時(shí)期卵泡數(shù)比較個(gè))

圖3 MenSCs對4組大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響

2.5 4組大鼠卵巢組織HSP90蛋白表達(dá)的影響 健康組、模型組、治療組及對照組的HSP90蛋白表達(dá)水平分別為(1.52±0.25)、(0.26±0.03)、(0.85±0.11)及(0.87±0.10)。與健康組相比,模型組HSP90蛋白表達(dá)降低(t=20.450,P<0.001);與模型組相比,治療組HSP90蛋白表達(dá)升高(t=25.330,P<0.001);治療組與對照組HSP90蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.595,P=0.559),見圖4。

圖4 MenSCs對4組大鼠卵巢組織HSP90蛋白表達(dá)的影響

3 討論

應(yīng)激狀態(tài)通過激活HSP90影響性激素平衡,使得卵泡發(fā)育失常,導(dǎo)致多囊卵巢發(fā)生[11]。HSP90主要定位于卵巢的顆粒細(xì)胞中,在閉鎖的卵泡中顯著減少[12-13]。LH通過刺激卵泡膜增加雄激素含量,阻滯卵泡成熟,未成熟的卵泡會(huì)分泌雌二醇并轉(zhuǎn)化為雌酮,此時(shí)機(jī)體雌酮為異常高表達(dá),促進(jìn)LH分泌,形成惡性循環(huán),使FSH水平降低,從而發(fā)展為多囊卵巢的癥狀[14]。本研究結(jié)果顯示,PCOS大鼠無明顯動(dòng)情周期,且促黃體酮生成素、睪酮水平增加,呈現(xiàn)多囊卵巢樣病變,同時(shí)HSP90水平下降,與吳庚香等[15]報(bào)道一致。MenSCs細(xì)胞具有較低的免疫原性,可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除而不引起免疫應(yīng)答,是MenSCs細(xì)胞成為臨床細(xì)胞治療強(qiáng)有力的候選者的原因之一[16]。與其他多種干細(xì)胞相比,MenSCs細(xì)胞具有增殖快等特點(diǎn),異體移植成功率高,當(dāng)MenSCs細(xì)胞移植于機(jī)體內(nèi)后,通過“歸巢”方式修復(fù)損傷卵巢[17-19]。有研究[20]顯示,MenSCs可能只在PCOS特殊病理?xiàng)l件下起作用,通過這種環(huán)境里的某種機(jī)制增加了PCOS大鼠芳香化酶的產(chǎn)生,進(jìn)而促使卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化量增加。目前已有研究證實(shí)[9]二甲雙胍對PCOS的治療效果顯著,因此本研究運(yùn)用二甲雙胍作為對照組,證實(shí)移植MenSCs后對PCOS的治療效果。在本研究中,與模型組相比,移植MenSCs細(xì)胞后治療組FSH、LH、T水平有所改善、多囊狀擴(kuò)張的卵泡減少,這提示干細(xì)胞移植對PCOS大鼠有明顯的治療效果,這與劉榮華[10]研究一致。治療組與對照組FSH、LH、T水平比較無差異,說明移植MenSCs與運(yùn)用二甲雙胍干預(yù)PCOS的治療結(jié)果相接近。

為研究MenSCs細(xì)胞對HSP90的作用,本研究認(rèn)為MenSCs細(xì)胞通過升高HSP90表達(dá),改善性激素水平,從而達(dá)到治療PCOS大鼠的作用。PPARG1參與機(jī)體糖脂代謝、細(xì)胞生物學(xué)行為等過程,影響PCOS等多種疾病的產(chǎn)生[21]。PPARG1在維持卵巢功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)上具有重要作用,參與顆粒細(xì)胞的增殖、分化以及卵巢組織的重塑等[22]。研究發(fā)現(xiàn)[23],PPARG激動(dòng)劑可有效改善PCOS患者的高雄癥及排卵障礙,提示PPARG1在PCOS患者體內(nèi)低表達(dá),對卵巢卵泡發(fā)育中具有重要作用。PPARG1是一種轉(zhuǎn)錄因子,其需要與多種調(diào)節(jié)因子相互作用,共同完成轉(zhuǎn)錄作用,NCOR1和HDAC3是其中兩個(gè)最重要的共抑制子[24]。NCOR1通過接受核受體的招募發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,可與HDAC3穩(wěn)定結(jié)合后成為HDAC3的激活亞單位,參與機(jī)體生殖發(fā)育全過程[25]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠體內(nèi)PPARG1降低,NCOR1、HDAC3升高,在經(jīng)過MenSCs治療后PPARG1升高,NCOR1、HDAC3降低,且與對照組較為接近。陳夏涼[26]研究顯示,在PCOS大鼠體內(nèi)通過改善性激素水平,可促進(jìn)PPARG1升高及NCOR1、HDAC3降低,從而達(dá)到對PCOS大鼠的治療作用。本文研究與上述研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

移植MenSCs細(xì)胞后可改善PCOS大鼠的生殖功能及卵巢功能,可能通過上調(diào)HSP90表達(dá)影響性激素水平從而改善卵巢損傷。