慢痞消組方中藥對嗜黏蛋白阿克曼菌、大腸桿菌和糞腸球菌的增殖影響及藥效規(guī)律初探

王 鈺，褚福浩，程思怡，柯凱樂，鄭 直，丁 霞

（北京中醫(yī)藥大學，北京 102488）

我國慢性胃炎、胃癌均呈高發(fā)態(tài)勢[1]。CORREA P[2]提出的腸型胃癌的級聯(lián)反應模式中胃癌前病變是降低胃癌發(fā)生率的關鍵階段[3]。國醫(yī)大師路志正提出調氣養(yǎng)陰、活血解毒的核心治法，根據(jù)其臨床經(jīng)驗研發(fā)的慢痞消有效阻斷慢性胃炎炎癌轉化，緩解患者臨床癥狀[4-5]。前期研究證實慢痞消能有效改善大鼠胃黏膜病理損傷，改善胃黏膜炎癥狀態(tài)，恢復胃酸分泌功能，降低其血清中炎癥因子水平[6]。

胃癌及胃癌前疾病與腸道菌群關系密切，致病菌和益生菌失調能影響宿主遠端器官機能。胃癌患者糞便菌群和腸黏膜菌群的組成與健康個體存在顯著差異，益生菌比例降低[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)慢性胃炎炎癌轉化不同階段模型大鼠的腸道菌群的豐度、多樣性和組成存在顯著差異[8]。其中特征性菌群中的糞腸球菌（enterococcus faecalis，E.fa）可誘導胃上皮細胞產生活性氧 ，引起胃癌相關的DNA 損傷和炎癥反應[9]；大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）可產生大腸桿菌素和細胞致死性膨脹毒素，損傷細胞DNA，引起基因組不穩(wěn)定，促進胃癌前病變的形成[10]；“新一代益生菌”嗜黏蛋白阿克曼菌（akkermansia muciniphila，Akk）可分解黏蛋白，會釋放營養(yǎng)物質，影響腸道菌群結構及代謝功能，抑制炎癥反應[11]。

本研究通過比濁法探究慢痞消組方中各味中藥對益生菌Akk 和條件致病菌E.coli 和E.fa 的增殖影響，通過聚類分析各味中藥調控菌群的藥效作用特點，為從調節(jié)腸道菌群平衡的角度探究慢痞消治療胃癌前病變的藥效物質基礎及作用機制研究提供參考。

1 材料與試劑

1.1 儀器與設備 旋轉蒸發(fā)儀，迪圖生物科技有限公司，型號：N-1300V-W。多功能酶標儀，帝肯貿易有限公司，型號：Infinite 200 pro。測序儀，Applied Biosystems，型號SeqStudio。梯度 PCR 儀，BIO-RAD，型號：T100。基因擴增儀，美國Bio-Rad，型號：TC-96/G/H（b）B。多功能成像系統(tǒng)，美國GE，型號：AI680。

1.2 試劑與耗材 試劑：革蘭氏染色液試劑盒，海博，型號：HB8278；腦心浸出液肉湯（BHI），海博，型號：HB8297-1，均購自北京拜爾迪生物技術有限公司。細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司，型號：DP302。TaKaRaTaq?Vers，Takara，型號：R004A，均購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術研究中心。中藥飲片：香櫞購自亳州市永剛飲片廠。丹參、炙甘草均購自北京市雙橋燕京中藥飲片廠。生白術、玫瑰花、玉竹、醋延胡索、砂仁、烏梅、白花蛇舌草、太子參、紫蘇梗均購自北京本草方源藥業(yè)集團有限公司。菌株：Akk 菌株、E.coli 菌株、E.fa 菌株均購自北納生物科技有限公司。

2 方法

2.1 慢痞消各味中藥提取液的制備 稱量12 味中藥各100 g，分別加入1 000 mL蒸餾水浸泡30 min，煎煮1.5 h，用200目濾布過濾，藥渣重復煎煮過濾，合并2次濾液，5 000 rpm 離心10 min，取上清液減壓濃縮冷凍干燥。

2.2 菌株培養(yǎng)、鏡檢并繪制生長曲線 用平板四區(qū)劃線法將3 種菌培養(yǎng)，次日接種于液體培養(yǎng)基，250 rpm 37℃恒溫搖床過夜。再取菌液接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。取菌液和50%甘油按照1:1 混合凍存。將三株菌液分別接種于6 孔板中，設置實驗組和培養(yǎng)基對照組，從0 h 開始每隔2 h 測定2 組OD 600 nm 值，繪制生長曲線。按照革蘭氏染色試劑盒說明書步驟對菌株進行染色觀察。

2.3 細菌基因測序鑒定 按照天根細菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取3 種菌基因組。DNA 片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，120 V 恒壓于電泳液30 min，紫外成像觀察。用PCR 擴增試劑盒進行目的基因擴增，細菌16 s rRNA 基因的前/后引物由通用生物進行合成，序列5’to3’：27F 和1492R，產物大小1 500 bp。將提取的DNA 放入PCR 擴增儀中擴增反應，預熱98℃2 min；循環(huán)98 ℃10 s；49 ℃30 s；72 ℃60 s 共30 個；最終延伸72℃5 min 并測序分析。PCR 產物電泳檢測，100 V 恒壓于電泳液40 min，紫外成像觀察。PCR 擴增產物進行雙向測序并拼接結果，登錄NCBI進行BLAST-N 比對序列相似度。

2.4 比濁法檢測慢痞消各味中藥對三株菌的增殖影響 將各濃度中藥藥液、菌液和液體培養(yǎng)基混合均勻接種于96 孔板中，12 味中藥凍干粉稀釋成2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg/mL 共7 個濃度。設置實驗組、菌液對照組（無藥液）和培養(yǎng)基空白對照組。培養(yǎng)后600 nm 下測定各組OD 值。

2.5 數(shù)據(jù)分析及慢痞消各味中藥對三株菌調節(jié)作用的藥效規(guī)律分析 實驗數(shù)據(jù)均用Graph Pad Prism 9.5.1 統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均為3 次獨立實驗結果，各組統(tǒng)計結果用均數(shù)±標準差（±s）描述表示。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。選擇1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL 各味中藥對三株菌的增殖結果進行聚類分析。

3 結果

3.1 鏡檢結果 Akk復活4 d平板菌層明顯，菌落典型，菌落0.5 ～1 mm，圓形邊緣不整齊，不透明，灰白色，中間凸起，表面光滑；E.coli 復活18 ～24 h 平板菌層明顯，菌落典型，菌落2 ～4 mm，圓形邊緣整齊，不透明，淡黃色，中間凸起，表面明亮光滑；E.fa 復活24 h 平板菌層明顯，菌落典型，菌落1 ～2 mm，圓形邊緣整齊，不透明，灰白色，中間凸起，表面明亮光滑。三株菌質地濕潤易挑起，復活性均良好。染色后Akk和E.coli 呈紅色，為革蘭氏陰性菌，E.fa 呈藍色，為革蘭氏陽性菌。

3.2 生長曲線 Akk、E.coli 和E.fa 分別在48、4 和2 h 進入對數(shù)期，96、8 和8 h 達到平臺期，故后續(xù)實驗分別培養(yǎng)48、6 和4 h，見表1。

3.3 鑒定結果 三株菌分別經(jīng)DNA提取、凝膠電泳（圖1A）、基因擴增、凝膠電泳（圖1B）和測序分析，序列比對一致性分別達99.14%、100%、99.58%，分別鑒定為Akk、E.coli 和E.fa 菌株無誤。

3.4 慢痞消各味中藥促進Akk 的增殖、抑制E.coli 和E.fa 的增殖 選0.625、0.313、0.156 mg/mL 中藥對各菌增殖OD值進行分析發(fā)現(xiàn)，白術、丹參、炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子參、玉竹等中藥能明顯促進Akk增殖（表2）；白術、丹參、玫瑰花、烏梅、香櫞、玉竹、紫蘇梗等中藥能明顯抑制E.coli 增殖（表3）；炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子參、烏梅、香櫞、玉竹、紫蘇梗等中藥能明顯抑制E.fa 增殖（表4），并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。3.5 聚類分析結果 慢痞消各味中藥對三株菌的調節(jié)作用被聚為三類（如圖2）：1）紫蘇梗、香櫞、醋延胡索、白花蛇舌草、玫瑰花、丹參、砂仁，有理氣活血、祛瘀解毒的祛邪作用；2）玉竹、太子參、甘草、烏梅，有益氣和中、養(yǎng)陰生津的扶正作用；3）白術有補氣燥濕和中，即扶正祛邪作用。

圖2 慢痞消各味中藥對三株菌的增殖水平聚類分析

注：A.細菌基因提取電泳檢測圖；B.PCR 產物電泳圖，1-10.菌株

表2 慢痞消各味中藥作用嗜黏蛋白阿克曼菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表3 慢痞消各味中藥作用大腸桿菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表4 慢痞消各味中藥作用糞腸球菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

4 討論

慢痞消中太子參水煎液可通過提高有益菌豐度、顯著降低有害菌豐度治療脾虛型大鼠[12]。丹參提取物通過影響擬桿菌酶、厚壁菌門豐度緩解小鼠E.coli 感染[13]。玉竹多糖促進乳桿菌生長，抑制E.coli 生長[14]。白術多糖能緩解腹瀉，增加大鼠有益菌豐度，降低有害菌豐度[15]。中、低劑量烏梅水煎液顯著上調因抗生素而失調的菌群中乳桿菌屬和糞桿菌屬的相對豐度[16]。砂仁水煎液亦能恢復腸道菌群失調[17]。甘草水提物能增加BALB/c 小鼠糞便菌群中厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門和變形菌門豐度[18]。本研究結果進一步顯示：慢痞消中白術等能明顯促進Akk 增殖。烏梅等能明顯抑制E.coli 和E.fa 增殖，經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)與其扶正祛邪藥效之間存在一定相關性。

中藥及復方口服后經(jīng)消化道腸道菌群的生物轉化，吸收入血發(fā)揮藥效作用。基于中醫(yī)整體觀思想調控腸道菌群平衡探究中藥及復方的藥效物質基礎，值得深入研究以揭示其科學內涵。