基于QuEChERS樣品前處理的間接競爭酶聯免疫分析法快速檢測薏苡仁中黃曲霉毒素B1

張磊，關凱儀，黃雨心，王淑美

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東省中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物[1]。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）的毒性最強，屬于I 類致癌物（international agency for research on cancer,1993 年）。AFB1對肝臟有明顯損傷作用[2]，能誘發原發性肝癌，還具有致畸性及致突變性[3-4]。鑒于AFB1的危害性，2020年版《中國藥典》規定部分易污染中藥材中AFB1不得超過5 μg/kg，薏苡仁是當中的藥材之一。

薏苡仁是禾本科植物薏米Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁，廣泛分布于熱帶和溫帶地區[5]，在我國主產于貴州[6]。薏苡仁富含淀粉、蛋白質、多糖、脂質、多酚、植物甾醇等物質[7]，具有較好的藥用和食用價值。薏苡仁具有抗炎[8]、降糖[9]、調節免疫[10]、抗癌[11]等作用，常用于治療水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、贅疣、癌腫；此外，作為食品，薏苡仁已有數千年的應用歷史，其營養成分高于大多數谷物，除特有成分外，薏苡仁中的蛋白質、碳水化合物和脂質的比例高于大米、玉米和小麥[5，12-14]，但豐富的營養物質也為霉菌生長提供了物質基礎。

目前，國內外常采用高效液相色譜法[15-17]、液相色譜-串聯質譜法等[18-20]檢測中藥中的真菌毒素。相對于這些大型精密儀器檢測方法，間接競爭酶聯免疫分析方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA）是高通量快速檢測真菌毒素的有效手段，然而在中藥檢測的應用中常面臨復雜基質干擾的挑戰，仍需要相對復雜的樣品前處理過程或繁瑣的陰性樣品校正來降低基質的影響[21]。Liu等[22]的研究表明，薏苡仁中的基質成分對免疫分析存在較大干擾，無法采用溶劑標準曲線進行定量分析，需要用基質匹配的標準曲線進行校準。本課題組前期研究發現，ic-ELISA 檢測薏苡仁中真菌毒素的基質效應可能與薏苡仁中的極性成分有關，因此如何去除薏苡仁基質中的這部分干擾成分，是提高檢測準確度的關鍵。QuEChERS 是一種適合大量樣品的快速前處理技術，2003 年被提出[23]，因其具有快速（quick）、簡單（easy）、經濟（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）和安全（safe）等特點，被縮寫為“QuEChERS”。QuEChERS法通常在提取樣品時加入鹽，通過鹽析作用降低真菌毒素在水相中的溶解度，增大有機相中待測物的含量，并促進水相和有機相的分離，從而可通過離心除去溶于水的雜質。與傳統的液-液萃取或免疫親和柱凈化相比，QuEChERS 具有更簡便、快捷以及低成本等多種優勢。

本研究著重探究簡便且能消除薏苡仁基質干擾的樣品前處理方法，在課題組前期研究基礎上，較系統地優化了稀釋溶劑和稀釋方式對ic-ELISA的影響，并進一步對比了簡單稀釋法和QuEChERS技術對消除基質效應的效果，旨在開發一種簡便、快速、準確且能抗基質干擾的ic-ELISA 用于薏苡仁中AFB1的快速檢測。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spark 酶標儀購于tecan（上海）貿易有限公司；電子天平（ME104）購于梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；MB100-4A 微孔板恒溫振蕩器購于杭州奧盛儀器有限公司；DHM-200 多管渦旋振蕩器購于美博實驗儀器（廣州）有限公司；H1650-W 離心機購于湖南湘儀科學儀器設備有限公司；Agilent 1290-6470 液相色譜儀-串聯質譜儀（liquid chromatography/tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）購于安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 試劑與材料

AFB1單克隆抗體和AFB1-BSA 抗原均購于深圳安提生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（IgG-HRP）購于南寧市藍光生物技術有限公司；3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）單組分顯色液購于合肥巴斯夫生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對照品購于Pribolab 公司（新加坡）；甲醇（質譜級）、甲酸（質譜級）、乙酸銨均購于廣州蘇鋮粵貿易有限公司；其他試劑均為分析級試劑，購于天津市致遠化學試劑有限公司。實驗用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS,pH 7.4）、洗滌液（PBST）和包被液（50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）均參照課題組前期研究中的方法進行配制[24]。122 批薏苡仁（Cocis Semen）和即食薏苡仁粉樣品隨機購于藥店、超市和電商，編號為S1－S122、粉碎、密封放置于-20 ℃冰箱中保存，其中樣品S101-S122為即食薏苡仁粉。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 簡單稀釋法 稱取薏苡仁樣品1 g，加入80%（體積分數，下同）乙腈5 mL，渦旋3 min 后于10 000 r/min 離心5 min，取適量上清液用稀釋溶劑稀釋20倍后再于10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

2.1.2 QuEChERS 凈化法 稱取薏苡仁樣品1 g，加入80%乙腈5 mL，渦旋3 min后立即加入硫酸鎂1 g和乙酸鈉0.25 g[25]，渦旋1 min 后于10 000 r/min 離心5 min，取上清液用PBS稀釋20倍，于10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

2.2 ic-ELISA檢測過程

在96 孔酶標板上加入100 μL 用包被液稀釋的AFB1-BSA 溶液，于4 ℃過夜孵育。用洗板液洗滌3次后拍干，加入200 μL 封閉液，于37 ℃孵育2 h，用洗板液洗滌2 次后拍干，然后依次加入50 μL AFB1對照品溶液或樣品稀釋溶液，再加入50 μL 稀釋后的抗體溶液，于37 ℃孵育1 h，用洗板液洗滌3 次后拍干，加入100 μL IgG-HRP，于37 ℃孵育1 h，用洗板液洗滌4次后拍干。加入TMB顯色液100 μL，室溫顯色10 min 后加入1 mol/L 鹽酸終止液50 μL，于酶標儀450 nm處測定吸光度值。

2.3 LC-MS/MS檢測條件

采用的LC-MS/MS 檢測方法在Wu[26]等報道的方法基礎上略有修改。色譜條件：色譜柱為Waters CORTECSTM UPLC C18（100 mm×2.1 mm×1.6 μm）；流動相：水（0.1%甲酸+1 mmol/L 乙酸銨）為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0~2 min，10%B；2~8 min，90%B；8~8.1 min，10%B；8.1~11 min，10%B）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），離子源溫度：150 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，多反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描。質譜參數見表1。

表1 質譜條件參數Table 1 Mass spectrometry condition parameters

3 結果與討論

3.1 抗原、抗體濃度的優化

采用棋盤滴定法對抗原和抗體濃度進行優化，以達到最佳的檢測靈敏度。本研究分別選擇了5個不同的抗原、抗體濃度進行優化，結果見表2。可見，當抗原質量濃度為0.062 5 μg/mL，抗體質量濃度為0.125 μg/mL；抗原質量濃度為0.031 25 μg/mL，抗體質量濃度為0.25 μg/mL時，吸光度值接近于1.0。采用這兩組抗原、抗體條件繪制抑制曲線，結果如圖1所示。可見，兩組抗原、抗體條件的半數抑制濃度（half inhibitory concentration,IC50）相同，從低濃度AFB1的檢測靈敏度和檢測成本考慮，選擇抗原濃度為0.062 5 μg/mL，抗體濃度為0.125 μg/mL進行后續研究。

圖1 不同抗原、抗體條件的抑制曲線Figure 1 Inhibition curves of different antigen-antibody conditions

表2 不同AFB1抗原、抗體濃度條件下的吸光度值Table 2 Absorbance values for different AFB1 antigen and antibody concentrations

3.2 提取溶劑的選擇

通過查閱文獻發現，乙腈-水體系和甲醇-水體系常用于提取AFB1[27-28]，此外，以乙腈作為提取溶劑可以減少脂溶性雜質溶出[29]。因此，參考課題組前期研究結果[30]，選取80%乙腈作為提取溶劑。

3.3 簡單稀釋法的優化

本研究考察了不同稀釋溶劑種類和稀釋方式（一步稀釋法和二步稀釋法）對ic-ELISA 顯色值和靈敏度的影響。一步稀釋法對比了水、PBS、10%甲醇水、10%甲醇PBS，4 種具有代表性的溶劑；二步稀釋法考察了PBS 和10%甲醇水的不同組合，即先用10%甲醇水稀釋2 倍，混勻后用PBS 稀釋10 倍和先用PBS 稀釋2 倍、混勻后再用10%甲醇水稀釋10倍。如圖2 所示，簡單稀釋法能夠消除基質對檢測靈敏度的影響，但無法解決基質對檢測顯色值的抑制問題。

基于上述結果，本研究考察了應用QuEChERS技術進行樣品前處理的效果。QuEChERS 凈化過程參見“2.1”，樣品首先用80%乙腈渦旋提取3 min，然后加入無水硫酸鎂-乙酸鈉（體積比4∶1）繼續渦旋1 min，經離心后，AFB1轉移到有機相中，而基質中的極性成分則保留在水層，從而消除樣品基質中極性成分的干擾。基于QuEChERS 技術凈化提取液后的稀釋溶劑優化結果見圖3，當稀釋溶劑為PBS 時，BX0/B0和IX0/I0分別為1.05、0.99，均相對最接近于1.0，表明該條件下基質干擾最小。因此，后續研究采用QuEChERS 技術凈化提取液，然后采用PBS 進行稀釋。此外，綜合課題組前期研究結果[30]可進一步說明，利用QuEChERS 方法去除的極性物質，是干擾ic-ELISA顯色值的重要因素。

圖3 QuEChERS凈化法的稀釋方式優化Figure 3 Optimization of dilution mode based on purification by QuEChERS technology

3.4 方法學考察

3.4.1 線性與范圍 按“2.1.2”項下制備陰性薏苡仁樣品溶液。以陰性樣品溶液和溶劑分別配制質量濃度為4、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.003 9、0.001、0 ng/mL 的AFB1對照品溶液，并按照“2.2”項下進行檢測。以抑制率（不同濃度AFB1的吸光度值和0 ng/mL AFB1吸光度值的比值）為縱坐標，AFB1對照品溶液的質量濃度對數為橫坐標，采用Logistic 4P 模型進行擬合，繪制溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，結果見圖4和表3。

圖4 溶劑和基質匹配標準曲線Figure 4 Solvent and matrix-matched standard curves

表3 標準曲線參數Table 3 Parameters of the standard curve

3.4.2 基質效應評價 基質效應（matrix effect,ME）常采用基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比值（ME=B/A×100%，其中A 為溶劑標準曲線的線性方程斜率，B 為基質匹配標準曲線的線性方程斜率）進行評價[31-32]。但實際研究中發現，除標準曲線的斜率比值符合要求外，還需要關注陰性樣品溶液與空白溶劑顯色值之間的差異，二者差異越小，越有利于提高檢測的準確度。

由表3的結果計算可得，ME=101%，此外，陰性樣品溶液與空白溶劑的吸光度值比值為0.98，基質效應在可接受范圍內[33]，可用溶劑標準曲線代替基質匹配標準曲線進行定量分析。

3.4.3 特異性 方法的特異性通過檢測AFB1與其結構類似物之間的交叉反應進行評價。AFB1類似物的交叉反應率計算公式為：

結果表明，AFB1與AFB2、AFG1、AFG2的交叉反應率分別為67.3%、1.5%、1.3%，在實際檢測過程中，當自然污染的樣品中存在AFB2時，所建立的方法可能會產生一定的正偏差。

3.4.4 準確度與精密度 根據薏苡仁中AFB1的限量標準（5 μg/kg）和可定量的檢測范圍，在陰性薏苡仁樣品中添加低（2.5 μg/kg）、中（5 μg/kg）、高（10 μg/kg）3 個濃度水平的AFB1對照品溶液考察方法準確度。加標樣品經提取和稀釋后按“2.2”項下進行檢測，結果見表4。可見，方法的加標回收率為75.12%~84.46%，RSD小于6%；平行稱取6份陰性薏苡仁樣品以5 μg/kg 添加水平進行加標，加標樣品經提取和稀釋后按“2.2”項下進行檢測，檢測結果的RSD為3.6%。表明方法的準確度和精密度可滿足檢測需求[21]。

表4 準確度考察結果Table 4 The results of accuracy(n=3)

3.4.5 檢測限和定量限 檢測限（limit of detection,LOD）為ELISA 產生10%抑制率時對應的分析物濃度；定量限（limit of quantification,LOQ）為ELISA產生20%抑制率時對應的分析物濃度。本研究建立的ic-ELISA 測定薏苡仁中AFB1的檢測限和定量限分別為0.49、1.37 μg/kg。

3.5 實際樣品檢測

采用建立的ic-ELISA對122批薏苡仁及即食薏苡仁粉中的AFB1污染狀況進行測定。當樣品中AFB1含量大于檢測限則判定為陽性樣品，共檢出25批陽性樣品，陽性率為20.5%，污染水平為1.76~27.56 μg/kg，陽性樣品的超標率為24.0%。值得關注的是，超標的6 批樣品中，除1 批次污染水平為8.34 μg/kg外，其余5批樣品的污染水平是限量標準（5 μg/kg）的2.7~5.5 倍，提示有必要在薏苡仁的采收、加工、儲藏及流通等過程中采取一定的防控措施，降低污染的發生。

3.6 LC-MS/MS確證

用LC-MS/MS 對ic-ELISA 檢測的25 批陽性樣品進行檢測，以確證建立的ic-ELISA 的可靠性，陽性樣品代表性譜圖見圖5。對ic-ELISA 和LC-MS/MS 大于定量限的檢測結果進行相關性分析（圖6），相關系數（r）為0.98，表明建立的ic-ELISA能較準確的檢測薏苡仁中的AFB1。

圖5 對照品（A）和陽性樣品（B）的代表性LC-MS/MS譜圖Figure 5 The representative LC-MS/MS spectrums of reference substance(A)and positive sample(B)

圖6 LC-MS/MS 與ic-ELISA 測定陽性樣品中AFB1含量的相關性曲線Figure 6 Correlation curves for AFB1 in coix seed between the LC-MS/MS and the developed ic-ELISA

4 結論

本研究建立了適用于薏苡仁中AFB1高通量、快速篩查的ic-ELISA，方法靈敏可靠，且無需任何校正。經研究發現，在ic-ELISA檢測中，薏苡仁的基質效應與其基質中的極性成分密切相關，QuEChERS樣品前處理技術能夠去除薏苡仁樣品提取液中的水溶性雜質，從而改善樣品基質對顯色值的干擾。在所檢測的樣品中，AFB1的污染率超過20%，表明需要進一步加強薏苡仁或其相關產品的防霉變措施，提高薏苡仁的藥用或食用安全性。