熊果酸調控MAPK 通路對肢體缺血再灌注肝損傷大鼠的影響

楊小春，呂建，孫景毅，汪文月，王媛媛

（1.河北港口集團有限公司港口醫院消化科，河北 秦皇島 066000；2.河北港口集團有限公司港口醫院消化內鏡中心，河北 秦皇島 066000；3.河北省滄州市中心醫院腎病血液凈化科，河北 秦皇島 061000；4.河北港口集團有限公司港口醫院心內科，河北 秦皇島 066000；5.北京大學第三醫院秦皇島醫院消化科，河北 秦皇島 066000）

肢體缺血再灌注不僅會引起局部缺血組織損傷，而且也容易導致遠隔器官組織損傷，其中肝臟是易受累器官之一[1]。肢體缺血再灌注引起的遠隔組織器官損傷的機制十分復雜，目前多數學者認為氧化應激與其具有密切關系[2]。臨床研究表明，布托啡諾可通過抑制氧化應激反應有效減輕下肢骨科手術患者使用止血帶所造成的缺血再灌注損傷[3]。銀杏葉提取物注射液降低肢體缺血再灌注損傷患者氧化應激反應，從而改善缺血再灌注引起的肺損傷[4]。熊果酸，又名烏索酸，烏蘇酸，是存在于多種天然植物中的一種五環三萜類化合物，在心肌、肝臟等組織器官缺血再灌注損傷中的作用多有報道[5-6]。然而，熊果酸是否在肢體缺血再灌注引起的遠端器官損傷中發揮作用鮮有報道。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase pathway，MAPK）信號通路是重要的信號轉導通路，與多種生理病理過程有關，研究表明，重組人腦利鈉肽通過抑制p38 MAPK 通路降低氧化應激反應，具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[7]。此外，熊果酸通過抑制p38 MAPK 信號通路可抑制Huh-7 細胞增殖，誘導細胞凋亡[8]。因此，本研究探討熊果酸是否能通過調節p38 MAPK信號通路降低氧化應激反應和細胞凋亡，從而保護肢體缺血再灌注引起的肝損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD 大鼠50 只，8 周齡，體質量180~200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。飼養期間大鼠自由飲食飲水，室內溫度（22±2）℃，空氣濕度50%~60%，12 h明暗交替。該研究經本院實驗動物倫理委員會審批（2021111501）。

1.2 試劑和儀器

熊果酸（質量分數>98%）購自上海源葉生物科技有限公司（批號：B21403）；MAPK 信號通路激活劑茴香霉素（anisomycin）購自上海碧云天生物科技有限公司（批號：SC0132）；HE 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號：G1120）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：G002-1-2）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）以及乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自上海原鑫生物科技有限公司（批號：YX-SH-A0093、YX-SHCA092、YX-SH-A0144）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒購自上海科艾博生物科技有限公司（批號：CB10431-Hu、CB10643-Hu、CB10401-Hu）；兔抗鼠p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK 抗體購自美國Abcam公司（批號：ab211061、ab308333、ab192591、ab32537）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自美國ThermoFisher 公司（批號：31470）；AS-800 全自動生化分析儀購自南京頤蘭貝生物科技有限公司；1704150 型蛋白轉膜裝置購自美國Bio-Rad 公司；BX51 型光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 模型制備與分組給藥

將50 只雄性大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、模型組、熊果酸組、激活劑組和熊果酸+激活劑組，每組10 只。熊果酸組大鼠于造模前一周開始灌胃80 mg/kg[9]熊果酸混懸液（生理鹽水配制），1次/d，連續7 d；激活劑組大鼠于造模前一周腹腔注射anisomycin 2 mg/kg[10]，1 次/2 d，共注射3 次；熊果酸+激活劑組大鼠80 mg/kg 熊果酸混懸液灌胃，1 次/d，連續7 d，同時腹腔注射anisomycin 2 mg/kg，1次/2 d，共注射3次；模型組和正常對照組大鼠分別灌胃等容量的生理鹽水。于末次給藥2 h 后，建立肢體缺血再灌注肝損傷模型。除正常對照組外，其余組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，雙側后肢脫毛，根部環扎橡皮筋夾閉，阻斷血流4 h，當觀察到大鼠趾掌處顏色變蒼白，且皮溫發涼時模型制備成功[11]，之后松開橡皮筋持續灌注血流4 h，正常對照組大鼠僅在雙后肢根部掛繞橡皮筋，不阻斷血流。

1.4 ELISA法檢測肝損傷指標

再灌注完成后，頸椎脫臼法將大鼠處死，取腹腔靜脈血5 mL于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品。嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，計算ALT、AST和LDH含量。

1.5 氧化應激指標檢測

采血完成后，冰上迅速剝離大鼠肝組織，取適量組織置于EP 管中，加生理鹽水，剪碎，勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書測定組織中SOD、MDA和GSH-Px活性。

1.6 肝組織HE染色

取部分肝組織，置于4%（φ）多聚甲醛中固定，脫水，包埋，切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，伊紅染液染色，蘇木素染液染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.7 肝組織TUNEL染色

取石蠟切片，蛋白激酶K 工作液37 ℃孵育30 min，3%過氧化氫室溫孵育10 min，TdT 酶反應液37 ℃避光孵育60 min，HRP 標記的鏈霉親和素37 ℃避光孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察陽性細胞數，呈棕黃色顯示的即為陽性細胞，計算細胞凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.8 蛋白印跡法檢測MAPK信號通路相關蛋白表達

取適量肝組織，液氮中研磨，加裂解液裂解，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白電泳分離，將分離后的蛋白濕轉到PVDF 膜上，p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK 和ERK 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL法顯色，Image J分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學分析

采用SPSS26.0軟件分析數據，所有數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟損傷指標檢測結果

與正常對照組比較，模型組血漿中ALT、AST和LDH 含量升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組血漿中ALT、AST 和LDH 含量降低，而激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH 含量升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH含量升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH 含量降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血漿中ALT、AST和LDH含量比較Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

表1 各組大鼠血漿中ALT、AST和LDH含量比較Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.2 肝臟氧化應激指標檢測結果

與正常對照組比較，模型組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低，而激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比較Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

表2 各組大鼠肝組織中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比較Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.3 肝組織HE染色結果

正常對照組大鼠肝細胞形態大小正常；模型組和激活劑組大鼠部分區域肝細胞水腫、脂肪變性、片狀壞死，且伴有大量中性粒細胞浸潤，肝竇結構消失；熊果酸組大鼠肝組織病理損傷減輕，肝細胞輕度水腫，無片狀壞死，少量中性粒細胞浸潤；熊果酸+激活劑組大鼠肝組織病理損傷程度較激活劑組減輕，但是較熊果酸組加重。見圖1。

圖1 肝組織HE染色（400×）Figure 1 HE staining of liver tissue

2.4 肝組織TUNEL染色結果

與正常對照組比較，模型組肝細胞凋亡率升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝細胞凋亡率降低，激活劑組肝細胞凋亡率升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝細胞凋亡率升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝細胞凋亡率降低（P<0.05）。見表3、圖2。

圖2 肝組織TUNEL染色（400×）Figure 2 TUNEL staining of liver tissue（400×）

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡率比較Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.5 蛋白印跡法檢測結果

與正常對照組比較，模型組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達水平降低，激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見表4、圖3。

圖3 肝組織中蛋白表達電泳圖Figure 3 Electrophoretic image of protein expression in liver tissue

表4 各組大鼠肝組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

表4 各組大鼠肝組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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3 討論

本研究通過橡皮帶環繞結扎大鼠雙后肢建立肢體缺血再灌注肝損傷模型，肝組織病理染色結果顯示：模型組大鼠部分區域肝細胞水腫、脂肪變性、片狀壞死，且伴有大量中性粒細胞浸潤，肝竇結構消失，熊果酸組大鼠肝組織病理損傷減輕，肝細胞輕度水腫，輕度片狀壞死，少量中性粒細胞浸潤；且模型組大鼠肝損傷指標血漿中ALT、AST和LDH 水平均高于正常對照組，熊果酸組大鼠各指標則低于模型組，說明肢體缺血再灌注可引起大鼠肝損傷，而熊果酸對肝臟具有一定保護作用。而Xu 等[12]的研究表明，熊果酸可減輕缺血再灌注引起的心肌損傷，發揮心肌保護作用。為進一步探討熊果酸發揮肝臟保護作用的具體機制，本研究給予肢體缺血再灌注大鼠MAPK 信號通路激活劑，結果顯示：激活劑組大鼠肝臟病理損傷較模型組加重，血漿ALT、AST 和LDH 水平較模型組升高；而與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組大鼠肝組織病理損傷減輕，ALT、AST 和LDH 水平降低，說明激活MAPK 信號通路可加重肢體缺血再灌注大鼠肝損傷，而熊果酸可部分抵消激活劑的作用。

氧化應激反應和細胞凋亡是造成組織器官再灌注損傷的主要機制之一。Mei 等[13]研究表明薯蕷皂苷通過SIRT1/Nrf2 信號通路抑制氧化應激，減輕體內外腦缺血再灌注損傷。Yu 等[14]研究發現miR-98-5 p 通過抗氧化應激和抗凋亡減輕腦缺血再灌注損傷。本研究結果顯示：模型組大鼠肝細胞凋亡率較正常對照組升高，熊果酸組大鼠肝細胞凋亡率低于模型組；模型組抗氧化指標肝組織SOD 和GSHPx 活性較正常對照組降低，氧化指標肝組織MDA含量較正常對照組升高，而熊果酸組肝組織SOD 和GSH-Px 活性較模型組升高，MDA 含量較模型組降低，說明熊果酸可降低肢體缺血再灌注引起的氧化應激反應，抑制肝細胞凋亡。本研究結果與Di等[15]報道的熊果酸可降低氧化應激反應，改善順鉑造成的聽力功能障礙的結果一致。本研究中激活劑組肝細胞凋亡率較模型組升高，肝組織SOD 和GSH-Px活性較模型組降低，肝組織MDA 含量較模型組升高，說明激活MAPK 信號通路促進肝臟氧化應激反應和肝細胞凋亡；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝細胞凋亡率降低，肝組織SOD 和GSH-Px 活性升高，肝組織MDA 含量降低，說明熊果酸可拮抗激活劑對肢體缺血再灌注肝損傷大鼠氧化應激和細胞凋亡的促進作用。

氧化應激反應涉及多條信號轉導通路，其中MAPK 信號通路在維持機體內氧化-抗氧化動態平衡中發揮重要作用，p38 和ERK 是MAPK 家族中重要的2條通路。肢體缺血再灌注使遠端器官受到缺血刺激，打破機體氧化-抗氧化平衡，組織能量代謝紊亂，抗氧化能力減弱，大量自由基產生并堆積，從而激活p38和ERK通路[16-17]。p38通路與炎癥、氧化應激等反應過程的調控密切相關，而ERK 通路主要與細胞分裂、生長和增殖有關[18-19]。本研究結果表明：模型組肝組織中p-p38 和p-ERK 蛋白表達升高，熊果酸可降低二者磷酸化水平；激活劑組肝組織中p-p38 和p-ERK 蛋白表達水平較模型組升高，熊果酸+激活劑組二者水平降低，說明熊果酸可部分拮抗激活劑對MAPK 信號通路的激活作用。

綜上所述，熊果酸對肢體缺血再灌注引起的肝損傷具有保護作用，其可能是通過抑制MAPK 信號通路降低氧化應激反應和細胞凋亡發揮作用。本研究的不足之處是缺乏細胞實驗的佐證，此外對熊果酸發揮肝損傷保護作用的具體機制研究不夠深入，因此仍需要進一步完善。