類球紅細菌對農藥的耐受性研究

鄭緒瑞 章海鑫 曹海鵬

文章編號：1006-3188（2023）05-011-03

摘要：為評價類球紅細菌對農藥的耐受性，本實驗采用牛津杯法測定類球紅細菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈等10種農藥的敏感性，進而采用試管二倍稀釋法測定了類球紅細菌對敏感農藥的耐受劑量。結果表明，類球紅細菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑耐藥，對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑高度敏感；虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯酰·氰霜唑對類球紅細菌的MIC和MBC分別為48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L。本實驗結果為養(yǎng)殖水體中的農藥殘留對類球紅細菌的影響評價奠定基礎。

關鍵詞：類球紅細菌；農藥；敏感性；耐受劑量

中圖分類號：S948??? 文獻標識碼：A

類球紅細菌（Rhodobactersphaeroides）是一種具有良好解毒性能光合細菌［1］。曹海鵬等［2］研究表明，類球紅細菌能夠將敵百蟲對斑馬魚的LD50從26.06 mg/L提升至59.51 mg/L，表現(xiàn)出對降低敵百蟲良好的解毒效果。近年來，隨著農業(yè)生產規(guī)模的擴大，投入使用的農藥逐漸增多，農藥污染養(yǎng)殖水體環(huán)境的問題日益突出［3，4］。然而，養(yǎng)殖水體中的農藥殘留是否影響類球紅細菌尚不清晰。鑒此，本實驗采用牛津杯法測定了類球紅細菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈等10種農藥的敏感性，進而采用試管二倍稀釋法測定了類球紅細菌對敏感農藥的耐受劑量，以期為養(yǎng)殖水體中的農藥殘留對類球紅細菌的影響評價奠定基礎。

1 材料方法

1.1 實驗材料

類球紅細菌XR12，由本實驗室從養(yǎng)殖污泥中分離、鑒定并保存［2］；虱脲·蟲螨腈（有效成分12％）、井岡·己唑醇（有效成分11％）、氟硅唑（有效成分10％）、苯甲·嘧菌酯（有效成分30％）、腐霉利（有效成分50％）、苯醚·甲環(huán)唑（有效成分10％）、苯甲·丙環(huán)唑（有效成分30％）、聯(lián)菊·啶蟲脒（有效成分6％）、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（有效成分5％）、烯酰·氰霜唑（有效成分40％），所有藥物均為國內公司生產。營養(yǎng)瓊脂平板、紅細菌液體培養(yǎng)基［5］、含4 mL紅細菌液體培養(yǎng)基的帶帽試管30根、含2 mL紅細菌液體培養(yǎng)基的帶帽試管600根，均在121°C滅菌20 min，備用。

1.2 類球紅細菌菌懸液的制備

將類球紅細菌在無菌環(huán)境下接種于滅菌后的紅細菌液體培養(yǎng)基，置于恒溫光照搖床中培養(yǎng)48h，溫度30℃，轉速180 r/min；之后10000 r/min離心去除上清液，加入無菌水得到菌懸液，通過MPN5管法［6］測定菌懸液活菌含量并用無菌水稀釋至濃度為1.0×107 CFU/mL。

1.3 類球紅細菌對農藥的敏感性分析

采用牛津杯法［7］測定類球紅細菌對農藥的敏感性。無菌操作將107 CFU/mL類球紅細菌菌懸液0.2 mL均勻涂布營養(yǎng)瓊脂平板，然后在涂有類球紅細菌的營養(yǎng)瓊脂平板上放置無菌牛津杯，接著在每個牛津杯中分別加入0.2 mL濃度為10000 mg/L的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈藥液，然后于30℃恒溫正置培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑（d）。d＞15 mm為高度敏感，10 mm＜d≤15 mm為中度敏感，d≤10 mm為耐藥。每個處理設3個平行。

1.4 類球紅細菌對農藥的耐受劑量分析

采用試管二倍稀釋法測定類球紅細菌對1.3節(jié)篩選的敏感農藥的耐受劑量。試驗前無菌操作分別將聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈0.1 mL加入含4 mL無菌紅細菌液體培養(yǎng)基的試管中至質量濃度為25000 mg/L，混合均勻后再無菌操作從質量濃度為25000 mg/L的試管中吸取2 mL至含2 mL紅細菌液體培養(yǎng)基的試管中使質量濃度為12500 mg/L，混合均勻后再無菌操作從質量濃度為12500 mg/L的試管中吸取2 mL至含2 mL紅細菌液體培養(yǎng)基的試管中使質量濃度為6250 mg/L，依次操作將敏感農藥稀釋成3125、1562.5、781.25、390.63、195.31、97.65、48.83、24.41、2.21、6.10、3.05、1.53、0.76、0.38、0.19、0.10 mg/L，同時以含2 mL無菌紅細菌液體培養(yǎng)基的試管作為空白對照。無菌操作接種類球紅細菌菌懸液至含不同質量濃度敏感農藥的試管中使菌終濃度5.0×105 CFU/mL，然后于恒溫振蕩培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)48h后，以肉眼觀察結果，把無渾濁現(xiàn)象、稀釋度最大的質量濃度作為敏感農藥對類球紅細菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。在此基礎上，進一步從無菌生長的試管中取0.2 mL培養(yǎng)液在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，然后將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察有無菌落形成。把無菌落形成的、稀釋度最大的質量濃度作為敏感農藥對類球紅細菌的最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。每個處理設3個平行。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 軟件進行處理分析，以平均值±標準差表示。

2 實驗結果

2.1 類球紅細菌對農藥的敏感性

實驗結果（表1）表明，虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑對類球紅細菌具有明顯抑菌活性（圖1），其對類球紅細菌的抑菌圈直徑分別為22.33、25.67、19.67 mm，說明類球紅細菌對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑具有高度敏感性。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑對類球紅細菌的抑菌圈直徑小于10 mm，說明類球紅細菌對其不敏感。

2.2 類球紅細菌對農藥的耐受劑量

實驗結果（表2）表明，聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·蟲螨腈對類球紅細菌的MIC分別為195.31、195.31、48.83 mg/L，對類球紅細菌的MBC分別為195.31、195.31、97.65 mg/L。

3 討論

相關研究［8］表明，光合細菌對農藥的敏感性具有一定的差異性。蘇亮等［9］證明沼澤紅假單胞菌對養(yǎng)殖水體中殘留的阿維毒、百草枯等農藥敏感，對辛硫磷和滅多威等農藥耐藥。本實驗結果表明，類球紅細菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑不敏感；對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯酰·氰霜唑高度敏感。光合細菌對農藥敏感性的差異可能與其具有分解利用農藥的能力有關［10］。

近年來，有機氯、有機磷、菊酯類等農藥殘留在水產養(yǎng)殖水體中均被檢出［11-13］，水產養(yǎng)殖水體已經(jīng)面臨了農藥殘留污染問題。目前，有的殘留農藥對益生菌的抑制作用已經(jīng)被證實。例如，藍俊虹等［14］研究發(fā)現(xiàn)喹烯酮在≥25 mg/L時對丁酸梭菌具有抑制作用，在≥50 mg/L時對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌具有抑制作用。然而，農藥殘留對類球紅細菌的影響未有報道，本研究證實類球紅細菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井岡·己唑醇、苯甲·丙環(huán)唑耐藥，對虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒、烯酰·氰霜唑農藥高度敏感；虱脲·蟲螨腈、聯(lián)菊·啶蟲脒和烯酰·氰霜唑對類球紅細菌的的MIC和MBC分別為48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L，可作為養(yǎng)殖水體中這些農藥殘留對類球紅細菌影響的風險評估依據(jù)。

參考文獻

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