堿解法—液質聯用測定小麥中2甲4氯異辛酯及其代謝物2甲4氯

楊玉娟，封 雅

(蘇州華測安評技術服務有限公司，江蘇 蘇州 215121)

2甲4氯異辛酯為苯氧乙酸類除草劑，主要登記作物為冬小麥田，大豆田，小麥田，春小麥田，春玉米田，水稻田(直播)，高粱田等，用于防治一年生和多年生闊葉雜草，其主要具有較強的內吸傳導性，能穿過角質層和細胞膜，迅速傳導至雜草各個部位，最后引起全株死亡[1]。FAO 在2甲4氯評估報告指出2甲4氯異辛酯在小麥中很容易被水解為2甲4氯，其可與葡萄糖等形成共軛物[2]，董見南等在研究小麥中2甲4氯異辛酯的殘留及代謝轉化時也發現2甲4氯異辛酯在小麥植株體內可快速代謝為2甲4氯，消解半衰期為1.1～3 d[3]。2甲4氯亦是苯氧乙酸類除草劑，通常以鹽、胺鹽或酯來配制和使用，均為低毒農藥，但隨著該類農藥的廣泛使用其帶來的食品農藥殘留、水土污染問題亦不能忽視。目前我國規定小麥中2甲4氯和2甲4氯異辛酯臨時殘留限量均為0.1 mg/kg[4]，日本小麥中2甲4氯殘留限量為0.04 mg/kg(酯、鹽等)[5]，歐盟規定小麥2甲4氯殘留限量為0.2 mg/kg (包括鹽、酯、共軛物)[6]。

目前國內外對2甲4氯異辛酯的測定方法主要為氣相色譜-質譜聯用儀和氣相色譜，其代謝產物2甲4氯的測定方法主要為高效液相色譜-質譜聯用儀[7-12]?！掇r藥登記殘留試驗待測殘留物和植物源性食品膳食風險評估殘留物目錄(2021版)(征求意見稿)》中2甲4氯異辛酯的殘留物定義為2甲4氯異辛酯、2甲4氯及其共軛物之和，要求檢測過程加堿水解釋放共軛物，膳食風險評估采用2甲4氯計算ADI(每日容許攝入量)[13]。但2甲4氯異辛酯遇酸、堿分解[14]，若二者獨立測定，在測定樣品時加堿水解釋放共軛物時會引起2甲4氯異辛酯水解造成二者含量結果不準確。因此，加堿將2甲4氯異辛酯徹底水解為2甲4氯，并釋放2甲4氯的共軛物，HPLC-MS/MS儀器測定結果為2甲4氯含量，能夠滿足2甲4氯異辛酯在農藥登記試驗的膳食風險評估要求。聶春林等采用甲醇-氫氧化鈉提取并堿解小麥籽粒和秸稈中的2甲4氯異辛酯，高效液相色譜測定2甲4氯含量的方法，表明將2甲4氯異辛酯堿解為2甲4氯的方法可行，轉化率可達95%～102%。但該方法提取和凈化過程較為復雜，采用液相色譜儀檢測，靈敏度較低，檢測時間較長[15]。本文中籽粒和秸稈樣品通過0.1%甲酸乙腈提取、氫氧化鈉堿解的方法將2甲4氯異辛酯和2甲4氯共軛物均轉變為2甲4氯，樣品經GCB和PSA凈化后采用HPLC-MS/MS檢測，檢測過程簡單快捷，回收率好、靈敏度較高，適用于小麥籽粒和秸稈中2甲4氯異辛酯和代謝產物2甲4氯及其共軛物的殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 美國AB SCIEX Triple quad 4500液質聯用儀，瑞士梅特勒XS205DU電子天平；常州普天儀器制造有限公司MS200多管漩渦混合儀；湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司L550離心機；普蘭德移液器(100 μL～5 mL)；Milli-Q Academic超純水儀等。

試劑和材料 2甲4氯異辛酯標準品：純度93.43%；2甲4氯標準品：純度98.7%；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；氯化鈉(分析純)；無水硫酸鎂(分析純)；鹽酸(分析純，36.0%～38.0%)；氫氧化鈉(分析純)；GCB凈化劑(石墨化碳黑)；PSA凈化劑(N-丙基乙二胺)，0.22 μm PTFE親水性濾膜，50 mL和2 mL離心管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗樣品 采集江蘇蘇州小麥籽粒和秸稈空白樣品，經粉碎機粉碎后制備成空白實驗室樣品。

1.2.2 標準溶液的配制 分別準確稱取18.81 mg的2甲4氯異辛酯和12.92 mg的2甲4氯標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成濃度分別為1 757 mg/L(標準品純度為93.43%)的2甲4氯異辛酯和1 292 mg/L 2甲4氯標準儲備液。按照2甲4氯異辛酯相對分子量312.8，2甲4氯相對分子量200.6，2甲4氯異辛酯以2甲4氯計濃度為1 126 mg/L。

1.2.3 樣品處理 提?。悍謩e稱取2.5 g籽粒、秸稈樣品(精確至0.01 g，偏差±0.02 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈溶液(秸稈先加入10 mL水潤濕)，2 500 rpm渦旋提取10 min，加入約0.5 g NaCl和約1 g無水MgSO4(秸稈加入約1 g NaCl和約2 g無水MgSO4)，2 500 rpm渦旋提取5 min，4 000 rpm離心5 min，轉移上清液。

堿解：在上清液中加入2 mL (秸稈2.5 mL)0.25 mol/L的NaoH溶液，2 500 rpm渦旋堿解15 min(秸稈堿解30 min)后加入1 mL 1mol/L的鹽酸溶液，2 500 rpm渦旋5 min，加入約1 g NaCl和約2 g無水MgSO4，2 500 rpm渦旋5 min，然后4 000 rpm離心5 min，上清液待凈化。

凈化：移取上清液1 mL，加入20 mg GCB(秸稈加入約20 mg GCB和7 mg PSA)，籽粒渦旋30 s后靜置，秸稈渦旋15 s后盡快過濾膜。上清液過0.22 μm親水PTFE濾膜，供HPLC-MS/MS分析測定。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 um)；柱溫：40°C；進樣量2 μL；流動相：0.1%甲酸溶液(A)：乙腈(B)，梯度洗脫條件(表1)。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫條件

1.2.5 質譜條件 離子源：ESI，負離子模式。電噴霧離子源溫度550℃，電噴霧電壓4.5 kV，氣簾氣30 psi，霧化氣GS1：55psi，輔助氣GS2：55 psi。質譜參數(表2)。

表2 質譜參數

2 結果與分析

2.1 2甲4氯異辛酯轉化為2甲4氯的轉化率將2甲4氯異辛酯(以2甲4氯計)用10 mL 0.1%甲酸乙腈配制成濃度為1、5、10、50、100 μg/L的標準溶液，設置一個空白樣品(0.1%甲酸乙腈)，經1.2方法中籽粒的前處理方法進行提取、堿解和凈化處理后上機。采用經過前處理的空白溶液配制2甲4氯系列標溶液對以上2甲4氯異辛酯樣品結果進行定量，比較二者峰面積，結果表明2甲4氯異辛酯(以2甲4氯計)在1～100 μg/L范圍內，轉化為2甲4氯的為93%～99%(表3)，表明經1.2試驗方法，2甲4氯異辛酯可完全轉化為2甲4氯。

表3 2甲4氯異辛酯轉化率

2.2 提取和堿解 常用的提取試劑為乙腈、甲醇等，甲醇不利于后續的鹽分層，因此本研究主要采用乙腈作為提取試劑。借鑒聶春林等采用甲醇-0.25 mol/L NaOH作為提取試劑[15]，筆者初期試驗也考慮采用提取和堿解一體的方式，在純溶劑階段提取和堿解一體是可行的，但加入樣品基質后，堿解對小麥樣品的破壞力較大，基質效應明顯，易污染儀器，造成結果不穩定，因此采用先提取再堿解的前處理方法。樣品提取溶劑選取過程中比較乙腈、0.1%甲酸乙腈和0.25 mol/L NaOH∶乙腈(1∶5)提取劑，發現籽粒樣品添加2甲4氯標準品后經0.25 mol/L NaOH∶乙腈(1∶5)提取為經0.1%甲酸乙腈提取的峰面積的1/3，因此本研究采用0.1%甲酸乙腈作為提取劑。堿解時間及加堿量，多次試驗表明秸稈樣品需要較長的堿解時間才可達到較為滿意的回收率，因此秸稈樣品堿解過程中的加堿量和堿解時間較籽粒樣品多。

2.3 凈化劑選擇 常用的凈化劑包括C18(十八烷基鍵合硅膠)、PSA、GCB，GCB對色素有較 強的吸附能力，PSA對脂肪酸、有機酸、糖類及部分親脂的色素有吸附能力，C18主要對脂肪等非極性化合物有吸附能力[16]。本研究通過在籽粒中添加 0.01 mg /kg 的2甲4氯對以上3種凈化劑凈化結果進行比較，發現對2甲4氯的吸附能力順序為C18>PSA>GCB，因此本研究采用GCB凈化籽粒上清液。而秸稈上清液僅用GCB凈化后效果略差，凈化后仍有明顯的顏色，而加入少量PSA后，樣品液顏色變淺，可能是PSA有助于去除部分親脂的色素和其他的一些物質，減少干擾，可以確保回收率較好，因此本研究采用GCB和PSA兩種凈化劑凈化秸稈上清液。

2.4 標準曲線和基質效應 分別采用乙腈溶劑、籽?；|空白和秸稈基質空白配制2甲4氯溶劑標準曲線、籽?；|標準曲線和秸稈基質標準曲線，濃度范圍均為1～100 μg/L。通過濃度和峰面積的做回歸曲線后進行定量并計算相關系數，結果表明溶劑標準曲線、籽粒和秸稈基質標準曲線在1～100 μg/L范圍內線性良好，相關系數均>0.999(表4)。

表4 2甲4氯在不同基質中的標準曲線

采用基質標準曲線斜率和溶劑標準曲線斜率之比(k)來評價基質效應，當k>1.1時為基質增強效應，k<0.9時為基質減弱效應，而當k在0.9～1.1之間時為基質效應不明顯，本試驗籽粒和秸稈基質效應(表4)，結果顯示2甲4氯在籽粒中呈現基質增強效應，在秸稈中基質效應不明顯。為保證試驗定量結果準確性，本方法均采用基質標準曲線消除基質效應。

2.5 方法的回收率和精密度 稱取已粉碎混勻的籽粒和秸稈空白樣品2.5 g，使樣品中2甲4氯異辛酯或者2甲4氯的濃度分別為0.02、0.5和5 mg/kg，靜置30 min，均設置5個平行，另設空白(用于空白試驗和基質標準曲線的配制)。按照1.2.3進行前處理和分析測定，計算回收率和精密度(相對標準偏差)，結果(表5)。2甲4氯異辛酯在0.02、0.5 和5 mg/kg的添加水平下，籽粒的回收率分別為96%、87%、93%，相對標準偏差分別為5.6%、4.6%、3.3%，秸稈的回收率分別為91%、91%、86%，相對標準偏差分別為2.1%、3.4%、4.7%。2甲4氯在0.02、0.5和5 mg/kg的添加水平下，籽粒的回收率分別為94%、102%、106%，相對標準偏差分別為6.1%、3.3%、3.9%，秸稈的回收率分別為98%、102%、100%，相對標準偏差分別為3.0%、4.8%、6.3%；另溶劑空白在標準品相應位置的信號應無響應，籽粒和秸稈基質空白在標準品相應位置峰面積均低于最低定量限的30%，以上試驗結果表明本方法符合農藥殘留分析方法NY/T 788-2018要求[17]。溶劑空白、籽粒和秸稈空白色譜圖(圖1～3)。本方法小麥籽粒和秸稈中2甲4氯和2甲4氯異辛酯定量限濃度均為0.02 mg/kg，典型譜圖(圖4～7)。

圖1 溶劑空白

圖2 秸稈基質空白

圖3 籽?；|空白

圖4 秸稈中2甲4氯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖5 籽粒中2甲4氯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖6 秸稈中2甲4氯異辛酯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

圖7 籽粒中2甲4氯異辛酯添加濃度為0.02 mg/kg色譜圖

表5 2甲4氯異辛酯和2甲4氯在小麥籽粒和秸稈中的添加回收率(n=5)

3 結論

本研究結合QuEChERS前處理方法和堿解衍生技術，將小麥籽粒和秸稈中的2甲4氯異辛酯水解為2甲4氯并釋放2甲4氯共軛物，建立了一種檢測小麥樣品中2甲4氯異辛酯和2甲4氯及其共軛物殘留的HPLC-MS/MS 檢測方法，定量限為0.02 mg/kg，該方法回收率和精密度等符合農藥殘留檢測分析的要求，檢測過程簡單快捷，可應用于大量小麥樣品中2甲4氯異辛酯和代謝產物2甲4氯及其共軛物的殘留檢測，為2甲4氯異辛酯在小麥中的膳食風險評估提供更為便捷的檢測方法。