動物源沙門氏菌的復蘇、保藏與抗藥性檢測

文│方杰（山東省青島市即墨區農業農村局）

為了掌握獸醫藥敏試驗技術，復蘇與保藏了2013—2014年采集的不同動物來源的沙門氏菌共300株，采用96點陣藥敏檢測儀檢測這些菌株對9種常用藥物（氨芐西林、硫酸粘菌素、環丙沙星、恩諾沙星、硫酸新霉素、慶大霉素、頭孢噻呋、多西環素、氟苯尼考）的最低抑菌濃度（MIC）。96點陣藥敏檢測儀根據瓊脂稀釋法原理，結合圖像分析技術、數據庫技術和互聯網，構建山東省的抗藥性監測網。結果顯示，菌株復蘇率98%；動物源沙門氏菌的抗藥頻率高，尤其是對多粘菌素藥物，抗藥率高達78.76%以上；多數菌株對4～6種藥物有抗性。鴨源沙門氏菌比豬源的抗藥性高，臨沂地區比平度地區抗藥性高。研究結果表明，沙門氏菌抗藥性較普遍，應通過建立獸醫抗藥性監測網進行匯集和統一監管，為抗菌藥物的有效使用提供依據和保障。

沙門菌屬是腸桿菌科中的一個大屬，是危害人類與畜禽等動物的一類重要病原菌。該菌為革蘭氏陰性菌，無芽孢桿菌。禽類（特別是雞）感染沙門菌后容易引發多種疾病，主要為雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒3種。沙門氏菌感染人類而引發的一系列疾病已經對人類的勞動生產及人類自身健康產生了極大的影響，對公共衛生安全和正常的生產秩序產生了不良影響，應引起重視。近年來，隨著我國養殖業不斷增長，抗生素的大量使用，使沙門氏菌的抗藥性逐漸增強，這也是危害養殖業的一大隱患。

藥敏試驗通過采取不同形式的方法檢測一系列抗菌藥物對試驗菌的抑制效果，并以一定的方式進行結果描述，對臨床用藥有指導性意義。藥敏試驗的常用方法有紙片法、E測定法和稀釋法。在本研究中，山東省農業科學院畜牧獸醫研究所根據CLSI提出了瓊脂稀釋法的工作原理，自主研發96點陣藥敏檢測儀及圖像采集系統，實現了藥敏檢測的大通量、高效率和結果采集自動化。

一、實驗材料

1.試劑。滅菌生理鹽水、滅菌水，無水乙醇、PBS（pH＝6，0.1摩爾/升）；MHB肉湯、MHA肉湯、普通瓊脂粉均購自北京陸橋技術有限責任公司。

2.試驗設備和儀器。一次性培養皿、接種針、棉棒、紙片、酒精燈、甘油、EP管、鑷子等。

3.藥品。氟苯尼考可溶粉、硫酸慶大霉素可溶性粉、頭孢噻呋鈉、氨芐西林可溶性粉、硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、乳酸環丙沙星可溶性粉、鹽酸多西環素可溶性粉、鹽酸恩諾沙星均來自亞康藥業抗生素標準品。

二、試驗方法

1.菌種的復蘇。

（1）培養基配制。MHA平板的配制：稱取MHA培養基以38克/升加入錐形瓶中，加水，搖勻，121℃、15分鐘條件下進行高壓滅菌后冷卻至45～50℃。高壓滅菌過程中將一次性培養皿在超凈臺中進行紫外線照射。將冷卻好的MHA培養液傾注于紫外線照滅菌的一次性培養皿中。將凝固好的瓊脂平板對應需要復蘇的細菌進行編號。

（2）細菌培養。將細菌從-20℃保存箱里取出，室溫解凍。用無菌接種針在潔凈工作臺中挑取菌液并劃線接種于編號相同的MH瓊脂培養基平皿上，需劃出單菌落。劃線后的MH瓊脂培養基平皿放置37℃恒溫箱中靜置培養18～24小時。

培養結束后取出培養皿，觀察是否所有培養皿細菌都生長、是否為沙門氏菌，以及沒有被其他細菌污染。如果出現對應培養基中沒有長菌，則需要將原來菌樣放到37℃搖床中培養12小時以上，然后重新接種到培養皿中觀察。

（3）細菌保存。從溫箱中取出接種細菌的MHA培養皿，觀察每個平皿中的細菌生長情況，選擇生長良好的進行細菌保存。細菌分為兩種保存方法：紙片法保存。在超凈臺中將滅好的2毫升EP管進行編號，跟之前細菌編號一致，一一對應；用鑷子夾取滅菌過的紙片4～6片平放到細菌生長良好的MHA培養皿中，用鑷子輕輕夾取紙片在培養基表面蘸取細菌，然后夾取蘸有細菌的紙片放到對應的EP管中，蓋好管蓋，進行下一個細菌保存。甘油肉湯保存法。取滅菌的2毫升EP管，用移液槍在每個管中加入1毫升配好的滅菌過的甘油肉湯，將EP管進行編號，與原細菌編號相同，再用高壓滅菌好的棉棒在細菌生長良好的MHA培養基表面輕輕滑動，將細菌蘸取到棉棒上，將棉棒放入對應編號的甘油肉湯中，用力擠壓，使細菌能夠完全稀釋到生理鹽水中，蓋緊管蓋。將用紙片法保存的細菌放入冰箱中儲存，將甘油肉湯法保存的細菌放入到-20℃儲存，以備常用。

2.MIC的測定。

（1）藥物平板的配制。將抗菌藥物粉劑按照有效含量計算，判定完全抑制菌落生長的抗菌藥物的濃度即為殺菌濃度，將HPLC純度、含水量、鹽的形式提供的藥物活性分數都考慮在內，獲得各種藥物預計的終濃度溶液。

（2）用96點陣接種儀接種。選取需要測定的細菌和質控菌株，在MHA培養基上培養，方法同細菌復蘇培養法。

取96點陣藥敏檢測儀，將高壓滅菌過的96孔針安裝到96點陣藥敏檢測儀上。取加樣好的96孔菌樣放置到96點陣藥敏檢測儀的一端，第一個接種對照組空白瓊脂板，再將不同藥物濃度梯度的瓊脂板從低濃度到高濃度依次接種，在所有藥物平板接種大約到一半數量時增加另外一個空白瓊脂板作為第二個對照。將所有平板按順序倒放在37℃恒溫箱中恒溫培養18～24小時。

（3）結果圖像采集和MIC統計。從溫箱中取出平板按順序放好，從低濃度到高濃度排放。鏈接藥敏圖像采集儀，打開電腦中的藥敏檢測軟件，輸入相應信息，按藥物濃度由16R到1/8R設置藥物梯度。設備連接好后將藥物瓊脂培養基按不同的藥物由低濃度到高濃度依次放入藥敏圖像檢測儀中進行拍照采集，采集沙門氏菌在不同藥物及同種藥物不同藥物濃度下的生成情況，采集結束將采集到的所有數據統一保存到數據庫中做進一步處理。應注意到儀器在采集過程中可能會出現誤差，需要人工檢查，并及時修改。

三、試驗結果與分析

1.菌株復蘇與保藏。細菌在MHA培養基上基本生長良好，出現單菌落，根據單菌落的形態基本能確定是純凈的復蘇前細菌，對在MHA培養基上生長良好的細菌進行保存。

細菌經過MHA培養基培養后生長良好，也有因為試驗操作原因出現個別MHA培養基上的細菌沒有生長，再次培養后細菌生長良好。最后，將所有生長良好的細菌在紙片保藏和甘油肉湯保藏兩種保存方法下存儲到冰箱中低溫保藏。

2.沙門氏菌MIC測定結果。由MIC分布圖可見，此次沙門氏菌對以上9種藥物的敏感性有所差異，可以直觀地看到對多粘菌素的抗性菌較多，抗藥率為78.76%；其次是恩諾沙星的抗藥率為73.07%。頭孢噻呋鈉的抗藥率較低，為22.74%。環丙沙星、氨芐西林、新霉素和慶大霉素分布跨度比較大，抗藥率分別為71.15%、57.91%、46.32%和41.71%。多西環素和氟苯尼考的抗藥率分別為61.92%和46.15%。

多重抗藥菌是指有多重抗藥性的病原菌，是同一病原菌對三類或三類以上抗菌藥物同時耐藥的現象。

通過上表可以得出，本試驗的200株沙門氏菌存在較高的多重耐藥性，多重耐藥率高達74.5%。沙門氏菌出現較高的多重耐藥性，增加了治療沙門氏菌的難度。

四、討論

1.細菌復蘇重要性。細菌的復蘇是很重要的基礎試驗，本試驗可以確保細菌活性，對研究細菌耐藥性提供材料與基礎。雖然細菌復蘇是很簡單的試驗，但只有不斷保留原始證據才能發現和解決問題?？梢愿鶕凹毦顾幮缘奶攸c了解到當時的用藥情況，還可以比較之前細菌跟現在細菌的抗藥性，發現細菌跟藥物之間存在的問題與聯系。

2.96點陣藥敏檢測儀的優勢。

在采樣基數龐大的前提下，本試驗運用了96點陣藥敏檢測儀系統進行科學的藥敏試驗，得到樣本的具體MIC，簡便快捷。比起微量肉湯稀釋法更加節約成本，節省資源，簡單高效，科學準確；比起紙片擴散法測量抑菌圈直徑，這種方法可以得到具體的MIC值，方便給臨床選藥和確定用量提供更直接的理論依據。而連接計算機設備的數字化讀數方法更是將主觀誤差減到最小。

96點陣藥敏檢測儀的創新與使用實現了藥敏檢測大通量、高效率和準確度高的目標，減小了人為誤差，可準確、高效地收集大量數據并保存。96點陣藥敏檢測儀將漸漸取代原始的藥敏檢測方法，但96點陣藥敏檢測由微量肉湯檢測法不斷演變而來，依然沒法完全包含微量肉湯檢測法的全部優點，所以96點陣檢測儀依然在不斷改進和創新。

3.抗藥性監測技術體系的建立?？股厥侵委焺游锛膊〉闹匾a品，但長期濫用抗生素會使病原菌產生抗藥性，在畜產品和環境中也會有大量殘留，因此，建立完善的抗藥性監測技術體系勢在必行。

表1 動物源沙門氏菌多重抗藥情況