細菌程序性細胞死亡及其在抗菌治療中的應用前景

劉偉佳?方芳?朱靚?薛云新?王岱

摘要：細菌程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD）是細菌在壓力環境下自發犧牲部分亞群以提高細菌群體生存而產生的編程性死亡，該利他現象受到越來越多的關注。耐藥菌的出現為病原菌殺傷帶來挑戰，鑒于細菌PCD在耐藥菌產生與治療方面的重要作用，本文從PCD角度詳細分析細菌應對抗生素壓力的方式，闡明PCD為抗菌治療提供的新策略，為合理使用這把“雙刃劍”提供理論支持。

關鍵詞：細菌；程序性細胞死亡；抗生素耐藥；抗菌治療；利他主義

中圖分類號：Q932， TQ465文獻標志碼：A

Bacterial programmed cell death and its application prospect in antimicrobial therapy

Liu Wei-jia， Fang Fang， Zhu Liang， Xue Yun-xin， and Wang Dai

（Department of Experimental Medicine， State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics， Xiamen 361102）

Abstract Bacterial programmed cell death （PCD） is a programming death in stressful conditions， at the cost of spontaneously sacrificing sub-population as to improve survival of bacterial population. The altruistic behavior is getting an increase attention. The emergence of drug-resistant bacteria has always posed a challenge to the killing of pathogens. Since bacterial programmed cell death plays an important role in both the generation and treatment of drug-resistant bacteria， we analyzed the response modes of bacteria to antibiotic pressure from the perspective of PCD， and illustrated new strategies of PCD for antimicrobial treatment， so as to provide theoretical support for the rational use of this double-edged sword.

Key words Bacteria; Programmed cell death; Antibiotic resistance; Antimicrobial therapy; Altruism

程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD） 在多細胞真核生物中普遍存在，前期研究通常以真核細胞表型定義PCD，但近期研究表明PCD于細菌群體也至關重要[1-5]。面對不同壓力刺激時，野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）[6]、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）[7]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[8]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[9]和結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[10]等均易產生PCD。對于單個細菌細胞，PCD會導致菌體死亡，但當視為群體的一部分時，部分細菌主動死亡可為壓力環境下的群體提供養分與生存空間，有利于其余菌群存活[1，3，11-12]。該“利他主義”行為展現出菌群協同進化過程中的精妙合作。

2021年，世界衛生組織宣布抗微生物藥物耐藥 （antimicrobial resistance， AMR）是人類面臨的全球十大公共衛生威脅之一[13]。據Lancet雜志報道，在2019年全球約有近500萬例與細菌性AMR相關的感染死亡[14]。同年美國疾病控制與預防中心統計發現，美國每年有280多萬起AMR病例感染，超過3.5萬人因此死亡[15]。2016年英國政府有關審查報告指出：若缺乏有效途徑加以抑制，預計2050年，全世界每年約有1000萬人死于AMR感染[16]。可見抗微生物藥物耐藥給人類帶來極大危害，增強現有抗菌藥物殺傷效果和研發新型抗菌藥物至關重要。

細菌PCD是耐藥菌最初產生的主要原因，合理利用細菌PCD又能殺傷病原菌。鑒于細菌PCD在耐藥菌產生以及治療方面的重要作用，本文對細菌PCD及其誘發因素進行綜述，詳細介紹PCD用于抵抗病原菌的新策略，闡明PCD與耐藥菌的“雙刃劍”關系，為PCD在原核細菌群體中抗菌治療方向提供應用思路。

1 細菌的程序性細胞死亡

1995年，Science雜志首次報道關于限制修飾系統 （restriction-modification system， RM系統） 介導大腸埃希菌PCD的研究成果，引起廣泛關注[17-18]。自此，“細菌PCD”理論逐步成為原核生物研究領域的熱點方向之一。Kenneth[19]提出細菌PCD是由遺傳編碼決定的高度協調過程，當修復損傷細菌細胞成本高于構建新細胞成本時，細菌才自主啟動PCD響應損傷。“親緣選擇理論”是解釋細菌群體PCD 的假設之一：若受益個體是遺傳親支并且“成本/收益”比值小于“親緣關系度”，則代價高昂的個體行為可以進化[20-22]。

過去10年，細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee on Cell Death， NCCD）就形態學、誘發機制與功能作用角度對多種死亡類型做出定義[23]。目前對真核生物PCD過程研究較為透徹，主要分為細胞凋亡和自噬[24]。作為一個非炎癥過程，細胞凋亡形態特征表現為細胞質、細胞核收縮，DNA損傷及凋亡體形成[25]。目前已知的細胞凋亡主要途徑有3種，包括內源的線粒體介導細胞凋亡（又名BCL-2調節途徑）、外源的死亡受體介導細胞凋亡和內質網途徑的細胞凋亡[24]。細胞凋亡早期的重要特征是半胱氨酸依賴的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine， PS）外翻引發“胞葬作用”（efferocytosis），吞噬細胞和溶酶體進一步清除凋亡細胞。與之相反，核心的自噬機制與吞噬細胞幾乎無關，由30多個自噬相關基因編碼，特征是垂死細胞本身存在自噬液泡，細胞質封存在自噬體內部，以便溶酶體進行本體降解[26]。

已有報道提出細菌PCD過程涉及的內在途徑與真核細胞PCD相比高度保守，如細菌中用來調節死亡與裂解的holin樣蛋白具有類似于促凋亡BCL-2蛋白的死亡效應[19]。除去真核生物特有的細胞結構，細菌的凋亡樣程序性死亡 （apoptosis-like death， ADL） 與真核細胞凋亡在形態學上無明顯差異，相似度極高（表1）[10，27]。

2 影響細菌PCD發生因素

2.1 外在不利壓力引發PCD

研究表明多種壓力應激源可誘導細菌產生PCD：熱休克、極端pH、營養饑餓、抗生素殺傷、噬菌體攻擊、暴露于異種生物和遺傳毒性分子等外環境因素不適宜細菌生存，可誘發細菌“凋亡樣”死亡過程，導致細胞分裂、染色體縮合和破碎、核糖體RNA降解、膜去極化和重塑，直至死亡[12，28-29]。其中，營養饑餓引發的PCD受鳥苷四磷酸（ppGpp）調控[11]。面對饑餓環境，細胞內快速積累ppGpp，嚴謹反應下停止大部分代謝活動，抑制核糖體和tRNA，整體轉錄水平下降，因而減弱mazEF基因轉錄[12，30]。MazEF屬于II型毒素-抗毒素系統（toxin-antitoxin system， TA），由毒素MazF與抗毒素MazE組成，該系統與ppGpp介導的大腸埃希菌PCD有關。營養饑餓時MazEF轉錄與翻譯位點在ppGpp作用下被抑制，不穩定蛋白質MazE被ClpAP絲氨酸蛋白酶降解，MazF以不依賴核糖體的方式切割RNA，進一步引發大腸埃希菌PCD[12]。

2.2 內源性ROS引發PCD

另一方面，細胞內在應激也會誘發細菌PCD，包括體內活性氧（reactive oxygen species， ROS）積累、DNA損傷等[30-31]。ROS通常包括超氧化物、過氧化氫和羥基自由基，過量ROS導致DNA斷裂、膜去極化、蛋白質羰基化及細胞壁損傷，直接誘導細胞內在凋亡，且其作用通常是累計級聯反應，即ROS介導的損傷可進一步引發ROS生成，加劇細胞破壞[32-33]。研究表明假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）中ROS含量與PCD標志物水平呈顯著相關。在用ROS清除劑預處理后，所有PCD標志物百分比降低，死細胞比率也降低，表明隨著細胞ROS清除，假微型海鏈藻群體中PCD發生率隨之降低[31]。

2.3 群體感應系統引發PCD

當細菌生長密度達到閾值時，微生物可分泌群體感應分子進行細胞間通訊，控制群體生命活動與行為[34]。群體感應（quorum sensing， QS）系統根據分泌的自誘導劑性質及其信號轉導模式主要分為革蘭陽性（Gram-positive）細菌和革蘭陰性（Gram-negative）細菌兩類（圖1）[35]。上述信號分子不僅有利于種群內細菌之間通訊，也為種間交流奠定生物學基礎。

高密度細菌群體營養物質有限，不利于細菌生長與代謝，因此控制細胞密度以優化代謝產生至關重要。QS系統在控制種群密度上發揮關鍵作用，通過引發部分細菌死亡為群體提供高質量代謝環境，與“利他主義”原理相吻合[35-36]。

如革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌通過Agr QS系統進行調節，由反應調節子AgrA和組氨酸激酶感應器AgrC組成，AgrC可通過表達RNA III調節子來響應自誘導多肽。RNA III和agrA的缺失株比野生型菌株存活率更高，表明野生型中存在由RNA III本身而非其編碼的δ毒素介導的Agr系統發揮作用，導致部分細胞失活[37]。G-菌銅綠假單胞菌的QS依賴于3個相互聯通的回路，las、rhl和pqs系統。作為其中最主要的QS系統，las可通過激活轉錄因子LasR來調節rhI和pqs。研究發現lasR突變體在培養36～54 h后細胞密度幾乎維持恒定，而野生型生長密度已顯著下降，證明LasR可介導細胞溶解與死亡[38]。在與宿主相互作用時，銅綠假單胞菌的QS系統還能調控宿主細胞PCD。QS分子N-（3-氧代十二酰基）-高絲氨酸內酯通過摻入哺乳動物的質膜誘導真核細胞脂質結構域溶解，引發caspase 3-caspase 8介導的細胞凋亡，抑制宿主天然免疫反應，增強自身在宿主內生存定植，可見其促凋亡作用是調節免疫活性的主力軍[39-40]。

3 細菌利用PCD應對抗生素壓力

抗生素殺傷細菌主要通過靶向30S或50S核糖體亞基抑制蛋白質合成，或抑制細胞壁、核酸、ATP合成等，進一步擾動細胞代謝水平造成細菌損傷，細胞代謝狀態改變又會反向影響其對抗生素敏感性[41-42]。面對抗生素壓力時細菌會利用PCD“利他性”實現群體利益更大化：一方面PCD指向降低環境中抗生素濃度途徑，如死細菌透過膜吸收抗生素或釋放酶降解抗生素以抵抗外界壓力[43-44]；另一方面，PCD指向促進抗菌物質釋放途徑，如細菌種間與細菌種內競爭時產生抗菌物質實現競爭優勢[1，45]。可見抗生素壓力下，PCD與抗菌物質的產生與減少都密不可分。

3.1 PCD促進抗菌物質釋放

3.1.1 細菌種間競爭

在壓力應激時，細菌能夠自發產生廣譜抗菌物質抵抗其他與之競爭的細菌群體，如被人熟知的抗菌肽。雖然細菌細胞不能自發分泌抗菌化合物，但可通過裂解釋放抗菌物質。如在不同細菌間相互競爭時，大腸埃希菌產生的抗菌肽被釋放后，可以殺死競爭細菌，有利于剩余大腸埃希菌群生存[45]。

3.1.2 細菌種內競爭

在細菌發育進程中不僅存在種間競爭，還存在種群內殺傷：在抗生素作用下某一亞群分泌抗菌物質以殺死另一亞群，以此獲取胞外同源DNA增強遺傳多樣性，最終使種群存活率升高，該現象被認為是表型異質性的極端形式之一[1]。如在枯草芽胞桿菌中，同類相食是一種分化策略，可增強生物膜形成，在饑餓條件下延緩甚至阻止內孢子形成，同時可保護生物膜內細胞免受競爭物種侵害[1]。

綜上可見，細菌群體可通過分泌抗菌物質實現對競爭群體和同類細菌群的部分殺傷，不僅利于同種親緣菌群，也能抑制其他物種生長[21]。

3.2 PCD減少環境中抗生素濃度

3.2.1 死細胞降低抗生素濃度

研究發現抗生素壓力下的死亡細菌能降低環境中抗生素濃度以保護其他活菌群體。如人源性LL37抗菌肽能透化大腸埃希菌細胞膜以殺死部分亞群，但隨之形成的死細胞會借助破膜滲透的方式從環境中吸收剩余LL37來降低抗菌肽療效，從而保護更多活菌，形成集體耐受[43]。基于數學建模分析，結合群體與單細胞實驗，發現“細菌吸收LL37的時間與其細胞質膜的滲透時間一致”，該現象證實了死細菌能夠吸收抗菌肽[43]。

3.2.2 細菌釋放酶降解抗生素

在一定程度上可用利他性死亡來解釋高濃度抗生素殺菌的“eagle effect”現象，即病原菌整體密度表現出與抗生素作用濃度非單調的對應關系，高抗生素濃度時殺菌效果反而降低。具體表現在抗生素壓力下，部分細菌裂解并釋放β-內酰胺酶，快速降解環境中抗生素，以更快地恢復種群密度減弱抗生素殺傷[44]。

4 基于細菌PCD行為的抗菌新策略

抗生素的泛用、濫用使得越來越多的耐藥菌涌現。耐藥菌的產生是細菌群體在最初面臨抗生素壓力時，少量抗性突變體以自我犧牲為代價，通過產生如吲哚類的信號分子打開藥物外排泵將抗生素輸送至細胞外、產生氧化應激保護機制，為相對藥物敏感的細胞提供保護，從而提高整個種群生存能力[46-47]，這也是PCD為最初產生耐藥菌所做的貢獻。提升現有抗菌藥物殺傷病原菌能力以及研發新型抗菌藥物是目前抗菌藥物研發兩大主要方向，PCD在這兩方面均能提供新策略。

4.1 誘發PCD促進細菌細胞死亡

就提升目前抗菌藥物的殺傷力方面，激活PCD可以增強細菌死亡程度，實現有效殺傷。例如原核生物中保守性較高的TA系統已被發現可以作為抗生素靶標開發的重要靶點之一[48]。早在2004年已證明抗生素如氯霉素、大觀霉素與利福平可通過抑制轉錄和翻譯、激活MazEF途徑來誘發細菌PCD[3，49]。一方面可追求抗毒素快速降解，使對應毒素更易釋放。另一方面，設計抗毒素結構類似物與底物競爭性結合也是手段之一。但這些終歸是間接的，開發新型化合物直接靶向這些死亡途徑而非間接激活死亡途徑是新型抗生素研發的重要途徑。

4.2 干擾PCD抑制細菌抵抗能力

短期看PCD激活能殺傷部分細菌群，為病原菌治療提供思路。但根據在群體生成PCD的生物學原理，從長遠看會產生更多“公共利益”，而這些公共代謝物反向緩解壓力，使更多病原菌恢復菌量成為可能[50]。可見PCD效應與“公共利益”是非線性關系，把握二者平衡至關重要。從PCD基于群體合作的角度看，降低PCD以減少產生“公共利益”更有利于細菌殺傷。

4.2.1 干擾反饋回路以加強細菌殺傷

抗菌肽作用下已經被殺死的細菌能反向吸收環境中抗菌肽，降低濃度以減少殺傷[43]。由此提出的治療策略是干擾死菌反向吸收作用，該反饋回路強調抗菌肽治療期間死亡細菌對群體生存的保護。如使用肽佐劑阻礙死細菌的反向吸收，降低病原菌群體中死細胞對其余活細胞的保護能力，以提升抗菌藥物療效[43]。

4.2.2 群體感應抑制劑相關新型抗菌劑

病原菌中群體感應誘發PCD使得更多細菌群體得以生長、進一步產生感染，因此QS抑制劑這類新型抗菌劑研發成為阻斷PCD產生的重要手段之一。QS抑制劑的研發起源于不同微生物爭奪相同生態位，已知革蘭陰性菌的N-酰基高絲氨酸內酯（AHL） 可與革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌的細胞膜相互作用，降低外毒素產生，抑制其Agr系統表達[51]。近年來，臨床上研發QS抑制劑是防治銅綠假單胞菌定植和致病的主要方向之一，如設計LasR受體拮抗劑中斷級聯反應、降低病原體毒力[52]。Kalia等[53]從數據庫中篩選得到8個鉛類化合物，通過分子對接軟件模擬，發現這些化合物利用不同氨基酸殘基與烯酰還原酶FabI結合形成氫鍵以抑制AHL酰基鏈生成，從酶類藥物靶標角度為銅綠假單胞菌QS抑制劑的開發提供了可能。

QS小分子抑制劑可作為預防細菌致病性的潛在治療藥物，具有廣闊發展前景。表2羅列了通過抑制QS系統抵抗病原菌感染的物質名稱與作用方式等。

可見，QS抑制劑作為干擾PCD反饋回路的重要分支，主要通過影響生物膜形成來抵抗致病菌，在抗感染治療方面有卓越潛力。目前通過技術手段對QS分子抑制劑進行篩選成為主要趨勢，如成立數據儲存庫、開發新型靈敏發光測定法等，可快速高通量地對潛在抑制劑進行虛擬篩選，進而通過分析檢測數據評估其與擬定靶點的吻合程度[53，56，60]。

5 總結與展望

綜合上述內容表明，細菌PCD對于抗菌治療是一把“雙刃劍”，應合理把握平衡。在抗生素用藥的基礎上人為誘發細菌PCD或拮抗細菌QS通訊以抑制群體內部利他性質的PCD，使細菌群體更容易被殺傷；而值得注意的是PCD也能被病原菌加以利用作為其適應宿主環境生存進化的有力武器。

因而，需要推出新抗菌感染策略以應對耐藥性增強的病原菌和新病原菌。人工合成的化合物或從生物中分離得到的小分子抗菌蛋白具有良好治療潛力，它們穩定性高，耐藥風險低，對哺乳動物細胞無毒性，具有促凋亡活性，有望在不久的將來成為治療病原菌的候選藥物。目前，迫切需要深入研究來闡明這類抗菌藥物誘導細菌PCD的靶點。從機制而言，細菌PCD的產生路徑遠不如真核細胞PCD通路研究成熟。現在尚不清楚是否有任何基因或蛋白質與抗菌治療期間細菌的異質性行為有關。鑒于目前全基因組測序已成為廣泛使用的研究工具，獲取耐藥菌株基因組序列有助于尋找新的抗菌蛋白，也有利于篩選靶向致病菌PCD的新治療靶點。

致謝：感謝廈門大學公共衛生學院研究生王煒捷、朱偉偉對文章撰寫所提出的寶貴意見及建議。

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收稿日期：2022-11-08

基金項目：國家自然科學基金（No. 81971905；No. 82272349）

作者簡介：劉偉佳，女，生于1998年，在讀碩士研究生，主要研究方向為腸出血性大腸埃希菌中T3SS的作用，E-mail： 1319945429@qq.com.

*通信作者，E-mail： daiwang@xmu.edu.cn