山東某地區產氣莢膜梭菌的分子型別與耐藥特征

鐘佳鑫?王媛媛?白璐璐?鄭浩然?周海健?吳媛?盧金星

摘要：目的 分析山東省某地區臨床及動物中分離的產氣莢膜梭菌的分子型別及耐藥特征。方法 對山東省56株產氣莢膜梭菌進行PFGE、MLST分子分型、藥敏試驗和耐藥基因檢測，比較分析同一來源菌株內部和不同來源菌株間的型別和耐藥特征。結果 56株產氣莢膜梭菌分為53個PFGE型，有50株菌表現出獨特的型別。MLST分型將其分為46個ST型，其中40種ST型僅包含一株菌。本研究中菌株均對萬古霉素，美羅培南和頭孢西丁表現為敏感；對甲硝唑、青霉素、莫西沙星和氯霉素的耐藥率相對比較低，分別為3.57%、7.14%、8.93%和1.79%；然而，對克林霉素的耐藥率高達53.57%，人類來源菌株與動物來源菌株的耐藥譜呈現出較為明顯的差異。基于全基因組的耐藥基因分析顯示，所有56株產氣莢膜梭菌均攜帶mprF基因，其次是tetA（P） （98.21%），tetB（P） （87.5%）以及ermQ （51.79%）。結論 我國山東某地區臨床來源與動物來源產氣莢膜梭菌耐藥譜存在顯著差異，同一地區的菌株分子型別具有很強的多樣性。需要開展更全面的的系統監測為制定控制措施提供流行病學依據。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；脈沖場凝膠電泳分型；多位點序列分型；抗菌藥物敏感性；耐藥基因；分子流行病學

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Molecular typing and drug resistance characteristics of Clostridium perfringens in Shandong Area

Zhong Jiaxin， Wang Yuanyuan， Bai Lulu， Zheng Haoran ， Zhou Haijian ， Wu Yuan， and Lu Jinxing

（State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control， Institute of Infectious Disease Prevention and Control， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206）

Abstract? ?Objective? ?To analyze the molecular type and drug resistance characteristics of Clostridium perfringens isolated from clinics and animals in a region of Shandong Province. Methods? ?The molecular typing of PFGE and MLST， drug sensitivity tests， and drug resistance gene detection were performed on 56 strains of Clostridium perfringens in Shandong Province， and the phenotypic and drug resistance characteristics within and between strains of the same origin were compared and analyzed. Results? ? The 56 Clostridium perfringens strains were classified into 53 PFGE types， with 50 strains exhibiting unique phenotypes. The MLST typing classified them into 46 ST types， with 40 ST types containing only one strain. All strains in this study showed sensitivity to vancomycin， meropenem， and cefoxitin. Resistance rates to metronidazole， penicillin， moxifloxacin and chloramphenicol were relatively low. The resistance rates were 3.57%， 7.14%， 8.93%， and 1.79% respectively. However， resistance rates to clindamycin were as high as 53.57%， showing a more pronounced difference in the resistance profiles of strains of human versus animal origin. Genome-wide resistance gene analysis showed that all 56 Clostridium perfringens strains carried the mprF gene， followed by tetA（P） （98.21%）， tetB（P） （87.5%）， and ermQ （51.79%）. Conclusion? ? There are significant differences in the drug resistance profiles of Clostridium perfringens from clinical and animal sources in one region of Shandong， China. Molecular strains showed high diversity in the same region. More comprehensive and systematic surveillance is needed to provide an epidemiological basis for control measures.

Key words Clostridium perfringens; Pulsed-field gel electrophoresis typing; Multilocus sequence typing; Antimicrobial susceptibility; Drug resistance genes; Molecular epidemiology

產氣莢膜梭菌是一種在自然界中廣泛存在的革蘭陽性厭氧菌。該細菌在動物和人類中都能引起氣性壞疽、腸道疾病和食物中毒，是全球公認的最重要的胃腸道病原體之一[1]。其重要的致病機制是產生多種毒素和酶[2]。抗生素相關性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，AAD）在住院患者和社區中仍然是一個主要的醫療問題，住院患者中產氣莢膜梭菌作為AAD相關細菌的患病率為14.9%，位于第二[3-4]。近年來，產氣莢膜梭菌的耐藥性有所增加[5]，一些調查表明，大多數動物來源的產氣莢膜梭菌為多重耐藥菌株（MDR）[6]。人類來源的產氣莢膜梭菌多重耐藥菌株比例很低[7]。然而，對中國產氣莢膜梭菌耐藥性的研究尚且不足。

脈沖場凝膠電泳（PFGE）是最重要的檢測細菌基因型多樣性分子分型方法之一，由于其結果能夠檢測90%以上的細菌基因組，并且適用于廣泛的病原體，因此依舊被公認為是食源性病原菌分型的金標準[8]。本研究收集了2013—2020年山東地區一家三級綜合醫院從臨床標本中分離的菌株及山東地區3家養殖場分離的56株產氣莢膜梭菌，以脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）為分子工具并結合抗菌藥物敏感性檢測，旨在了解山東地區人與動物源產氣莢膜梭菌分離株的異同。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及基本情況

56株產氣莢膜梭菌來源于2017—2020年山東省某醫院抗生素相關腹瀉患者和山東某三家養殖場中的豬、牛和羊，人來源樣本按照AAD病例定義由臨床實驗室收集；動物來源樣本采集自新鮮的動物糞便；樣本均帶回本課題組實驗室檢測，經16S rRNA測序對分離菌株進行鑒定。PFGE標準Marker菌株H9812由國家致病菌識別網PulseNet China提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

藥敏試驗采用E-test條法，E-test條購自公司利飛馳，質控菌株產氣莢膜梭菌ATCC13124購自美國模式菌種收集中心，細菌基因組DNA的提取使用天根生化科技有限公司的試劑盒，DNA Marker、Premix Taq購于北京奧科生物工程有限公司，PCR儀（德國Senso Quest Labcycler公司），PFGE圖像形成使用Bio-Rad公司的脈沖場凝膠電泳儀和Gel Doc XR+ 凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養、鑒定及細菌基因組DNA提取

在血瓊脂平板上按照三區劃線原則進行接種，置于恒溫培養箱（37℃±1℃）在厭氧環境下培養18～24 h，采用16S rRNA測序進行產氣莢膜梭菌的鑒定。采用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取菌株DNA。

1.2.2 PFGE實驗和分析

參照國家致病菌識別網實驗室使用的革蘭陽性菌標準化PFGE分子分型方法，對分離純化的產氣莢膜梭菌進行DNA膠塊的制備，經限制性內切酶酶切后進行脈沖場凝膠電泳分型。電泳條件：電壓6V/cm，脈沖參數0.5～40 s，電泳22 h。利用BioNumerics軟件讀取并聚類分析PFGE電泳圖譜。

1.2.3 多位點序列分型

8個管家基因引物序列colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk和nadA參照PubMLST數據庫（https：//pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）。引物序列由北京奧科生物工程有限公司合成。

PCR反應總體積為25 μL，Premix Taq 12.5 μL，前后引物各0.5 μL，模板1.5 μL，無菌水10 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min，一個循環；94℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個循環；72℃延伸8 min，1個循環[9]。取4 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物陽性的，送至北京奧科生物工程有限公司進行雙向測序，將序列提交到PubMLST官網數據庫（https：//pubmlst.org/organisms/clostridium-perfringens）進行比對，確定每株菌株的等位基因號與序列型（ST）并提交新的等位基因與ST型。

1.2.4 藥敏實驗

采用E-test條法，以美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M100-S30， 2020文件和歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會（EUCAST）v.10.0， 2020文件作為折點判讀標準，對克林霉素、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、美羅培南、甲硝唑、青霉素和莫西沙星8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）進行檢測（萬古霉素的MIC在CLSI中未標明，以EUCAST中的折點作為判讀標準。其余7種抗菌藥物的MIC均以CLSI為為折點判讀標準。克林霉素（≥8 ?g/mL）、氯霉素（≥32 ?g/mL）、利福平（≥64 ?g/mL）、美羅培南（≥16 ?g/mL）、甲硝唑（≥32 ?g/mL）、青霉素（≥2 ?g/mL）、莫西沙星（≥2 ?g/mL）、萬古霉素（>2 ?g/mL）。質控菌株為產氣莢膜梭菌ATCC13124，購自美國典型培養物保藏中心。

挑取單克隆菌株接種于血瓊脂平板，37℃厭氧狀態下培養18～24 h，于布氏肉湯中將菌液濃度調整為3×108 CFU/mL。用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在添加5%羊血、5 mg/L氯化血紅素和1 mg/L維生素K1的布氏平板上，待平板表面水分吸收后，貼E-test試條。置于37℃厭氧狀態下培養18～24 h后取出，進行結果判讀，培養基表面水滴狀抑菌環指向的濃度值為檢測的MIC。

1.2.5 基于全基因組的耐藥基因分析

在注釋時，使用CARD數據庫中的工具軟件rgi將基因的蛋白序列分別數據庫進行比對，找出比對上的數據庫中對應序列，并得到對應的耐藥基因和耐藥基因相關信息。并設置參數“ ≥80% identity and ≥50% coverage”，比對上的基因描述于文中。

1.2.6 統計分析

耐藥譜構成比差異使用Pearson χ2檢驗或Fisher確切概率法進行檢驗，檢驗水準α為0.05。P＜0.05為統計學差異顯著。最終使用Fisher確切概率法檢驗結果。

2 結果

2.1 PFGE聚類分析

56株山東地區產氣莢膜梭菌共分為53個型別，其中3個型別包含2株菌，50個型別僅包含1株菌，即有50株菌表現出獨特的型別（圖1）。56株菌的PFGE圖譜相似性指數為35.6％～100％。通過PFGE分析，將56株菌分為2個主要類群即：“A”（19株）和“B”（37株），見圖1。這些菌株并沒有呈現出耐藥菌株聚為某一特定克隆群或抗生素相關性腹瀉菌株聚為某一克隆群，整體聚類特征表現出較強的多樣性。

這56株菌中37株來源于抗生素相關性腹瀉患者，共有36種帶型，Group 1包含兩個重復出現的帶型，在菌株17SD342和菌株17SD363中共有；19株來源于養殖場中的豬、牛和羊，Group 2（菌株SDY010與菌株SDY011）和Group 3（菌株SDY009與菌株SDY014）分別包含兩個重復出現的帶型。抗生素相關性腹瀉患者來源菌株和動物來源菌株并沒有存在相同的帶型。

通過菌株的背景信息和基因指紋圖譜結合分析，分離自兩位抗生素相關性腹瀉患者的菌株（17SD342、17SD363）具有100%的遺傳相似性，代表同一種PFGE型別，且前一組同屬ST466。這一組條帶完全一致的菌株分離自山東一家醫院，且兩位患者的就醫時間接近，懷疑在就醫過程中產氣莢膜梭菌存在潛在的傳播。分離自山東綿羊的菌株（SDY010和SDY011）與（SDY009和SDY014）同屬于ST479，分別具有100%的遺傳相似性，這兩組條帶完全一致的菌株來自同一家綿羊養殖場，提示在養殖場內可能存在產氣莢膜梭菌的傳播。

然而，整體PFGE結果提示不同宿主來源，差異較大，具有較強的遺傳多樣性。即使是分離自同一所醫院患者的菌株或分離自同一家養殖場的菌株也具有很強的遺傳多樣性。

本研究結果表明，PFGE和MLST在產氣莢膜梭菌分型方面均具有較高的分辨力。PFGE 類型與ST型別之間的一對一相關性表明，屬于同一ST型的一些分離株具有不同的PFGE型別，例如SDY009、SDY010、SDY011和SDY014同屬于ST479但被分為兩種不同的PFGE型別（圖1）；18SD078與SDY012同屬ST221但被分為兩種不同的PFGE型別；17SD155，17SD152，17SD154同屬ST62，但被分為3種不同的PFGE型別。而研究中相同PFGE分子型別的3組菌株（Group 1、Group 2、Group 3）分別屬于相同的ST型別（ST466、ST479、ST479）。因此，對于產氣莢膜梭菌來說，PFGE分型可能具有更高的分辨力，更適合用于產氣莢膜梭菌的溯源研究。

2.2 MLST分型

56株產氣莢膜梭菌MLST分型共發現46個ST型，具有很強的遺傳多樣性，其中33株分離株出現新序列型，共27個新序列型，占分離株的58.93％。優勢型別為ST479（5株），ST62（3株），ST221（2株），ST315（2株），ST372（2株），ST466（2株），其余40種ST型各1株。動物來源菌株和人來源菌株的分布并沒有呈現出明顯的差異或聚為不同的克隆群。其中動物來源的分離株優勢型別為ST479（5株），人類來源的分離株優勢型別為ST62（3株）。

使用BioNumerics軟件分析，得到最小生成樹（MST）（圖2）。根據參數（相鄰等位基因差異個數≤5，所包含的ST型≥3）[10]，本研究中屬于不同STs的山東來源產氣莢膜梭菌大部分（36株）聚在一起，表明按照此參數大部分山東地區的菌株相對親緣關系較近。其余菌株（20株）圍繞該克隆群呈散在分布，彼此之間存在較遠的遺傳距離（管家基因差異≥6）。但如果縮小相鄰等位基因差異個數，例如將參數調為相鄰等位基因差異個數≤3，所包含的ST型≥3，則呈現出多個克隆群，呈現出較強的多樣性。

2.3 產氣莢膜梭菌的藥敏情況和耐藥基因檢測

所有試驗菌株均對萬古霉素，美羅培南和頭孢西丁表現為完全敏感；對甲硝唑、青霉素、莫西沙星和氯霉素的耐藥率相對比較低，分別為3.57%、7.14%、8.93%和1.79%；然而，對克林霉素的耐藥率高達53.57%（圖3A）。同時本研究發現，山東地區人類來源菌株與動物來源菌株的耐藥譜存在顯著的統計學差異（P=0.006）（圖3B）。人類來源的部分菌株對莫西沙星、克林霉素、氯霉素耐藥，而動物來源的部分菌株對甲硝唑、青霉素、莫西沙星、克林霉素耐藥。按動物與人類來源分組的產氣莢膜梭菌耐藥譜見圖3B，無論物種，大多數菌株（63.16%與48.65%）都對克林霉素耐藥。對于人類來源的分離株，均對萬古霉素、美羅培南、甲硝唑、青霉素和頭孢西丁敏感，莫西沙星（5.41%）和氯霉素（2.70%）的耐藥率較低，而克林霉素的耐藥率（48.65%）則處于相對較高的水平。對于動物來源的分離株，均對萬古霉素、美羅培南、頭孢西丁和氯霉素敏感，對測試抗生素耐藥率由高到低依次為克林霉素（63.16%）、青霉素（21.05%）、莫西沙星（15.79%）、甲硝唑（10.53%）。本研究中菌株的多重耐藥率較低，多重耐藥菌株（對大于等于3類抗菌藥物耐藥[11]）的比例為3.57%（2/56），分別從綿羊（SDY007）和腹瀉患者（JN4）中分離得到，屬于ST479與ST443，SDY007對甲硝唑、莫西沙星、克林霉素；JN4對莫西沙星、克林霉素、氯霉素3種抗生素耐藥（圖1）。沒有分離株對4種及以上的抗生素有耐藥性（圖1）。

耐藥基因檢測結果顯示，56株產氣莢膜梭菌中肽類抗生素中mprF基因攜帶率最高，為100%（56/56），其他基因未攜帶；氨基糖苷類抗生素中AAC（6'）-Ie-APH（2"）-Ia基因攜帶率最高，為33.93%（19/56）；ANT（6）-Ib基因攜帶率為21.43%（12/56），其他基因未攜帶；大環內酯類/林可酰胺類/鏈陽霉素類（MLS）抗生素中ermQ基因攜帶率最高，為51.79%（29/56），ermA、ermB、ermT基因攜帶率分別為1.79%（1/56），8.93%（5/56），1.79%（1/56），其他基因未攜帶；林可酰胺抗生素中lnuP基因攜帶率為26.78%（15/56），其他基因未攜帶；酚類抗生素中fexA基因攜帶率為1.79%（1/56），其他基因未攜帶；惡唑烷酮類抗生素、苯酚類抗生素中optrA基因攜帶率1.79%（1/56），其他基因未攜帶；四環素類抗生素中tetA（P）、tetB（P）和tet44基因的攜帶率為98.21%（55/56）、87.5%（49/56）、21.43%（12/56），均存在較高的攜帶率。

3 討論

產氣莢膜梭菌是一種重要的食源性傳播病原體，是食物中毒最常見原因之一[4]。在美國產氣莢膜梭菌每年導致近100萬例食物中毒。同時研究表明，產氣莢膜梭菌存在于健康的養殖經濟動物中，如雞、牛、豬和羊等，并且可在零售市場的肉制品中分離出來[12-13]。因此，產氣莢膜梭菌是1種全球公認的食源性傳播的人畜共患病原體，食源性傳播和動物源性傳播是人類感染的主要來源。然而在中國對于不同宿主中的產氣莢膜梭菌分子特征研究依舊相對缺乏，需要利用PFGE和MLST分析其遺傳多樣性和種群結構，以提高對該病原體的全面認識，為進一步的監測和調查研究提供前提。

在本研究的PFGE分析中，確定了兩個水平的多樣性：一方面，56株來自臨床患者與經濟養殖動物的樣本共分為53個型別，這表明產氣莢膜梭菌在不同的宿主中具有極強的遺傳多樣性；另一方面，17株健康綿羊中分離的產氣莢膜梭菌共分為15種不同的PFGE型別（圖1），37株臨床抗生素相關性腹瀉患者中分離的產氣莢膜梭菌共分為36種不同的PFGE型別，這表明產氣莢膜梭菌在同一宿主內也具有很強的基因組多樣性。

從傳播鏈的角度來看，PFGE結果顯示，個別動物來源與人類來源菌株的親緣關系范圍較近，相似度高達90%，如18SD099和SDY013，18SD153和SDY022，17SD242和SDY012，推測這種病原體可能存在養殖動物和人類之間的傳播。同一家醫院中分離的菌株和同一家綿羊養殖場中分離的菌株分別出現了相同的PFGE分子型別，并且對應相同的MLST分子型別，推斷在小范圍區域內（AAD人群中和養殖綿羊中）可能存在菌株的克隆傳播。PFGE結果并不支持不同宿主（人與動物來源）之間鏈條傳播，但是鑒于時間間隔性和地域間隔性，日后可再進行一次大規模采集反映更加真實的情況。

產氣莢膜梭菌是一種多重耐藥病原體。近年來的國內外的研究表明在經濟養殖動物中，多重耐藥菌比例都極高[6，14]。青霉素已被農業農村部批準作為食品性動物生產的生長促進劑，并已用于控制革蘭陽性菌，包括產氣莢膜梭菌；甲硝唑雖不允許用于動物生產，但已明確收入國標31650中允許動物治療使用，這些飼養過程抗生素的添加可能是菌株耐藥率升高的原因。然而，在本研究中僅發現1株動物來源多重耐藥菌，這可能與本研究所選抗生素多偏向臨床用藥相關，也可能是由于不同地區養殖場抗生素使用情況不同。對于臨床分離株而言，抗生素的使用情況不同是不同地區產氣莢膜桿菌耐藥率具有較大差異的主要驅動因素。國外的耐藥情況較為樂觀。例如，在匈牙利、斯洛文尼亞和臺灣北部的一些研究表明，頭孢西丁、美羅培南和甲硝唑成功應用于產氣莢膜菌感染治療，只有少數菌株對青霉素（2.6%）或克林霉素（3.8%）耐藥。然而，在本研究中，發現在山東地區的人源性菌株對克林霉素有很高的耐藥性（48.65%）。此外，最近來自意大利的數據顯示，克林霉素的耐藥性在梭菌屬中超過20%[6-14]。事實上，克林霉素一直被認為是治療產氣莢膜梭菌感染的一線藥物。因此，產氣莢膜梭菌高克林霉素耐藥研究結果表明克林霉素作為經驗治療應引起重視。

本研究中，四環素耐藥基因（tet）和抗防御素基因（mprF）在產氣莢膜梭菌中檢出率極高，這與近年來的研究結果相一致[15]。四環素耐藥基因是該病原體中唯一廣泛傳播的AMR特異性基因，自20世紀80年代以來，編碼四環素外排蛋白的tetA（P）和tetB（P）是產氣莢膜梭菌中最常攜帶的抗性基因[15]。mprF基因（參與抗人類防御素）在所有產氣莢膜梭菌基因組中都是保守的，這與其在宿主腸道定植的能力有關。其同源物可以抑制氨基糖苷類臨床抗生素，如萬古霉素和慶大霉素，然而本研究中菌株對于萬古霉素完全敏感，這些菌株攜帶耐藥基因，但無耐藥表型，可作為耐藥基因的“儲存庫”。另外值得關注的是，產氣莢膜梭菌可從其所在的環境（如腸道）獲得新的AMR基因，前抗生素時代的菌株基因組并沒有編碼tet[16]，這揭示了產氣莢膜梭菌在過去80年的進化史上的抗生素選擇壓力。

然而，本研究依舊存在一些不足之處，還需不斷加大監測力度，補充菌株以擴大數據庫，將PFGE分子型別、MLST分子型別和產氣莢膜梭菌的耐藥特征進行關聯性分析，以期發現耐藥菌株是否存在優勢PFGE分子型別與MLST分子型別，進而預測菌株的耐藥流行趨勢并控制耐藥菌的傳播。

長期以來，由于產氣莢膜梭菌屬于條件致病菌，并未受到臨床重視，然而近年來該菌耐藥性逐步升高，嚴重時甚至導致院內的暴發感染，導致嚴峻的的公共衛生問題[17-18]，醫院應對產氣莢膜梭菌的耐藥菌監測和流行病學調查給予重視，本研究通過對山東地區的產氣莢膜梭菌菌株進行PFGE與MLST分型并結合耐藥表型和耐藥基因分析以期對臨床和動物養殖中在預防和治療該類細菌感染時有所幫助。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-11-16

基金項目：傳染病預防控制國家重點實驗室自主研究課題（No. 2021SKLID207）

作者簡介：鐘佳鑫，女，生于1997年，在讀碩士研究生，主要研究方向為產氣莢膜梭菌分子流行病學，疾病預防與控制，E-mail：

zhongjiaxin97@163.com

*通信作者，E-mail： lujinxing@icdc.cn