電針調(diào)控背根神經(jīng)節(jié)巨噬細胞浸潤改善紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛的機制研究

向宏春，張虹，李靜，龍漫，李 熳，蔡國偉*

1 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北 武漢 430022；2 湖北科技學院，湖北 咸寧 437100；3 華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖北 武漢 430030

化療所致的周圍神經(jīng)病變（chemotherapy induced peripheral neuropathy，CIPN）是由于化療藥物［如紫杉醇（paclitaxel）和奧沙利鉑等］產(chǎn)生的神經(jīng)毒性引起的周圍神經(jīng)病變［1］。紫杉醇是治療癌癥（如乳腺癌、肺癌和卵巢癌等）的有效化療藥物，但是會導(dǎo)致CIPN，介導(dǎo)疼痛性神經(jīng)病變，導(dǎo)致患者臨床用藥劑量減少，甚至停藥［2-3］。目前已知的紫杉醇作用機制是穩(wěn)定微管、阻斷有絲分裂并促進細胞死亡［4］。有研究表明，紫杉醇可誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達增加，使巨噬細胞募集到DRG，巨噬細胞釋放炎癥因子［如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等］介導(dǎo)紫杉醇誘導(dǎo)和維持外周痛覺超敏反應(yīng)［5］。雖然紫杉醇對周圍神經(jīng)系統(tǒng)的毒性嚴重影響患者生活質(zhì)量，但在臨床上紫杉醇仍然是常用的化療藥物［6］。因此，改善使用紫杉醇患者的生活質(zhì)量具有重要的意義。

有研究采用紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛模型，電針雙側(cè)足三里可促進脾臟、脊髓背角α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α 7nAChR）表達，降低脾臟、脊髓背角腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放，從而改善模型小鼠的機械痛覺過敏［7］。本研究以紫杉醇誘導(dǎo)疼痛模型小鼠為研究對象，觀察電針對小鼠DRG組織中MCP-1、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達和巨噬細胞浸潤的影響，探討電針對紫杉醇誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病理痛的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

選擇健康雄性SPF級成年C57小鼠30只，體質(zhì)量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006，合格證號：1100112211044731865。飼養(yǎng)條件為白光（8：00—20：00）和暗光（20：00—8：00）交替，室溫（23±2）℃，濕度50%左右，普通小鼠飼料，自由飲水進食。采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組、模型組、電針組，每組10只。本研究實驗方案經(jīng)華中科技大學實驗動物倫理委員會批準［審批號：〔2019〕倫審字（S1866號）］。

1.2 主要試劑與儀器

紫杉醇（美國MedChemExpress公司）；1∶1 000小鼠源IL-1β抗體（美國R&D Systems公司，生產(chǎn)批號：MAB5011）；1∶1 000兔源iNOS抗體（英國Abcam公司，生產(chǎn)批號：178945），1∶10 000小鼠源β-actin抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司，產(chǎn)品批號：sc-47778）；1∶200小鼠源CD68抗體（英國Abcam公司，生產(chǎn)批號：ab955）；兔源MCP-1抗體（美國Proteintech公司，產(chǎn)品批號：26161-1-AP）；Von Frey纖維絲測痛儀（美國IITC Life Science公司）；18 mm×0.15 mm一次性無菌針灸針（蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司）；冰凍切片機（德國徠卡公司）；正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；PVDF膜（美國Millipore公司），電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（北京六一儀器廠）；ECL顯色液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，型號：Omni-ECL?）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法 紫杉醇溶液按照說明書由5%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、40%聚乙二醇300（polyethylene glycol 300，PEG300）、5% Tween 80和無菌0.9% NaCl溶液配制而成，注射用紫杉醇濃度為0.5 mg/mL。在第1、3、5、7天分別通過腹腔注射2 mg/kg紫杉醇進行造模，最終總注射劑量為8 mg/kg；對照組注射相同體積的溶媒。

1.3.2 治療方法 電針治療使用電針儀（華佗牌），取雙側(cè)足三里（ST 36），在4次紫杉醇腹腔注射結(jié)束后（第9天）開始電針治療，頻率15 Hz，強度1 mA，30 min/次，1次/d，共治療7 d。電針組治療時采用自制的固定裝置束縛小鼠后再進行電針治療，保證小鼠無痛苦掙扎。對照組、模型組和電針組采用同樣的束縛固定方法。

1.3.3 觀察指標

1.3.3.1 機械痛覺閾值 采用“up and down”法測定足底機械閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）［8］。檢測前，所有小鼠在痛行為學測試前適應(yīng)測試環(huán)境30 min，然后測試基線機械痛覺閾值。具體如下：將Von Frey纖維絲垂直抵在小鼠后爪足底，使纖維彎曲5 s，小鼠后爪快速縮回或小鼠舔爪，即痛覺陽性行為。當觀察到陽性反應(yīng)行為時，使用下1個較低閾值的Von Frey纖維絲，當沒有出現(xiàn)陽性反應(yīng)時，使用前1個較高閾值的Von Frey纖維絲，反復(fù)進行5次測試并記錄。5 min后再重復(fù)上述測試并記錄，取2輪測試平均值為足底機械閾值。在造模第0天（即基線）、第8天造模結(jié)束后以及第11、13、15天電針治療后3 h進行檢測。

1.3.3.2 DRG組織病理學特征觀察 采用蘇木精和伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察各組DRG組織的病理特征。具體如下：行為學檢測完成后，通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）深度麻醉后進行取材。取3只麻醉后的小鼠，切開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室灌注37 ℃生理鹽水、4%多聚甲醛進行組織固定，冰上快速完整剝離腰段雙側(cè)DRG組織，一側(cè)用于冰凍切片的免疫熒光染色，一側(cè)用于石蠟切片的HE染色。把DRG組織放在10%福爾馬林緩沖液中固定48 h，再進行常規(guī)石蠟包埋。石蠟包埋的組織切片厚度約為5 μm，HE染色，用顯微鏡在400倍視野下拍照并獲取圖片。

1.3.3.3 DRG組織CD68和MCP-1免疫陽性面積百分比檢測 ① 采用4%多聚甲醛溶液固定腰段DRG組織8 h，分別用20%和30%蔗糖溶液在4 ℃冰箱梯度沉底。② 用OCT包埋DRG組織進行冰凍切片，厚度20 μm。③ 用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（pH 7.4）洗滌玻片3次，用驢血清配制的封閉液（10%）室溫封閉1 h，然后用0.01 mol/L PBS洗滌3次，滴加抗體CD68（1∶200）和MCP-1（1∶200）后，在濕盒4 ℃孵育過夜。④ 用0.01 mol/L PBS洗滌玻片3次，滴加相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1 h。⑤ 結(jié)束后滴加0.01 mol/L PBS（pH 7.4）沖洗，再滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）避光孵育5 min。⑥ 用0.01 mol/L PBS洗滌3次，滴加適量的抗熒光淬滅封裱劑，加上蓋玻片封片。⑦ 熒光顯微鏡下用200倍視野觀察和拍照獲取圖片。⑧ 采用ImageJ軟件打開免疫熒光染色圖片，以DAPI染色為參考，圈取DRG組織的輪廓，根據(jù)CD68和MCP-1免疫陽性信號，獲得CD68和MCP-1免疫陽性面積百分比。

1.3.3.4 DRG組織CD68、MCP-1、iNOS和IL-1β蛋白表達水平檢測 每組隨機選取4只小鼠，深度麻醉后，完整分離腰段雙側(cè)第3～5節(jié)段DRG組織，分別用液氮凍存?zhèn)溆谩＂?各組取小鼠DRG組織，用RIPA強裂解液充分勻漿裂解后高速離心（12 000 r/min）取上清液。② BCA試劑盒測上清液濃度。③ 加入蛋白上樣緩沖液，加熱到95 ℃使蛋白變性。④ 對蛋白樣品進行電泳分離，用300 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。⑤ 室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉60 min，分別加入CD68、MCP-1、IL-1β、iNOS和β-actin一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱孵育過夜。⑥ 第2天用0.01 mol/L TBST洗滌5 min，共5次。加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（1∶3 000）孵育1 h，0.01 M TBST洗滌5 min，共5次。⑦ 用增強型化學發(fā)光液（enhanced chemi-luminescence，ECL）對蛋白條帶顯色，暗室曝光成像。⑧ 采用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值（%）即為目的蛋白表達水平。

1.3.3.5 DRG組織巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 每組隨機選取3只小鼠，深度麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，于冰上快速斷頭處死小鼠，完整分離腰段雙側(cè)第3～5節(jié)段DRG組織，立即放入電鏡固定液（2.5%戊二醛）中室溫固定2 h，在4 ℃冰箱保存。① 用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗3次（每次15 min），0.1 mol/L PBS配制1%鋨酸在室溫（20 ℃）固定2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，乙醇梯度脫水。② 脫水后的組織依次放入丙酮∶環(huán)氧樹脂（2∶1）、丙酮∶環(huán)氧樹脂（1∶1）和環(huán)氧樹脂3種滲透劑，共滲透3次，在37 ℃溫箱滲透，12 h/次。③ 加入包埋劑環(huán)氧樹脂，在60 ℃恒溫箱聚合48 h。④ 切片使用超薄切片機（德國徠卡公司，型號：UC7）進行切片，切片厚度為60～80 nm。⑤ 鈾鉛染色液雙染色，室溫染色約15 min，室溫干燥過夜。⑥ 采用透射電子顯微鏡（日本日立公司，型號：HT7800）觀察，在1 000或1 500倍視野下進行拍照并獲取圖片。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料服從正態(tài)分布以（）表示，組內(nèi)多時間點比較采用重復(fù)測量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組治療前后PWMT比較

與對照組同一時間點比較，模型組第8、11、13、15天機械痛覺閾值明顯降低（P＜0.05）。與模型組同一時間點比較，電針組第11、13、15天機械痛覺閾值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組治療前后PWMT比較（） gTable 1 Comparison of PWMT in three groups before and after treatment （） g

表1 3組治療前后PWMT比較（） gTable 1 Comparison of PWMT in three groups before and after treatment （） g

注：與對照組同一時間點比較，1） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group at the same time, 1) P＜0.05; compared with the model group at the same time, 2) P＜0.05.

第15天0.87±0.26 0.23±0.221）0.53±0.192）組 別對照組模型組電針組n 10 10 10第0天1.01±0.11 0.95±0.18 0.97±0.19第8天0.87±0.25 0.17±0.161）0.19±0.171）第11天0.89±0.21 0.20±0.191）0.45±0.142）第13天0.83±0.22 0.18±0.171）0.50±0.182）

2.2 3組小鼠DRG組織病理學特征

HE染色圖顯示，對照組有少量的炎癥細胞，形態(tài)為近圓形、顏色為藍紫色；模型組炎癥細胞數(shù)量增加，呈浸潤聚集狀態(tài)，形態(tài)為近圓形、顏色為藍紫色；電針組聚集浸潤狀態(tài)的炎癥細胞數(shù)量較少，形態(tài)為近圓形、顏色為藍紫色。見圖1。

圖1 3組DRG組織HE染色圖（×400）Figure 1 HE staining of DRG tissue in three groups (×400)

2.3 3組DRG組織MCP-1、CD68免疫陽性面積百分比比較

與對照組比較，模型組DRG組織MCP-1、CD68免疫陽性面積百分比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組DRG組織MCP-1、CD68免疫陽性面積百分比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2、圖3和表2。

圖2 3組DRG組織MCP-1免疫熒光染色圖（×200）Figure 2 Immunofluorescence staining of MCP-1 in DRG tissues in three groups (×200)

圖3 3組DRG組織CD68免疫熒光染色圖（×200）Figure 3 Immunofluorescence staining of CD68 in DRG tissues in three groups (×200)

表2 3組DRG組織MCP-1、CD68免疫陽性面積百分比比較（） %Table 2 Comparison of MCP-1 and CD68 immunopositive areas of DRG tissues in three groups （） %

表2 3組DRG組織MCP-1、CD68免疫陽性面積百分比比較（） %Table 2 Comparison of MCP-1 and CD68 immunopositive areas of DRG tissues in three groups （） %

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the model group, 2) P＜0.05.

CD68 0.68±0.12 1.93±0.131）1.16±0.152）組 別對照組模型組電針組n3 3 3 MCP-1 12.26±3.10 23.77±4.611）12.87±2.032）

2.4 3組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4和表3。

圖4 3組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白條帶圖Figure 4 Protein band figure of MCP-1, CD68, IL-1β and iNOS in DRG tissues in three groups

表3 3組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平比較（）Table 3 Comparison of protein expression level of MCP-1， CD68，IL-1β and iNOS of DRG tissues in three groups （）

表3 3組DRG組織MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平比較（）Table 3 Comparison of protein expression level of MCP-1， CD68，IL-1β and iNOS of DRG tissues in three groups （）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the model group, 2) P＜0.05.

iNOS 104.34±18.61 201.63±13.851）141.76±8.222）組 別對照組模型組電針組n4 4 4 MCP-1 101.54±2.81 189.76±23.621）80.61.15±20.872）CD68 101.67±19.35 234.98±48.751）119.15±4.792）IL-1β 103.18±13.28 183.41±23.391）94.37±13.762）

2.5 3組DRG組織巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對照組DRG組織巨噬細胞形態(tài)呈近圓形，有圓鈍形突起；模型組DRG組織巨噬細胞形態(tài)呈扁平狀，有偽足，胞體比對照組大；電針組DRG組織巨噬細胞的形態(tài)呈近圓形，胞體比對照組大。見圖5。

圖5 3組DRG組織巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)比較Figure 5 Ultrastructure images of macrophages in DRG tissues in three groups

3 討 論

3.1 電針“足三里”可改善紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛模型小鼠疼痛程度

化療誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變是化療藥常見的毒副作用［9］。本研究采用反復(fù)紫杉醇腹腔注射模型研究化療藥所致周圍神經(jīng)病變的機制，通過疼痛行為學觀察模型動物的傷害性痛覺敏化現(xiàn)象。造模結(jié)束后（即第8天）的行為學結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠機械痛覺閾值明顯下降，表明紫杉醇可誘導(dǎo)小鼠的傷害性痛覺敏化。本研究結(jié)果顯示，與模型組同一時間點比較，電針組第11、13、15天機械痛覺閾值明顯升高，提示電針足三里可改善紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛模型小鼠的疼痛行為。這可能與以下原因有關(guān)：中醫(yī)學認為化療藥物所致疼痛病機主要為“不通則痛”。化療藥物雖可殺死部分腫瘤細胞，但也會影響正常機體氣機運行，使邪留局部臟腑經(jīng)絡(luò)，引起局部疼痛。足三里穴為扶正祛邪之要穴，針刺足三里可以疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)理臟腑，理氣行滯，調(diào)節(jié)機體回歸陰陽平衡狀態(tài)，從而減輕疼痛程度。

3.2 電針改善紫杉醇誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病理痛可能與調(diào)控DRG巨噬細胞浸潤和炎癥因子表達有關(guān)

本研究結(jié)果顯示，在紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛小鼠模型中DRG組織有大量巨噬細胞浸潤，MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白相對表達量明顯升高；與模型組比較，電針組DRG組織巨噬細胞浸潤明顯減少，MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達水平明顯下降，提示電針改善紫杉醇誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病理痛可能與調(diào)控DRG巨噬細胞浸潤和炎癥因子表達有關(guān)。疼痛的發(fā)生與神經(jīng)元的活動、炎癥反應(yīng)等諸多方面密切相關(guān)，巨噬細胞是神經(jīng)病理痛反應(yīng)的重要靶點，在紫杉醇誘導(dǎo)的神經(jīng)病理痛模型中，巨噬細胞浸潤DRG組織且釋放大量炎癥因子［10］，導(dǎo)致周圍傳入感覺神經(jīng)致敏，參與介導(dǎo)疼痛的發(fā)生和疼痛持續(xù)狀態(tài)［11］。電針雙側(cè)足三里穴可抑制巨噬細胞在DRG組織浸潤，抑制MCP-1、CD68、IL-1β和iNOS蛋白表達，從而改善模型小鼠的疼痛程度。這與ZHAO等［12］研究結(jié)果一致。此外，紫杉醇可使大量巨噬細胞浸潤DRG，DRG中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達水平明顯增加，通過RIP3/MLKL途徑啟動神經(jīng)元壞死性凋亡，介導(dǎo)神經(jīng)性疼痛［10］。MCP-1是一種趨化因子，在炎癥條件下調(diào)控單核細胞/巨噬細胞的遷移和浸潤，在神經(jīng)性疼痛中起重要作用［13］；炎癥因子（如IL-1β、iNOS和IL-6）可介導(dǎo)傷害性神經(jīng)元的興奮性，參與疼痛的發(fā)生和維持［14］。電針足三里穴可抑制IL-1β、iNOS和IL-6等炎癥因子的表達，使DRG組織交感神經(jīng)-感覺神經(jīng)耦合作用減弱，從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用［15］。這與本研究發(fā)現(xiàn)針刺足三里穴可通過抑制巨噬細胞浸潤以及炎癥因子表達，改善紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛的觀點相似。

4 小 結(jié)

電針足三里穴治療可有效改善紫杉醇誘導(dǎo)的疼痛小鼠模型的疼痛程度，其效應(yīng)機制可能是通過抑制DRG中MCP-1表達，下調(diào)巨噬細胞浸潤，減少IL-1β、iNOS和CD68等促炎因子分泌，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但是作用機制仍需要進一步研究。