殼聚糖及其衍生物在牙本質粘接修復中的研究進展

關嵐曦,蔡 辰,黃雨婷,李 陽,江千舟

牙本質粘接修復時,磷酸或粘接劑中的酸性單體使牙本質發生脫礦。粘接劑樹脂滲透進入蓬松多孔的三維膠原纖維網狀結構中,包裹裸露的膠原纖維形成混合層,它為牙本質粘接提供微機械固位力[1]。混合層是決定牙本質粘接修復成敗的重要因素,也是牙本質-樹脂粘接界面的薄弱環節[2]。研究表明若粘接劑無法完全滲透進入脫礦膠原纖維網底部和膠原纖維的空隙內[3-5],裸露的膠原纖維在殘留水分提供的濕潤環境下,極易受到內源性蛋白酶的水解,使得混合層的完整性被破壞,導致微滲漏的發生[1,5],最終影響牙本質粘接的耐久性[6]。因此,近年來有學者提出利用外源性膠原交聯劑進行牙本質生物改性。可以增強膠原纖維網機械性能,同時控制細胞外基質生物降解[7-9],提高牙本質-樹脂粘接界面的耐久性。殼聚糖及其衍生物作為天然交聯劑,被認為有助于提高牙本質-樹脂間的粘接效果,具有良好的應用前景,為臨床新材料研發提供了新方向。本文對殼聚糖及其衍生物其在牙本質粘接修復中的作用及其改善牙本質粘接效果的作用機制作一綜述。

1 殼聚糖及其衍生物的特性

1.1 分子特性及溶解性

殼聚糖(聚-2-氨基-2-脫氧-8-D-葡萄糖)是一種天然直鏈多糖,由甲殼素脫乙酰而得。甲殼素源于甲殼動物外殼、昆蟲表皮和真菌細胞壁[10-11],是自然界中僅次于纖維素外最廣泛存在的生物聚合物[12],具有低成本、低細胞毒性等特點[13]。脫乙酰度和分子質量(molecular weight,MW)是影響殼聚糖生物活性的重要因素,脫乙酰度越大或分子質量越小,則殼聚糖的生物活性越強且水溶性越大[12,14]。由于殼聚糖微溶于水而易溶于有機酸,臨床常用醋酸溶液溶解殼聚糖[12]。

殼聚糖含有易發生化學反應的活性官能團,對殼聚糖進行化學改性可以得到殼聚糖衍生物[15]。常見的殼聚糖衍生物包括季銨化殼聚糖、羧基化殼聚糖、酰化殼聚糖、糖酰化殼聚糖等[16]。通過對殼聚糖進行化學改性,引入功能基團或金屬納米粒子形成殼聚糖衍生物,可以改善殼聚糖的物理、化學性質,滿足特定研究領域的特殊性能要求。如通過殼聚糖的羧甲基化而獲得的羧甲基殼聚糖具有較高的pH敏感性、溶解性、可吸收性和可降解性,在藥物控釋過程中可用作高效的藥物輸送載體[16]。殼聚糖的氨基和羥基與有機酸或酸酐、酰氯等反應生成的季銨鹽殼聚糖作為免疫增強劑可以促進體液免疫和細胞免疫,利用其制作的疫苗具有毒性低、安全性好的特點[17]。

1.2 螯合性能

殼聚糖及其衍生物具有良好的螯合性能[11],在酸性條件下對不同的金屬離子(包括Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+)具有較強的螯合能力,在不同領域中被用于金屬離子的去除或回收[18]。殼聚糖的螯合性能主要依靠氨基上的氮原子與金屬陽離子發生反應來體現。由于在弱酸或酸性環境下氮元素上的自由電子才可與金屬離子發生反應[19],因此溶液的pH值會影響殼聚糖的可進行螯合作用的氨基數量,進而影響其螯合能力。殼聚糖與金屬離子發生螯合作用的模式可分為:①“橋”模型,1個金屬離子與殼聚糖多個氨基發生配位,其中氨基來自相同或不同聚合鏈的不同氨基葡萄糖單位;②“吊墜”模型,1個金屬離子僅與1個殼聚糖氨基發生配位[19-20]。殼聚糖的螯合性能已在口腔醫學領域得到應用,例如在根管預備時,殼聚糖可通過與羥基磷灰石中的鈣離子形成絡合物從而去除玷污層中的牙本質碎屑等無機組織[21]。Zhou等[22]研究表明,利用0.2%殼聚糖溶液進行根管沖洗可以去除根管內絕大多數的玷污層和牙體硬組織碎屑,使大部分牙本質小管口呈開放狀態。

1.3 抑菌性能

殼聚糖及其衍生物具有良好的抑菌性能[23],對細菌、真菌、病毒等病原微生物具有廣泛的抑菌活性[20,23-24]。殼聚糖及其衍生物的抑菌機制可能為:①靜電作用,殼聚糖C-2位上的氨基在pH<6時帶正電,可以通過靜電吸引與帶負電的細菌壁或細胞膜發生結合[13,25],導致細菌膜的滲透性和屏障性能受到損害,細菌內容物漏出而致死[10,26],同時可以阻斷細菌與外界的物質交換通道,抑制菌體生長[27];②抑制RNA和蛋白質的合成,低分子質量的殼聚糖可以進入細胞內部與病原體的DNA或RNA結合,阻礙DNA的轉錄和蛋白質的合成,以此達到抑菌的效果[25-27];③金屬離子螯合作用,具有螯合性能的殼聚糖及其衍生物可以與病原微生物細胞中的金屬離子和營養物質中的微量元素發生螯合,抑制細胞的生長代謝[25-27]。

殼聚糖的抑菌性能和抑菌模式受到多重因素的影響。內源性因素包括:殼聚糖的來源、濃度、相對分子質量、脫乙酰度等。外源性因素包括:環境pH值、微生物的種類、溫度等[20]。Gu等[28]的研究表明,1%高分子(MW>40 ku)殼聚糖對變異鏈球菌、放線菌和糞腸球菌的活性均有抑制作用。Stenhagen等[29]的研究表明,0.025%和0.050%的殼聚糖溶液均可減少變異鏈球菌生物膜的形成,且0.050%的殼聚糖溶液抑菌效果更強。Machado等[13]比較了殼聚糖及其一種衍生物(三氯生-殼聚糖)的抑菌效果,結果顯示殼聚糖組未能減少菌斑生物膜的生成。這可能是由于該實驗中殼聚糖以粉末形式直接加入粘接劑,而殼聚糖需要以有機酸作為溶劑以激活其氨基并發揮抑菌作用。三氯生-殼聚糖組在粘接即刻及6個月后均有良好的抑菌效果,且5%濃度組的抑菌效果明顯優于2%組,表明三氯生-殼聚糖的抑菌效果可能與濃度有關。

體外實驗已證實殼聚糖及其衍生物有較強的抑菌性能。然而其在臨床實踐中的可行性,即作為抑菌劑應用于牙本質粘接過程以減少或抑制繼發齲發生,需要更多臨床試驗驗證。

2 殼聚糖及其衍生物在牙本質粘接修復中的應用

2.1 作為牙本質粘接預處理劑

殼聚糖及其衍生物可以作為預處理劑,配合全酸蝕粘接系統或自酸蝕粘接系統進行牙本質濕粘接[30-31]、干粘接[28]或乙醇濕粘接[32]。殼聚糖及其衍生物溶液作為預處理劑,可以增強牙本質粘接強度[31],抑制牙本質內源性蛋白酶的活性[33],進而增強牙本質粘接界面的穩定性。然而,目前關于殼聚糖及其衍生物的使用濃度、預處理時間、沖洗方式等因素對臨床效果的影響仍少見文獻報道,其臨床操作的流程及參數有待統一規范。

2.2 與粘接劑混合應用

殼聚糖及其衍生物也可以與全酸蝕或自酸蝕粘接劑混合使用,不影響臨床常用的牙本質粘接修復流程,較為簡易方便。Neves等[34]的研究表明,將殼聚糖納米粒子加入粘接劑后,粘接強度沒有出現明顯的下降,且具有優異的抑菌性能和抑酶性能。Stenhagen等[29]研究表明,將殼聚糖的一種衍生物(丙烯酸甲酯殼聚糖)加入粘接劑中進行牙本質粘接修復,牙本質粘接強度與對照組差異無統計學意義,而將其加入復合樹脂進行粘接后所得的粘接強度出現了明顯下降。

3 殼聚糖及其衍生物改善牙本質粘接效果的機制

3.1 通過交聯作用增強牙本質膠原纖維的機械性能

粘接過程中,牙本質脫礦會造成Ⅰ型膠原纖維的裸露,形成脫礦牙本質基質(demineralized dentin matrix,DDM),力學性能顯著下降。若混合層未被樹脂浸潤,在咬合負荷下易被破壞,導致牙本質粘接修復的失敗[35]。殼聚糖是一種天然化學交聯劑,可與牙本質膠原纖維發生交聯作用,即通過其富含的大量游離羥基與氨基和牙本質纖維產生纖維內或纖維間的共價結合[33]。形成的微納米纖維交聯網絡可使處理后的膠原纖維的生物力學特性得到增強[33,36-38],同時,牙本質拉伸強度、斷裂延伸率、彈性模量等物理性能得到提升,樹脂-牙本質界面的壽命得到延長[39]。

Almeida Curylofo-Zotti等[40]研究表明,在激光或高速渦輪機處理后進行綠茶殼聚糖納米粒子處理,可以使皮革樣牙本質的顯微硬度得到顯著增強。Mohamed等[41]研究表明,殼聚糖納米粒子的應用可以提升牙本質-樹脂修復體的即刻微拉伸強度,且在粘接后3個月和6個月后均維持在較高水平。Paschoini等[31]研究表明,使用2.5%殼聚糖溶液作為預處理劑應用于全酸蝕粘接或自酸蝕粘接時,均可提升牙本質-樹脂修復體的即刻微拉伸強度,且在粘接后6個月微拉伸粘接強度沒有出現下降。然而,Baena等[30]研究表明,使用0.1%殼聚糖作為預處理劑應用于全酸蝕粘接或自酸蝕粘接時,牙本質-樹脂修復體的即刻和熱循環后的微拉伸強度相對對照組均沒有出現提高。此種差異的出現可能與使用不同殼聚糖溶液濃度、溶劑及不同的粘接系統有關。

3.2 抑制內源性蛋白酶活性,增強牙本質膠原纖維的抗酶解性能

內源性蛋白酶主要以酶原的形式存在于礦化的牙本質基質中,當礦物質被酸性單體溶解時酶原會被激活[6,33]。內源性蛋白酶包括基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)和半胱氨酸組織蛋白酶(cysteine cathepsins,CC)。MMP和CC在牙本質基質降解中發揮重要作用[35,42],降低牙本質-樹脂界面穩定性。因此,抑制MMP對膠原纖維的降解有利于提升牙本質混合層的完整性并減少微滲漏的發生[30],從而提高牙本質-樹脂粘接界面的耐久性。殼聚糖可通過直接抑制內源性蛋白酶的活性或通過增強牙本質交聯度間接避免內源性蛋白酶對牙本質-樹脂界面的水解。殼聚糖及其衍生物抑制內源性蛋白酶的機制可能為:殼聚糖及其衍生物與酶的(非)催化區的氨基酸發生交聯,引起酶的三維結構的不可逆改變,削弱酶識別和裂解底物的能力[30,33,43]。此外,在殼聚糖與牙本質膠原纖維形成分子內或分子間共價鍵時,膠原纖維分子間的交聯度提高,使得膠原纖維與酶的結合位點被隱藏,阻礙了酶與牙本質膠原纖維的結合[6],從而提升了膠原纖維對酶解的抗性[2,31,38,43]。

有研究表明,0.1%的殼聚糖溶液在原位酶譜實驗中展現出較強的牙本質內源性酶活性抑制能力;可抑制牙本質粉末中MMP-2和MMP-9的活性[33]。但也有研究發現,0.1%的殼聚糖溶液作為預處理劑應用在牙本質粘接時,MMP的活性沒有得到明顯的抑制,也沒有改善即刻或熱循環后的粘接強度[30]。導致該現象的原因可能是粘接系統中的酸性單體會重新激活內源性蛋白酶,或粘接系統與殼聚糖之間的相互作用削弱了殼聚糖的抑酶作用[30]。值得注意的是,交聯作用的發生受限于牙本質膠原纖維特定的氨基酸種類和數量。當交聯劑與全部特定氨基酸結合后,交聯劑提升牙本質膠原纖維的機械性能和抗水解性能的作用會停止,而被激活的內源性蛋白酶仍可發生酶解作用[35]。殼聚糖集交聯劑與膠原酶抑制劑的功效于一體,在交聯作用失效后仍能保護膠原纖維不被膠原酶降解破壞,因而具有更廣闊的應用前景。

3.3 大分子殼聚糖在選擇性纖維外脫礦技術中的應用

纖維外脫礦技術是由Mai等[3]提出的新型牙本質粘接技術。其原理為:牙本質中的Ⅰ型膠原纖維具有分子篩效應,使得分子質量>40 ku的螯合劑無法進入膠原纖維內空隙[44]。因此,大分子螯合劑可以選擇性地通過脫礦僅去除膠原纖維外的磷灰石晶體,從根本上避免了膠原纖維內晶體脫礦造成的MMPs激活及膠原纖維結構破壞[3,45-47]。多項研究證實高分子(MW>40 ku)殼聚糖或殼聚糖衍生物作為鈣離子螯合劑可實現選擇性纖維外脫礦,使膠原纖維保持直立蓬松的形貌并阻止混合層內MMP的暴露及活化[28,32,44,48]。此外,使用殼聚糖進行纖維外脫礦使干粘接的操作流程得以實現,從而進一步減少樹脂水解及MMP活化的風險,避免粘接的技術敏感性問題[3]。

4 總結與展望

綜上,殼聚糖及其衍生物因其具有良好的生物相容性、溶解性、抑菌性、螯合性及抑制內源性蛋白酶活性之作用,且其降解產物對人體無害,在醫療領域中的研究與應用日益廣泛、成熟。殼聚糖及其衍生物可通過提升膠原纖維的機械性能、抑制酶解和抑制粘接界面細菌的活性達到提升牙本質粘接的效果。此外,大分子量殼聚糖及其衍生物可對牙本質進行纖維外脫礦,從而使牙本質干粘接成為可能。殼聚糖及其衍生物的臨床應用效果受多種因素影響,如粘接系統、粘接流程的選擇及殼聚糖衍生物種類、濃度、處理時間等。不同因素對其作用效果的影響仍需進一步研究以為臨床實踐提供參考。