參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2活性的作用機制研究＊

黃海福，付艷麗，符必謙，賴思思

（1. 廣州中醫藥大學深圳醫院 深圳 518000；2. 深圳市中醫腫瘤醫學中心 深圳 518000）

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內第六大常見癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第三大原因[1]。HCC 因發病率高、惡性程度高、強侵襲與轉移、預后差而廣受關注[2]。2018 年全球肝癌發病人數達到84.1 萬人，死亡人數高達78.2 萬人，其中HCC占肝癌病例的75%-85%[3]。近年來，HCC 的發病率在世界范圍內持續上升，在治療方面，主要為局部和系統治療，包括經動脈放射栓塞、化療栓塞或消融治療及靶向免疫治療等[4-5]。中醫藥在治療HCC 方面具有較好的療效[6]，國醫大師、著名中醫腫瘤學家周岱翰教授根據多年的臨床經驗，創立了具有健脾養肝、軟堅消癥之效的經典抗肝癌方藥——“參桃軟肝方”，重視整體治療觀念，組方藥性平和、攻補適中、補正不留瘀、活血不傷正，集“扶正、化瘀、軟堅、生新”和保護、干預、調節于一體。在臨床中發現其具有改善肝功能、抑制肝癌、延長肝癌患者的生存期等功效[7]，但其具體作用機制尚未完全明確。故本研究主要探討了參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2活性的作用及機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人肝癌細胞HepG2株購于中科院細胞庫。

1.2 藥物與試劑

參桃軟肝片由西洋參10 g、桃仁15 g、當歸6 g、大黃10 g、丹參20 g、仙鶴草20 g、牛黃1 g 組成，飲片由上海中醫藥大學附屬龍華醫院提供。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、DMEM（含各種氨基酸和葡萄糖的培養基）高糖基礎培養基、青鏈霉素溶液（Penicillin-streptomycin solution，PS）、胰酶細胞消化液（含酚紅）購于HyClone 公司；四甲基噻唑藍（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒（LDH Assay Kit）購自Sigma 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑片劑（PhosStop）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl luorid，PMSF）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、極超敏增強型化學發光試劑（Enhanced chemiluminescence，ECL）化學發光試劑盒、SDS-PAGE 電泳液、Western blot 轉膜液、蛋白分子量標準（Marker）購自碧云天公司；RNA 提取試劑盒、互補脫氧核糖核酸（complementary DN，cDNA）反轉錄試劑盒、反應混合物（Master Mix）等Real-time PCR試劑購自Roche公司。

1.3 儀器

CO2 恒溫細胞培養箱ESCO（CCL-170B-8）、A2 型二級生物安全柜ESCO Airstream（AC2-8S1）、酶標儀TECAN（M200 PRO）、旋轉蒸發儀上海賢德實驗儀器有限公司（XD-2000A）、冷凍離心機Hettich（MIKRO 200R）、電泳儀BIO-RAD（PowerPac Basic）、電轉儀BIORAD（170-3940）、化學發光成像儀GE Healthcare（AM600），實時熒光定量PCR儀Roche（LC96），梯度PCR儀Gene Atlas（G02），去離子水儀Milli-Q（Direct 8）。

1.4 參桃軟肝方的提取

取西洋參10 g、桃仁15 g、當歸6 g、大黃10 g、丹參20 g、仙鶴草20 g 加入10 倍（810 mL）Mili-Q 水大火燒開后轉小火煎煮30 min，倒出藥液。加入8倍（720 mL）Mili-Q水大火燒開后轉小火煎煮30 min，合并煎液，加入人工牛黃1 g 溶解，用濾紙過濾得濾液。將濾液用1000 r/min-1離心15 min 后，取上清。將上清用旋轉蒸發儀濃縮后，氮吹吹干，最終得到藥物重量為24.665 g，得率為34.739%，保存于-20℃冰箱。稱取100 mg參桃軟肝方水提物，加入1 mL DMSO溶解，制成100 mg·mL-1母液備用，在文章均稱為參桃軟肝方。

1.5 乙醇沉淀法分離參桃軟肝方醇提上清和沉淀

將參桃軟肝方水提物加入乙醇至75%，放入4℃冰箱混勻提取過夜。將參桃軟肝方提取液1000 r/min-1離心15 min 后，取上層為參桃軟肝方醇提上清，下層為參桃軟肝方醇提沉淀，分別將參桃軟肝方上清和沉淀氮吹干，用DMSO溶解上清和沉淀，在文章均稱為參桃軟肝方醇提上清和沉淀。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測人肝癌細胞HepG2的活性

將人肝癌細胞HepG2 在含10% 胎牛血清的DMEM 培養液中培養，待細胞長至對數生長期時，將細胞按照1×104個/皿接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養箱培養24 h。分別按照空白對照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）或按照空白對照組、參桃軟肝方（1000 μg·mL-1）組、參桃軟肝方（1000 μg·mL-1）+不同濃度抑制劑組、不同濃度抑制劑組進行加藥，于37℃、5% CO2培養箱培養24 h。棄去上清，每孔加入新鮮配制的MTT溶液（5 mg·mL-1）20 μL，于37℃、5% CO2培養箱繼續培養4 h，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，在搖床上輕輕搖晃5 min，用酶標儀測定490 nm處的各實驗組的吸光度（OD490），計算各組細胞的存活率。

2.2 LDH 活性檢測試劑盒檢測人肝癌細胞HepG2 的LDH釋放

將對數生長期的人肝癌細胞HepG2，按照1×104個/孔接種于96 孔板中，于37℃、5% CO2培養箱培養24 h。分別按照空白對照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）干預24 h，取細胞上清進行LDH釋放檢測。

2.3 Real-time PCR 檢測人肝癌細胞HepG2 中IL-1β基因的mRNA表達

將對數生長期的人肝癌細胞HepG2，按照1×105個/皿接種于直徑6 cm 的培養皿中，按照空白對照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）干預24 h。用TRIzol 提取總RNA，測RNA 的濃度。使用cDNA 反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA。在Light Cycle 96 real-time PCR 平臺，采用SYBGREEN PCR Master Mix 試劑盒，檢測IL-1β 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因mRNA 表達，引物序列為：IL-1β（前引物5’-CACGATGCACCTGTACGATCA-3’，后引物5’-GTTGCTCCATATCCTGTCCCT-3’）、GAPDH（前引物5’-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，后引物5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’）。將IL-1β 基因的mRNA 表達水平歸一化至內參基因GAPDH。用雙ΔCt法計算IL-1β基因的相對表達。

2.4 Western blot 檢測人肝癌細胞HepG2 中Cleavaged Caspase-1、Akt、ERK、P-ERK、Caspase-3、PARP、Bcl2、Bax蛋白表達

將處于對數生長期的人肝癌細胞HepG2 按照1×105個/皿接種于6cm 培養皿中，培養24 h 后，按照空白對照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）分別干預24 h。提取細胞總蛋白，用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。加入上樣緩沖液（Loading buffer）后于95℃蛋白變性5 min。以20 μg 的蛋白量分別進行電泳，電泳完畢后進行，按照0.25 A，1 h將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。轉膜完畢后，將轉好的膜放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉4 h，取出用PBST 清洗3 次，每次5 min。用特異性的一抗Cleavaged Caspase-1 或Akt 或ERK 或P-ERK 或Caspase-3 或PARP 或Bcl2 或Bax 或GAPDH，1:1000 稀釋后，于4℃孵育過夜。第2 天將PVDF 膜取出PBST 清洗3 次，每次5 min，放入對應的二抗，常溫孵育2 h 后磷酸緩沖液+聚山磷脂-20（Phosphate buffered saline+tween-20，PBST）清洗3 次，每次5 min，最后將PVDF 膜放入顯影液中（A 液∶B 液=1∶1），放入化學發光成像系統中進行顯影以及拍照。使用Image J軟件進行灰度值分析，以GAPDH為內參，計算蛋白的表達量。

2.5 統計方法

所有實驗均重復3 次以上，使用GraphPad Prism 5軟件進行作圖分析，實驗數據采用均值±標準差（±s）表示，組間數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或t檢驗進行組間比較，當P<0.05 時為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2活性的影響

如圖1所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組，細胞活性分別降為92.61%±5.06%、60.06%±8.03%、36.31%±4.04%，其中300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.001）。以上結果表明，隨著參桃軟肝方濃度的增加，人肝癌細胞HepG2 活性的抑制率顯著升高，并具有濃度依賴性。說明參桃軟肝方能有效抑制人肝癌細胞HepG2的活性。

圖1 參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2活性

3.2 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2 乳酸脫氫酶（LDH）釋放的影響

細胞LDH 的釋放，是衡量細胞毒性的重要指標。如圖2所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組，細胞LDH 的釋放含量分別為空白對照組的1.08±0.02、1.12±0.02、1.85±0.42 倍，其中1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組與空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。以上結果表明，高濃度參桃軟肝方能促進人肝癌細胞HepG2中LDH 的釋放，對人肝癌細胞具有一定的毒性作用。

圖2 參桃軟肝方促進人肝癌細胞HepG2中LDH釋放

3.3 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2 焦亡標志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1表達的影響

如圖3所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組下調IL-1β基因的mRNA 表達，差異具有統計學意義（P<0.05）。與空白對照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組降低Cleavaged Caspase-1 的蛋白表達，差異具有統計學意義（P<0.01）。以上結果表明，高濃度參桃軟肝方能抑制人肝癌細胞HepG2 焦亡標志物IL-1β 和Cleavaged Caspase-1 的表達。說明參桃軟肝方降低肝癌細胞活性，很可能通過阻斷細胞焦亡過程起作用的。

圖3 參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2焦亡標志物IL-1β和Clevaged Caspase-1的表達

3.4 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2 中Akt/ERK 信號通路的影響

如圖4所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組，降低Akt 蛋白的表達，差異具有統計學意義（P<0.05），而ERK 及其磷酸化表達未見明顯變化。以上結果表明，參桃軟肝方能抑制人肝癌細胞HepG2 中Akt 信號傳導，而不影響ERK及其磷酸化。說明抑制Akt蛋白表達及其信號傳導是參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性的重要分子機制。

圖4 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2中ERK和Akt蛋白表達的影響

3.5 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2 凋亡信號通路的影響

如圖5所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預組上調Caspase3蛋白的表達，差異具有統計學意義（P<0.05），而PARP、Bcl2、Bax 蛋白表達量未見明顯改變。以上結果表明，參桃軟肝方很可能激活人肝癌細胞HepG2中Caspase3 依賴的凋亡相關信號通路，促進Caspase 3蛋白表達是參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性的重要分子機制。

圖5 參桃軟肝方對人肝癌細胞HepG2中Caspase3、PARP、Bcl2、Bax蛋白表達的影響

3.6 凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK 信號通路抑制劑對參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2活性的影響

如圖6所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方能有效抑制細胞活性，差異具有統計學意義（P<0.001）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2 活性沒有顯著的影響。以上結果表明，參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2 細胞活性，很可能與細胞凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死及PI3K/Akt/MAPK信號傳導無關。

3.7 參桃軟肝方醇提上清和沉淀對人肝癌細胞HepG2活性的影響

為了進一步研究參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性的有效成分，通過乙醇沉淀的方法，分離了參桃軟肝方醇提上清和沉淀。如圖7 所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1l、3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清干預組，對細胞活性的成活率分別為96.75%±15.51%、82.10%±21.25%、80.97%±5.05%、46.42%±6.55%，其中3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清干預組與空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1、3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀干預組，細胞活性分別降為100.12%±9.89%、90.34%±4.42%、87.71%±15.82%、45.20%±4.91%，其中3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀干預組與空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。以上結果表明，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清和沉淀對人肝癌細胞HepG2活性的抑制率達到50%左右，參桃軟肝方在1000 μg·mL-1時細胞活性就降到50%左右，說明參桃軟肝方抑制肝癌細胞的活性優于參桃軟肝方醇提上清和沉淀。

圖7 參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細胞HepG2活性

3.8 凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK 信號通路抑制劑對參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細胞HepG2活性的影響

如圖8所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清能有效抑制細胞活性，差異具有統計學意義（P<0.05）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對參桃軟肝方醇提上清抑制人肝癌細胞HepG2活性沒有顯著的影響。

圖8 凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號通路抑制劑對參桃軟肝方醇提上清抑制人肝癌細胞HepG2活性的影響

如圖9所示，在人肝癌細胞HepG2上，與空白對照組相比，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀能有效抑制細胞活性，差異具有統計學意義（P<0.001）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對參桃軟肝方醇提沉淀抑制人肝癌細胞HepG2活性沒有顯著的影響。

圖9 凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號通路抑制劑對參桃軟肝方醇提沉淀抑制人肝癌細胞HepG2活性的影響

以上結果表明，參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細胞HepG2 細胞活性，很可能與細胞凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死及PI3K/Akt/MAPK 信號傳導無關。

4 討論

HCC 是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關死亡的主要原因[8]。肝癌起病隱匿，潛伏期長、惡性程度高、生存期短、生存質量差、且治療棘手素有“癌中之王”之稱[9]。HCC 的發生與乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、酒精或進食含黃曲霉素的食物等暴露接觸高度相關[10-11]。另外，肥胖、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病與非酒精性脂肪性肝病也被逐漸成為HCC的危險因素[12-13]。HCC五年內的復發率高達50%-80%，而五年生存率低于5%[14-15]。目前，對于肝癌患者主要采取外科手術、肝動脈栓塞化療、微創治療、分子靶向治療等方法，雖然近年來診斷和治療技術取得較大發展，但因其復發轉移率高，肝癌患者的5年生存率仍較低[16-17]。

近年來，隨著中醫藥的不斷進展，在腫瘤治療方面，中醫藥聯合手術、放療、化療、分子靶向及免疫治療，可以改善癥狀，減少治療后復發轉移，延長生存期[18-19]。現代研究顯示，中藥可以調節微環境中各類免疫細胞，從而改善腫瘤免疫的微環境，增強抗腫瘤作用，許多中藥復方通過多途徑、多靶點、多效應發揮抗腫瘤轉移的功效[20-21]。因此，從中醫藥中發掘治療腫瘤轉移的有效方藥意義重大。肝為剛臟，主升主動、主疏泄，喜條達而惡抑郁，肝藏血，體陰而用陽。國醫大師、著名中醫腫瘤學家周岱翰教授認為，本病發生的病因病機是因邪毒內聚，肝失疏泄，致肝氣郁滯，郁而化火，郁火內灼，耗傷陰血，使肝陰耗損，肝血不藏而妄行，肝旺克脾則脾氣虛損，肝損及腎則腎水虧枯[22]。在臨床實踐中發現“參桃軟肝方”具有改善肝功能、抑制肝癌、延長肝癌患者的生存期等功效，但其具體作用機制尚不明確[23-24]。

研究發現參桃軟肝方能顯著抑制人肝癌細胞HepG2 的活性及LDH 的釋放，增加細胞毒性，對肝癌細胞具有較好地殺傷作用。經過進一步的研究發現，參桃軟肝方通過下調Akt 蛋白的表達，上調Caspase3的表達。因此，參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性的機制很可能是依賴于Akt 的下調和Caspase3 的激活。而Akt 和Caspase3 廣泛參與了細胞的程序性死亡。細胞程序性死亡是一種保守的細胞自殺進化過程，對真核生物的發展和完整性至關重要，與多種疾病有關，包括發育障礙、免疫缺陷、自身免疫疾病、神經退行性變和癌癥[25]。細胞程序性死亡的傳統方式主要有凋亡、自噬、壞死性凋亡，新發現的有細胞焦亡和鐵死亡等[26]。研究發現參桃軟肝方降低人肝癌細胞HepG2中焦亡標志物IL-1β 和Clevaged Caspase-1 的表達，說明參桃軟肝方降低肝癌細胞活性，很可能不是通過促進細胞焦亡，而是抑制細胞焦亡。進一步選用細胞凋亡抑制劑Z-VAD、自噬抑制劑Wortmanin、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1、細胞壞死抑制劑Necrostatin-1 對參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性進行干預，探討不同類型細胞程序性死亡在參桃軟肝方抗肝癌中的扮演的角色。實驗結果表明，Z-VAD、Wortmanin、Ferrostatin-1、Necrostatin-1對參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2活性無影響，說明參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性很可能與細胞凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死無關。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路通過多種細胞機制調控多種生物過程，與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡有著密切的聯系，共同調控細胞程序性死亡[27]。在腫瘤疾病中，通過調控MAPK 信號通路抑制腫瘤細胞的生存能力和遷移能力，促進腫瘤細胞的凋亡[28]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一個脂質激酶酶的大家族，當PI3K 被激活后，進一步催化磷酸化磷脂酰肌醇（PIP2）和磷脂酰肌醇3（PIP3），可啟動下游信號通路如Akt的激活，參與細胞生長、增殖、自噬和凋亡[29-30]。PI3K/Akt是最常見的致癌信號通路之一，MAPK 信號通路也在腫瘤細胞的生長和分化中發揮重要作用[31]。而參桃軟肝方抑制了PI3K/Akt/MAPK 信號通路中核心信號分子Akt 的表達，說明阻斷PI3K/Akt/MAPK 信號傳導很可能是參桃軟肝片抑制肝癌細胞活性的重要機制分子之一。因此，進一步選用PI3K/Akt 及MAPK 相關信號通路的抑制劑，檢測其對參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性的影響。實驗結果表明，LY294002、Akti、MEKi、JNKi 等PI3K/Akt/MAPK 相關抑制劑對參桃軟肝方抑制人肝癌細胞HepG2 活性的沒有明顯影響，參桃軟肝方抑制肝癌細胞活性很可能與PI3K/Akt/MAPK 信號傳導不是直接相關可能是通過AKT 相關的其他調控的上下游起作用的。

目前，中醫藥抗腫瘤研究多集中在中藥單藥、單藥提取物、單體成分等方面，而中藥復方對于抗腫瘤的研究較少。中藥復方具有復雜的活性成分及作用靶點，在抗腫瘤治療中對增加現有治療的療效、減輕毒副作用、調節免疫力等方面有獨特的優勢。參桃軟肝方主要由西洋參、桃仁、當歸、大黃，丹參、仙鶴草、人工牛黃組成，通過傳統水提得到參桃軟肝方，為了進一步發現其有效組分，通過乙醇沉淀法，將總體物分離成兩部分，即醇提上清和沉淀，發現參桃軟肝方醇提上清和沉淀能抑制肝細胞活性。凋亡、自噬、鐵死亡、細胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號通路的抑制劑同樣對醇提上清和沉淀抑制人肝癌細胞活性無明顯影響。說明參桃軟肝方傳統水提總提物抑制肝癌細胞活性的作用優于醇提上清和沉淀。提示，參桃軟肝方的醇提上清和沉淀對抗肝癌作用可能存在協同作用。

本研究局限性有兩點：第一是沒能找到參桃軟肝方抑制Akt 信號的上下游相關因子，后續實驗需進一步深入研究其作用機制；第二是沒能發現參桃軟肝方抗肝癌的主要活性成分，后續實驗需要進一步優化提取工藝，明確主要活性成分，為參桃軟肝方的進一步開發應用提供科學依據。

因此，得出以下結論：參桃軟肝方具有抑制肝癌細胞活性抗肝癌的作用，其作用機制可能與自噬、壞死性凋亡等程序性死亡方式無關；參桃軟肝方抑制Akt 蛋白表達和促進Caspase3 蛋白表達，但進一步研究發現不是通過經典PI3K/Akt/MAPK 信號傳導通路抑制細胞活性，我們推測可能是通過Akt 的其他上下游蛋白起作用的；參桃軟肝方降低焦亡標志物IL-1β和Cleavaged Caspase 1 表達，很可能阻斷細胞焦亡過程。另外，本研究發現參桃軟肝方比醇提上清和沉淀抗肝癌活性好，其醇提上清和沉淀很可能存在協同抗肝癌的作用。