安賽蜜對大鼠的亞慢性毒性

鄭思雨 滕晶晶 楊同金 王 巖 夏 新 鮑軍輝

(安徽省疾病預防控制中心, 安徽 合肥 230601)

安賽蜜甜味純正而強烈,為蔗糖的200倍,對光、熱穩定,pH適用范圍較廣(pH為3～7)[1]。作為第4代合成甜味劑,安賽蜜在體內不代謝、不蓄積,可以單獨使用,也可以與其他甜味劑混合使用并產生很強烈的協同效應,被認為是最有前途的甜味劑之一[2]。目前,普遍使用雙乙烯酮和氨基磺酸合成安賽蜜,其原料來源廣、生產成本低,適用于連續的工業化生產[3-4]。GB 2760—2014中規定了安賽蜜作為甜味劑允許使用的類別和最大使用量[5]。而食品中超范圍、超限量使用甜味劑,濫用復合甜味劑等問題比較突出,已成為高度重視的社會問題[6]。

近年來,人們對食品添加劑的應用越來越重視,對安賽蜜在各食品中含量檢測及其風險評估的研究也越來越多[7-10]。歐洲食品安全局(EFSA)及糧農組織/世衛組織食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)對安賽蜜作為食品添加劑的安全性已經過嚴格的風險評估,但中國對安賽蜜食用的安全性較少有報道,對其連續的、長期的食用安全性及相關毒理學評價也缺乏相應研究。隨著安賽蜜生產工藝的不同及技術革新,安賽蜜的安全性及其與其他甜味劑的協同使用在長期食用下是否會對人體產生影響仍值得深究[11-12]。

研究擬依據GB 15193.13—2015《食品安全國家標準 90天經口毒性試驗》,旨在通過大鼠的90 d經口毒性試驗探討安賽蜜作為食品添加劑的安全性以及得出未觀察到有害作用劑量(NOAEL)值,以期為正確認識安賽蜜及食品添加劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

健康離乳SD大鼠:4周齡,80只(雌雄各半),清潔級,動物質量合格證號20200812AaZZ0619000686(雌性)、20200812AaZZ0619000206(雄性),試驗動物使用許可證號為SYXK(皖)2019-011,生產許可證號為蘇飼證(2019)01008,浙江維通利華實驗動物技術有限公司;

安賽蜜:≥99%,安徽維多食品配料有限公司;

生化分析儀試劑:美國貝克曼庫爾特有限公司;

血常規分析試劑:日本Sysmex(希森美康)株式會社;

血凝儀試劑:南京瑞麥科技開發有限公司;

尿液分析試劑:桂林優利特醫療電子有限公司;

全自動生化分析儀:AU480型,美國貝克曼庫爾特有限公司;

五分類血液分析儀:2000i型,日本Sysmex公司;

半自動血凝儀:AYW8001型,南京瑞麥科技開發有限公司;

尿液分析儀:330型,桂林優利特醫療電子有限公司;

多功能酶標儀:Spectramax M2e型,美國MD公司;

全封閉式組織脫水機:ASP200S型,德國Leica公司;

包埋機:BMJ-3型,中威電子儀器有限公司;

石蠟病理切片機:RM2126KT型,德國Leica公司;

顯微鏡:Eclips Ci型,日本Nikon公司;

電子天平:PB403-S/FACT型,瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物及分組 80只大鼠按性別、體重隨機分成4組,每組20只,雌雄各半,單籠飼養于安徽省疾病預防控制中心動物房屏障環境中,溫度20～25 ℃、濕度50%～70%。所有動物試驗前進行適應性飼養5 d,試驗期間大鼠單籠飼養,自由飲水和攝食。

1.2.2 受試物劑量選擇及給予方式 分別設高、中、低3個劑量組,根據WHO聯合食品添加劑專家委員會推薦的安賽蜜日均最大攝入量為15 mg/kg,以推薦攝入量的300倍,即4 500 mg/kg體重為高劑量組,中、低劑量分別為1 500,500 mg/kg體重(相當于人體推薦攝入量的100,33.3倍),另設一個陰性對照組,共4個劑量組。采用灌胃方式經口染毒,灌胃容量為10 mL/kg體重,每日定時染毒一次(每周灌胃6 d),持續90 d。

1.2.3 指標測定

(1) 一般觀察:觀察動物的一般表現和中毒體征等,試驗期間,前4周每周稱體重2次,之后每周稱體重1次,每周稱量一次飼料,計算飼料消耗和體重增長情況。

(2) 尿液測定:試驗結束時,動物禁食16 h后稱重,采集尿液,檢測尿蛋白(PRO)、尿比重(SG)、酸堿度(pH)、葡萄糖(GLU)以及隱血(BLD)。

(3) 血液學測定:麻醉取血,檢測紅細胞數(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、白細胞數(WBC)及其分類計數(中性粒、淋巴、單核、嗜酸、嗜堿)、血小板計數(PLT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。

(4) 血液生化測定:采血進行生化指標檢測,包括肌酐(Cr)、血糖(Glu)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、尿素、氯、鈉及鉀含量。

(5) 臟體比:肉眼觀察大鼠體表、體腔及臟器,稱量腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、附睪、子宮與卵巢的絕對重量,計算臟器系數。

(6) 組織病理學檢查:對腦、甲狀腺、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、結腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、睪丸及膀胱等臟器做組織病理學檢查。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 一般臨床觀察、動物體重增長量、總攝食量、總食物利用率

由表1可知,試驗期間雌性陰性對照組大鼠及雄性中、高劑量組大鼠各死亡1只,各劑量組其余動物染毒期間未見明顯中毒體征和其他方面改變。受試物以高、中、低劑量進行大鼠灌胃染毒90 d,各組動物體重增長量、總攝食量、總食物利用率與對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05),認為安賽蜜喂養大鼠90 d對其體重增長、攝食量和食物利用率無影響。

表1 安賽蜜對大鼠體重增長量、總攝食量、總食物利用率的影響

2.2 血液學檢測

試驗結束對各劑量組雌、雄大鼠的血液學指標進行檢測,由表2可知,僅雄性大鼠低劑量組血紅蛋白濃度和雌性中劑量組血小板計數與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),各劑量組之間也未表現出明顯的劑量—反應關系。其余各項指標與對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05),認為安賽蜜對大鼠血液學指標無影響。

2.3 血生化指標檢測

由表3可知,各劑量組雌、雄大鼠的血清生化指標結果僅雌性動物低劑量組總膽固醇與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。這可能是由于安賽蜜只提供甜味不提供能量,只在味覺上得到甜的感知,使得大鼠進一步增加飲食獲得飽腹感,進而導致總膽固醇含量升高[13]。其余各項指標與對照組相比差異均不明顯(P>0.05),各劑量組血生化指標均在正常范圍內。

表3 安賽蜜對大鼠血生化指標的影響?

2.4 尿液檢測

試驗結束對大鼠尿液進行檢測,由表4可知,各劑量組雌、雄大鼠的尿常規指標與對照組相比差異均無顯著性差異(P>0.05),各項指標均在正常范圍內,提示安賽蜜對大鼠尿常規無明顯影響。

表4 安賽蜜對大鼠尿常規指標的影響?

2.5 大體解剖及組織學檢查

2.5.1 大體解剖 由表5可知,所有大鼠大體解剖未發現心、肝、脾、肺、腎、睪丸、心臟、胸腺和腎上腺等臟器的異常。各劑量組臟器重量與對照組相比均無統計學意義(P>0.05)。雌性低、中劑量組肝臟系數與對照組具有極顯著差異(P<0.01),雄性中劑量組心臟系數、腎臟系數、高劑量組心臟系數與對照組具有顯著性差異(P<0.05)。有研究[14-15]表明,安賽蜜可增加小鼠肝臟脂肪的生成,誘導脂質異常從而加劇動脈粥樣硬化,安賽蜜還可能引起小鼠腸道菌群的改變和體重增加。但這并未導致每個劑量組的指標發生改變,也未在體重增重及臟器重量上有所體現,考慮為單一劑量組的偶發現象。其余各項指標與對照組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

表5 安賽蜜對大鼠臟器重量的影響

2.5.2 組織病理學檢查 由表6可知,試驗結束,對高劑量組和陰性對照組所有大鼠的腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、腎、脾、腎上腺、胃、十二指腸、結腸、胰、腸系膜淋巴結、卵巢、睪丸和膀胱等做組織病理學檢查,檢查發現的主要病理改變見表7。但這些病理改變無特異性,也無劑量—反應關系,考慮為自發性病變,與受試物無關,未對其他劑量組進行組織病理學檢查。

表6 安賽蜜對大鼠臟器系數的影響?

表7 大鼠臟器病理改變異常結果

3 結論

安賽蜜分別以4 500,1 500,500 mg/kg體重(相當于人體推薦攝入量的300,100,33.3倍)的劑量經口染毒90 d,雌、雄性大鼠的體重增長、攝食量、食物利用率均無明顯異常;各劑量組的血液、血生化、尿常規指標、臟器重量、臟體比等雖出現了部分指標的異常改變,但無劑量—反應關系,并且異常指標均在參考范圍之內,多考慮是偶發因素,無生物學意義;組織病理學檢查中部分組織病理改變程度較輕且無組間差異,考慮與試驗動物質量及動物自發性病變有關,與安賽蜜的影響無關;雌性大鼠的肝臟系數與對照組比較存在顯著性差異,與文獻[16]結果基本一致,安賽蜜對大鼠長期染毒導致體重及肝臟重量的變化,但組織病理學檢查未發現異常改變,也未在高劑量組中得以驗證,所以多考慮為單一組別的偶發現象。總體來說,在試驗條件下以每天4 500 mg/kg體重劑量(相當于人體推薦攝入量的300倍),連續90 d對大鼠進行安賽蜜灌胃染毒,試驗動物完全耐受,認為在推薦攝入量以內食用安賽蜜是安全的,大鼠90 d經口未觀察到有害作用劑量值雌雄均為4 500 mg/kg體重。但是,安賽蜜作為一種新興污染物存在于環境中對人類是否會產生影響仍是未來研究的重點探討。