鈣型糖柱—高效液相色譜—蒸發光散射檢測器法測定牛乳中的乳糖

朱小朋 付尚辰 郝 果 牛鵬飛 劉永峰

(1. 陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西 西安 710062;2. 富平縣檢驗檢測中心,陜西 渭南 711700)

乳糖是牛乳中存在的主要碳水化合物[1]。乳糖檢測方法多樣,主要包括酶法、生物傳感器法、核磁共振法、紅外光譜法、分光光度法等[2]。傳統的酶法通常先將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖,然后用葡萄糖試劑盒或半乳糖試劑盒通過測量還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸來定量乳糖。然而在實際應用中酶法檢測存在虛高現象,因為低乳糖樣品中存在低聚半乳糖,其在試劑盒的初始反應中也被β-半乳糖苷酶水解,導致葡萄糖或半乳糖的測量結果偏高,乳糖結果也相應偏高[3]。生物傳感器法快速易操作且成本低,通過增加葡萄糖濃度來分析監測水解過程中的乳糖水平,但是較高濃度的葡萄糖會產生干擾[4]。核磁共振法可直接對樣品進行測定,但是有研究[5]發現,當乳糖質量濃度<100 mg/L時,與乳糖相關的質子信號與來自牛乳基質的其他信號重疊,無法可靠定量。紅外光譜法需要大量樣本建立預測模型,過程復雜耗時較長,水分子對紅外的吸收也會干擾液體樣品檢測[6]。分光光度分析方法簡便、快捷,但是不適合大樣本的分析[7]。

為實現乳糖含量的準確快速檢測,試驗選用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)。它是分析碳水化合物最常用的技術,其檢測效率高、靈敏度高、易于操作。其中檢測器的選擇決定檢測結果的可靠性,色譜柱的選擇決定分離組分的分離度以及達到的檢測限[8-9]。示差折光檢測器(refractive index detector,RID)對糖類檢測靈敏度較高,但是RID易受溫度、流速、流動相等因素影響,存在基線穩定性差、靈敏度低、與梯度洗脫不相容等問題[10]。蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)與RID相比具有較好的穩定性和分離能力,靈敏度高、基線穩定、無溶劑峰干擾,對糖類的測定有良好的應用前景[11]。糖類色譜分析中常用凝膠柱、氨基柱和糖分析柱。凝膠柱常以聚合凝膠作為柱填料,但其孔徑較大適用于多聚糖和高聚糖的測定。氨基柱以多孔硅膠為基質,但由于其鍵合的氨丙基易水解從而縮短了氨基柱的使用壽命[12]。而糖柱分離條件簡單、專一性強[13-14]。鈣型糖柱常用于檢測糖和糖醇,具有較高的分離效率和分辨率、檢測快、再生方法簡單,已有研究[15]將鈣型糖柱用于菊芋塊莖中菊粉的定量分析。

現有研究方法檢測耗時較長、還存在檢測結果偏高的現象[2-7]。因此,需要一種快速準確的方法實現乳糖含量的檢測。研究以鈣型糖柱結合HPLC-ELSD建立牛乳中乳糖的測定方法,為牛乳質量控制及合理利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳:采集于陜西省西安市長安區奶牛養殖場的健康泌乳期奶牛,采集后放在冰盒中(4 ℃)帶回放入-80 ℃冰箱備用(用于鈣型糖柱法的相關試驗);

11種商品液態乳(編號1～11,其中:6號樣品為鮮牛乳,10號樣品為無乳糖牛乳):市售;

鈣型糖柱:300 mm×7.8 mm,5 μm,美國飛諾美公司;

ZORBAX氨基柱:250 mm×4.6 mm,5 μm,美國安捷倫公司;

乳糖標準品、葡萄糖標準品、半乳糖標準品:純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司;

乙腈:色譜純,湖北弗頓科技術有限公司;

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀:ΜltiMate3000型,美國賽默飛公司;

蒸發光散射檢測器:ELSD6000型,美國賽默飛公司;

數顯電子天平:BSA224S-CW型,賽多利斯科學儀器有限公司;

高速臺式冷凍離心機:TGL-16gR型,上海安亭科學儀器廠;

超聲清洗器:KQ3200B型,昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 鈣型糖柱法測定乳糖

1.3.1 樣品溶液制備 生牛乳混勻后稱取5.000 g于50 mL容量瓶中,加入不同質量濃度(0.2,0.3,0.4 g/mL)三氯乙酸溶液(trichloroacetic acid,TCA)5 mL,震蕩搖勻并用水定容至50 mL,隨后用濾紙過濾除去沉淀。取適量濾液稀釋100倍后用0.45 μm微孔濾膜過濾后進行檢測?？瞻讟悠贩Q取水5.000 g于50 mL容量瓶中,后續步驟同上。

1.3.2 乳糖標準品溶液制備 準確稱取乳糖標準品20.0 mg,加入2.0 mL水溶解,得到質量濃度為10.0 mg/mL的乳糖標準儲備液,將乳糖標準儲備液分別稀釋500,250,200,125,100倍,以此來配制質量濃度分別為20.0,40.0,50.0,80.0,100.0 mg/L的乳糖標準工作液。于4 ℃冰箱中貯藏備用。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為鈣型糖柱(300 mm×7.8 mm,5 μm);流動相為純水;柱溫60 ℃;進樣量20 μL;蒸發光散射檢測器條件:飄移管溫度115 ℃;氣流量3.2 L/min,撞擊器關閉;流速:使用0.9,1.0 mL/min進行優化。

1.3.4 方法學考察

(1) 線性關系:將1.3.2配制的20.0,40.0,50.0,80.0,100.0 mg/L乳糖標準工作液按照1.3.3色譜條件進行測定,記錄峰面積并按式(1)計算乳糖質量濃度,以乳糖質量濃度(X1)為橫坐標、乳糖峰面積(Y1)為縱坐標進行線性回歸分析。

(1)

式中:

X1——試樣中乳糖的含量,mg/g;

C1——樣液中乳糖質量濃度,mg/L;

C0——空白中乳糖質量濃度,mg/L;

V1——試樣定容體積,L;

n1——樣液稀釋倍數;

m1——試樣質量,g。

(2) 定量限和檢出限:選取信噪比(S/N)為10時的乳糖質量濃度作為定量限,信噪比(S/N)為3時的乳糖質量濃度作為檢出限。

(3) 精密度和重復性:精密度考察按照1.3.1所述前處理方法制備1份供試品溶液連續進樣測定6次,然后依據1.3.3色譜條件進樣檢測;重復性考察按照1.3.1所述前處理方法制備6份供試品溶液分別進樣測定,然后依據1.3.3色譜條件進樣檢測;記錄峰面積并按式(1)計算乳糖含量。

(4) 加標回收率試驗:精確稱取生牛乳5.000 g再加入不同水平(15,40,80 mg/g)的乳糖標準品后,按照1.3.1優化方法制備待測樣品并用1.3.3色譜條件進樣檢測,記錄峰面積并按式(1)計算乳糖含量再計算乳糖回收率。

1.4 氨基柱法測定乳糖

1.4.1 樣品溶液和乳糖標準品溶液的制備 參考GB 5009.8—2016第一法。

1.4.2 液相色譜條件 參考GB 5009.8—2016第一法。

1.5 市售液態乳的乳糖含量檢測

采用GB 5009.8—2016第一法對試驗所建立的方法進行驗證,將購買的11種市售液態乳參照1.3.1所述前處理方法提取乳糖并用1.3.3所述液相色譜條件進行檢測,記錄峰面積并按式(1)計算乳糖含量;參照1.4.1所述前處理方法提取乳糖并用1.4.2所述液相色譜條件進行檢測,記錄峰面積并按式(2)計算乳糖含量。

(2)

式中:

X2——試樣中乳糖的含量,mg/g;

C2——樣液中乳糖質量濃度,mg/mL;

V2——試樣定容體積,mL;

n2——樣液稀釋倍數;

m2——試樣質量,g。

1.6 數據分析

通過SPSS Statistics 24.0對數據進行顯著性分析,其結果表示為“平均值±標準差”,輸出數據由Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鈣型糖柱法條件優化

2.1.1 樣品提取優化 采用三氯乙酸溶液對樣品進行前處理使蛋白質沉淀,該試劑是常用的蛋白質沉淀劑,沉淀效果好、準確度高[16]。由表1可知,TCA質量濃度不同時,所得乳糖含量無顯著性差異(P>0.05),相對標準偏差(relative standard deviations,RSDs)為1.48%～2.17%。TCA具有較強腐蝕性,需同時考慮樣品提取操作的安全性,因此選取最低質量濃度0.2 g/mL進行提取。

表1 不同濃度TCA處理后乳糖含量

2.1.2 流動相流速優化 鈣型糖柱的典型流動相為純水,以純水作為流動相時色譜圖基線平滑噪音小。然而流動相流速的變化會影響保留時間、柱壓、分離度和基線穩定性[17],流速過大會導致色譜圖拖尾和基線不穩[18]。圖1中,流速為1.0 mL/min時乳糖保留時間為5.008 min,流速為0.9 mL/min時保留時間為5.513 min,可見流速增大保留時間前移。但流速1.0 mL/min時,色譜柱的壓力會過高,不宜進行大量的樣品分析,同時會影響色譜柱壽命。因此,0.9 mL/min為最適宜流速。

圖1 不同流速下乳糖標準品圖譜

2.2 方法學驗證

2.2.2 重復性和精密度 重復性試驗中所得乳糖含量分別為35.30,37.34,35.67,36.74,37.22,37.71 mg/g,其平均值為(36.66±0.97) mg/g,RSDs為2.65%,表明該方法重復性較好。精密度試驗中所得乳糖含量為35.77,36.41,36.83,36.60,36.73,34.53 mg/g,其平均值為(36.16±0.89) mg/g,RSDs為2.45%。表明在該色譜條件下,高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.3 乳糖加標回收率 表2中,牛乳樣品在3個不同加標水平下(15,40,80 mg/g)的乳糖回收率為90.96%～98.23%,結果表明,方法具有很高的準確度,適用于實際樣品的測定。

表2 乳糖加標回收率結果

2.3 鈣型糖柱法和氨基柱法的比較

表3 鈣型糖柱和氨基柱對乳糖的線性范圍、檢出限及定量限對比

2.3.2 檢測耗時對比 圖2(a)中,氨基柱法檢測的乳糖標準品保留時間為12.577 min并且在3.0 min出現未知雜峰,牛乳樣品中乳糖保留時間為12.502 min。圖2(b)中,鈣型糖柱法檢測的乳糖標準品的保留時間為5.515 min,牛乳中的乳糖保留時間為5.420 min。并且在乳糖的保留時間內,其他組分未出現雜質峰干擾,表明方法的專屬性較好。圖2(a)中基線噪音較大,可能是由于漂移管的溫度變化使乙腈沒有完全蒸發[19]。因此,鈣型糖柱法與氨基柱法相比,極大縮短了檢測時長,提高了檢測效率,實現了乳糖含量的快速檢測。

圖2 牛乳樣品及乳糖標準品的保留時間圖譜

2.4 市售液態乳的檢測結果對比

2.4.1 乳糖含量分析 由表4可知,氨基柱法的檢測結果為33.93～50.72 mg/g,鈣型糖柱法的檢測結果為33.86～49.55 mg/g。為更好地比較兩種方法所測乳糖含量的差異,對表4數據進行獨立樣本t檢驗。結果表明,兩種方法所測11種市售液態乳的乳糖含量之間均無顯著性差異(P>0.05)。6號樣品(鮮牛乳)乳糖含量最高,兩種方法所得結果一致。

表4 11種市售液態乳的乳糖含量檢測結果

2.4.2 色譜圖分析 圖3(a)中,所有樣品的色譜圖峰形對稱無拖尾,基線平穩噪音小,無雜峰干擾,保留時間一致。10號樣品在5.5 min時未出現色譜峰,表明該樣品中無乳糖,隨后相繼出現兩個色譜峰,經標準品驗證分別是葡萄糖(6.518 min)和半乳糖(7.217 min),葡萄糖、半乳糖之間分離效果良好。圖3(b)中,10號樣品中未檢測出乳糖和半乳糖,7.8 min的色譜峰為葡萄糖。圖3(b)中8號樣品在10.0 min的色譜峰為蔗糖。鈣型糖柱法乳糖的保留時間在5.5 min處呈現高度的一致性(RSDs為0.06%)而國標方法中保留時間在12.5 min處偏移程度相對較大(RSDs為0.84%),可能是流動相中乙腈揮發使保留時間發生了漂移[20]。

a. 乳糖 b. 葡萄糖 c. 半乳糖 d. 蔗糖

3 結論

研究建立了以0.2 g/mL三氯乙酸溶液進行蛋白質沉淀,鈣型糖柱法測定牛乳中乳糖含量的方法。該方法前處理簡單且6 min內可以實現乳糖含量檢測,其選擇性好、靈敏度較高、檢出限低(3.6 μg/g)、回收率高、精密度和準確性良好、峰面積和乳糖含量之間存在良好線性關系,測定結果具有較高準確度且與國標(GB 5009.8—2016)測量結果基本一致。該方法能夠滿足牛乳中定量檢測乳糖的需要并為產品質量控制方面提供技術支持,還可用于牛乳中葡萄糖、半乳糖的測定,具有可行性和適用性。