咖啡中3種赭曲霉毒素QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測方法

高云慨 陳小妹 陳春泉 周凌聿 鄧英林 尹青春

(海南省食品檢驗檢測中心國家市場監管重點實驗室〔熱帶果蔬質量與安全〕,海南 海口 570100)

據統計[1],中國飲用咖啡的消費者已達3.3億人,近年來咖啡消費市場規模保持20%的年化速度飛速增長。中國咖啡種植主要分布在溫潤潮濕的云南、四川及海南地區。研究[2]表明,咖啡及其產品在采收、加工、貯藏過程中易受到霉菌的侵染,產生各種真菌毒素。Bessaire等[3]采集了9個國家咖啡樣本,多數樣本中含有多種霉菌毒素,其中赭曲霉毒素A含量最高。飲用咖啡是機體攝入該毒素的主要途徑,因在生產及食用環節難以完全避免其毒性,已成為危害健康的主要關鍵風險因素[4-5]。

赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)是由真菌產生的具有結構類似的次生代謝產物,常見的有赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)等[6-7]。其主要通過侵害動物肝臟與腎臟,具有致癌、致畸等毒副作用,已被國際癌癥研究機構(IARC)列入2B類致癌目錄,危害性僅次于黃曲霉毒素[8]。研究[9]表明,OTA和OTC在特定條件下可以相互轉化,具有協同毒副效應。同時,代謝的多種真菌毒素的協同作用對人體健康的影響更具危害性[10-11]。葉林鏈等[12]從肉豆蔻中分離了一株赭曲霉毒素產毒菌,同時檢出了OTA、OTB兩種真菌毒素,說明在植物源樣本中存在不同結構的赭曲霉毒素。GB 2761—2017對咖啡中赭曲霉毒素A限值有明確要求,但其他赭曲霉毒素類型尚未見相關規定[13]。

近年來,高效液相色譜—串聯質譜技術因其強大的分離能力和較好的靈敏度、準確性,逐步被應用于部分真菌毒素的定性和定量分析[14-18]。免疫親和柱法對真菌毒素具有高特異性,是目前國家標準檢測咖啡赭曲霉毒素A采用的前處理方法,但由于采用抗原抗體結合的凈化方式,其前處理過程復雜、使用成本高,檢測的真菌毒素種類有限。相比免疫親和柱,QuEChERS前處理技術采用提取與凈化結合方式,具有操作簡單、快速、價格便宜且選擇性好等優點,可應用于多種真菌毒素的高通量檢測[19-23]。

目前國內有關咖啡及制品中真菌毒素檢測的研究較少[24],尚未見針對咖啡中同時檢測OTA、OTB、OTC 3種類型赭曲霉毒素方法研究及評價的報道。研究擬將高效液相色譜—串聯質譜技術與QuEChERS技術結合,采用內標法定量,旨在建立能快速篩查和準確定量咖啡中3種赭曲霉毒素檢測方法,以期為全面監測、評估咖啡中赭曲霉毒素的污染風險提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

OTA、OTC:天津阿爾塔科技有限公司;

OTB:德國Dr. Ehrenstorfer公司;

13C20-OTA:北京曼哈格生物科技有限公司;

QuEChERS提取鹽包:4 g硫酸鎂、1.0 g氯化鈉,美國Agilent公司;

凈化柱:SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管,日本SHIMADZU公司;

Waters Oasis?PRime HLB:200 mg,6 mL,美國Waters公司;

ZanChERS-Myco17凈化小柱:北京科德諾思技術有限公司;

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),美國Waters公司;

乙腈、甲酸、甲醇:德國MERCK公司;

咖啡生豆、烘焙咖啡豆、速溶咖啡粉:市售。

1.1.2 儀器與設備

質譜儀:AB Sciex Triple QuadTM4500型,美國SCTEX公司;

電子天平:XS204S型,瑞士梅特勒—托利多公司;

冷凍離心機:5804R型,德國Eppendorf公司;

超聲波器:SK 7200型,上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

(1) 質譜條件:離子源(ESI);正離子模式;多反應監測(MRM)掃描;噴霧電壓4 500 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣為氮氣;加熱氣為氮氣;碰撞室入口電壓10 V。

(2) 色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫40 ℃;進樣體積5.0 μL;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為乙腈;流速0.3 mL/min;洗脫程序:0～2.0 min,10% B;2.0～3.0 min,10%～90% B;3.0～3.2 min,90%～10% B;3.2～5.0 min,10% B。

1.2.2 標準溶液配制

(1) 混合標準溶液(1.0 μg/mL):準確吸取100 μg/mL 的3種赭曲霉毒素混標100 μL,用乙腈定容至10 mL,并于-18 ℃貯藏備用。

(2)13C20-OTA內標使用溶液(10.0 μg/mL):準確吸取100 μg/mL13C20-OTA溶液1.0 mL,用乙腈定容至10 mL,并于-18 ℃貯藏備用。

1.2.3 基質標準曲線配制 稱取不含3種赭曲霉毒素的咖啡空白基質樣品,按1.2.2的方法處理得到基質溶液,使用該溶液配制成質量濃度為0.1～20.0 ng/mL的標準工作曲線溶液。

1.2.4 樣品前處理 稱取1.0 g(精確至0.01 g)咖啡粉碎樣品至50 mL干凈離心管中,加入100 ng/mL的13C20-OTA內標標準溶液200 μL及10 mL乙腈提取液(V乙腈∶V甲酸∶V水為65∶5∶30),分別漩渦超聲5 min,加入3.2 g QuEChERS鹽包,劇烈振搖分散,10 000 r/min離心5 min。吸取2 mL上清液上ZanChERS-Myco17凈化小柱,收集濾液過0.22 μm PTFE濾膜,上質譜測定。

1.2.5 線性關系 以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標,將3種赭曲霉毒素系列混合標準曲線溶液分析結果繪制校準曲線,計算相應線性方程及相關系數。

1.2.6 檢出限及定量限 通過測定系列混合標準曲線溶液,檢出限以3倍信噪比(S/N=3)時對應的目標物濃度換算,定量限以10倍信噪比(S/N=10)時對應的目標物濃度換算。

1.2.7 回收率和精密度測定 分別選取不含3種赭曲霉毒素的咖啡生豆、烘焙咖啡粉、速溶咖啡粉作為基質,分別配制含混標溶液2,5,10 μg/kg 3個水平的供試品溶液進行測定,每個水平6個平行,計算各水平目標物回收率和相對標準偏差。

1.2.8 實際樣品測定 采用市售的咖啡生豆(預包裝)、咖啡生豆(散裝)、研磨咖啡粉(預包裝)、研磨咖啡粉(散裝)、速溶咖啡(預包裝)、速溶咖啡(散裝)共30個樣品,主要產地為海南省,按試驗建立的方法及GB 5009.28—2016進行測定,每種類型5個樣品,每個樣2個平行。

1.2.9 數據處理 采用SPSS 22.0軟件進行數據處理,采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

分別取質量濃度為20 ng/mL的OTA、OTB、OTC和13C20-OTA標準溶液上機調諧,依次選擇正、負離子模式掃描一級質譜,比較正、負離子模式的響應情況。結果發現,4種目標物采用正離子模式響應最好。繼續采用正離子模式掃描二級質譜,同時選擇多反應監測模式優化各目標物的其他參數,篩選最優的定性和定量離子。優化后的質譜參數見表1。

表1 OTA、OTB、OTC和13C20-OTA的質譜參數

2.2 色譜柱及流動相的篩選

試驗對比了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、CORTECS T3(2.7 μm,2.1 mm×100 mm)、CORTECS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm) 3款類型不同填充粒徑的色譜柱和0.2%甲酸水/甲醇、水/甲醇、0.2%甲酸水/乙腈、水/乙腈4種不同配比流動相的分離效果。結果顯示,采用Waters BEH C18及CORTECS T3色譜柱均能分離4種化合物,其中Waters BEH C18色譜柱響應值最高,分離效果最好。李碩等[24]采用UPLC-MS/MS測定咖啡粉中黃曲霉毒素和雜色曲霉素,發現C18色譜柱填料為實心核殼顆粒分離效果要優于全多孔顆粒。對比4種不同配比流動相,當流動相中添加甲酸后,峰型對稱、信號響應更高,并隨著甲酸濃度的增加,其響應不斷增強。其中0.2%甲酸水/乙腈作為流動相的色譜峰型及信號響應最好。葉林鏈等[12]研究發現,選擇乙腈為流動相,不加酸,OTA、OTB的保留時間會發生漂移,加酸后能改善目標化合物的峰型。赭曲霉毒素化合物由于含較多羧酸,添加適量的酸可以使其保持分子形式有利于色譜柱的保留,促進分離[25]。因此,選擇Waters BEH C18色譜柱,0.2%甲酸水/乙腈為流動相。4種化合物質譜總離子流圖如圖1所示。

圖1 OTA、OTB、OTC和13C20-OTA質譜總離子流圖

2.3 樣品前處理條件優化

乙腈作為提取溶劑具有沉淀蛋白的作用,對脂肪及蛋白含量較高的食品具有較好的選擇[26]。通過加標回收試驗考察了6種不同配比提取溶劑1[乙腈—水(V乙腈∶V水為90∶10)]、提取溶劑2[乙腈—水(V乙腈∶V水為75∶25)]、提取溶劑3[乙腈—水(V乙腈∶V水為65∶35)]、提取溶劑4[乙腈—水(V乙腈∶V水為55∶45)]、提取溶劑5[乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶40∶5)]、提取溶劑6[乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶35∶10)]的提取效果。由圖2可知,溶劑中加入適量水可以增強乙腈的滲透性,添加無機鹽可以促進乙腈與水相分層,當V乙腈∶V水為65∶35時,開始分層,其中V乙腈∶V水為55∶45的分層效果最好,提取效率最高。當提取液中含有5%甲酸時,OTA、OTB的回收率較高,但甲酸含量過高,3種目標化合物的回收率均降低。有研究[27]表明,體系中加入適當的酸可增強對酸敏感的真菌毒素的提取效果并降低基質效應。試驗中加入適當的酸及無機鹽可以使目標物保留分子形式利于提取及減少乙腈中水溶性雜質的基質效應,從而獲得較高提取效果。綜合考慮,選擇乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為55∶40∶5)作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對3種化合物回收率的影響

2.4 凈化方式優化

研究[28]表明,可采用不同類型凈化方式去除干擾物質,提高凈化效果。試驗分別選用WondaPak QuEChERS凈化管、ZanChERS-Myco17凈化小柱、PRime HLB凈化柱3種凈化方式,以回收率為指標,考察3種目標化合物的凈化情況。由圖3可知,WondaPak QuEChERS凈化管、ZanChERS-Myco17凈化小柱對3種目標化合物凈化效果較好,其中ZanChERS-Myco17凈化小柱凈化效果最佳,整體回收率為85.5%～107.5%。QuEChERS凈化管采用的凈化劑含有PSA、GCB、C18,這些成分可有效去除脂類、糖類及色素等成分,但會對酸性及含有苯環的官能團毒素具有吸附作用,可能是導致回收率偏低的原因。PRime HLB凈化柱能夠有效去除蛋白、鹽、磷脂等干擾物,但對咖啡色素的凈化效果不明顯,基質干擾大,導致回收率偏低。ZanChERS-Myco17凈化小柱采用磁性金屬有機骨架(MOFs)材料鍵合NH2基團,相比凈化管具有較高的理論塔板數及選擇性。因此,選取ZanChERS-Myco17凈化方式。

圖3 凈化方式對3種目標化合物回收率的影響

2.5 線性范圍、檢出限及定量限

García-Moraleja等[29]以生咖啡豆為基質,建立了UPLC-MS/MS測定OTA的方法,檢出限及定量限分別為1.13,1.45 μg/kg。由表2可知,試驗方法在0.1～20.0 ng/mL的質量濃度范圍內3種目標物線性關系良好,相關系數均>0.999 46,檢出限為0.1～0.2 μg/kg,定量限為0.2～0.7 μg/kg,其中OTA的檢出限及定量限分別為0.2,0.7 μg/kg,均小于同類方法及GB 5009.96—2016中的檢出限和定量限,說明試驗方法的靈敏度較高。

表2 3種化合物的線性關系、檢出限、定量限

2.6 回收率與精密度試驗

基質效應是影響檢測結果準確性的重要因素,減少基質效應的影響一般可選擇同位素內標法和基質匹配校正法[30-31]。鑒于咖啡基質較為復雜,試驗選擇內標法定量。分別選取不含目標物的咖啡生豆、研磨咖啡粉、速溶咖啡粉作為陰性樣品,各添加2,5,10 μg/kg 3個水平濃度OTA、OTB和OTC混標溶液及內標溶液,按1.2.7的方法分別計算3種化合物的平均回收率及相對標準偏差(RSD),每個濃度6個平行,結果見表3。由表3可知,3種毒素的平均回收率為79.0%～103.0%,RSD為1.5%～7.6%,方法準確性和重現性較好,滿足檢測要求。

表3 3種化合物的回收率和RSD

2.7 實際樣品測定

由表4可知,30份咖啡樣品中共檢出4批含有OTA,含量為0.82～2.15 μg/kg,均低于標準規定限值(5.0 μg/kg)。經比對,除樣品YMS4因檢測結果低于標準方法定量限而無法準確定量外,試驗方法測定結果與標準方法的相對標準偏差均<15%,說明該方法測定樣品結果準確可靠。一般來說,咖啡樣品中赭曲霉毒素的污染主要來自生產、運輸、貯藏過程中殘留毒素的直接接觸及真菌侵染后產生代謝物兩個方面,此次檢出的4批樣品中,3批來自散裝貯藏,可能是由于散裝咖啡密封不嚴、貯藏條件控制不當而被真菌污染產生毒素所致。生咖啡豆中OTA殘留量通常會比烘焙咖啡的高,主要原因是烘焙過程中高溫可一定程度上降低OTA水平[32-33]。試驗也發現,生咖啡豆OTA檢出含量要高于研磨咖啡。

表4 實際樣品檢測結果?

相關研究[34]數據顯示,咖啡及制品在一些國家或地區具有較高的赭曲霉毒素檢出率及殘留量。對實際樣品檢測發現,赭曲霉毒素檢出率及含量均較低,另外,散裝貯藏方式咖啡檢出率高于預包裝,說明可能存在真菌污染導致毒素積累的風險。建議在咖啡生產及銷售過程中應對貯藏條件及方式加以嚴格控制,防止產毒真菌污染。

3 結論

采用QuEChERS前處理方法結合內標法定量,通過優化色譜質譜條件、提取條件和凈化條件,建立了可同時測定咖啡基質中3種赭曲霉毒素的UPLC-MS/MS方法。該方法相較標準方法的免疫親和柱法更加簡便、準確、靈敏,其分析時間短,適用于咖啡基質中3種赭曲霉毒素的快速篩查及定量檢測。后續可結合微生物學手段明確污染源,以期為全面監測、評估咖啡中赭曲霉毒素的污染風險提供依據。