巨大芽孢桿菌對雪茄煙葉品質及細菌群落結構的影響

李林瑋，毛亞浩，余 君，陳 雄，楊春雷，姚 蘭

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.湖北省煙草科學研究院，湖北 武漢 430030）

雪茄是一種卷煙制品，具有獨特的香氣，由茄衣、茄套、茄芯3 部分組成，其中茄芯是雪茄的主體部分，對吸食的風味特征起主導作用[1]。發酵是提高雪茄煙葉品質的重要環節，而在這一過程中微生物發揮著重要作用。經過發酵的煙葉刺激性大大降低，香氣也更加突出[2-3]。煙葉發酵方式分為自然發酵和人工發酵，自然發酵時間較長、成本也高[4]。研究表明，在煙葉發酵過程中人工添加微生物能縮短發酵時間，增加香氣，改善煙葉品質[5]。因此在雪茄煙葉中添加微生物進行發酵，對提高雪茄的品質具有重要的意義。

大量研究表明，微生物在煙葉發酵中應用廣泛，且在改善煙葉品質的過程中發揮著重要作用[6-8]。 李寧等[9]將蠟樣芽孢桿菌添加到雪茄煙葉表面進行人工發酵，發現煙葉含氮化合物含量顯著降低，煙葉刺激性和勁頭明顯得到改善，香氣增加。黃申等[10]將嗜麥芽窄食單胞菌制成菌劑后加入煙葉中進行發酵，發酵后煙葉香氣質有所提升。蔡文等[11]在煙葉中添加具有產蛋白酶能力的高斯芽孢桿菌進行發酵，發現煙葉的刺激性、雜氣降低，香氣增加。薛云等[12]采用芽孢桿菌ZZ-8 固態發酵技術處理煙葉，發現發酵后的煙葉香氣質有所提升，刺激性、雜氣降低，吸食品質提高。

近年來，隨著高通量測序技術的發展，對煙葉的研究不僅僅局限于添加微生物探究煙葉品質的變化上，還包括利用宏基因組學進一步分析煙葉中的微生物多樣性[13-14]。張鴿等[6]對雪茄外包皮煙葉表面細菌多樣性的研究發現，細菌群落演替由發酵前的棒狀桿菌屬、假單胞菌屬變為發酵后期的葡萄球菌屬。張磊等[15]通過對雪茄煙葉不同發酵階段微生物多樣性的研究發現，葡萄球菌、四鏈球菌為煙葉發酵過程中的優勢細菌屬。細菌作為雪茄煙葉中主要的微生物種類，在煙葉發酵中發揮著重要作用[16]。鄭霖霖等[17]研究發現，細菌和真菌的多樣性隨著發酵時間的延長呈降低趨勢，葡萄球菌和曲霉屬為雪茄茄芯煙葉發酵過程中的優勢菌屬。鄭天飛等[18]通過高通量測序對不同產地的雪茄煙葉微生物群落進行研究發現，不同產地的雪茄煙葉表面優勢細菌屬為葡萄球菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌，優勢真菌屬為曲霉。

基于外源微生物在發酵雪茄煙葉品質形成過程中的重要影響，研究以前期篩選得到的一株可產蛋白質酶、淀粉酶和木質素酶的巨大芽孢桿菌為材料，將其與營養物質一同添加到茄芯煙葉中進行發酵，探究其對雪茄煙葉主要化學成分、感官品質和細菌群落結構的影響，以期為人工添加微生物發酵，提升茄芯煙葉的發酵品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以湖北恩施州晾制結束的CX-014 雪茄茄芯中部煙葉為供試煙葉。供試菌種為實驗室保藏的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium） m1。

主要試劑有胰蛋白胨（北京雙旋微生物培養基制品廠）、酵母粉（蘇州嘉葉生物科技有限公司），其余試劑均來自于國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器設備有恒溫恒濕培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、恒溫培養振蕩器（天津歐諾儀器儀表有限公司）、冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）、高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

發酵培養基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.2～7.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪茄煙葉箱式發酵 參照李磊[19]的方法并進行改進，取7.5 kg 煙葉回潮至水分含量為30%，將Bacillus megateriumm1 接種于發酵培養基，培養至對數生長期，離心取菌體。將菌體（按煙葉重量添加10%的菌體）與營養液（1%谷氨酸、2%葡萄糖）混合后，用霧化小噴壺均勻噴灑在煙葉上，平衡水分后裝入紙箱中，設置自然發酵（只加水，Y2）和Bacillus megateriumm1 加營養液（Y6）2 個箱式發酵處理，發酵前的煙葉記為Y0。在煙葉中心放置溫度探頭，設置濕度為80%，初始溫度為30℃，當煙葉中心溫度達到設定溫度后，恒溫恒濕箱溫度以2℃的速度依次遞增，當煙葉中心溫度達到45℃時翻堆，翻堆2 次后結束發酵。

1.2.2 煙草常規化學成分的測定 水溶性總糖及還原糖參照YC/T 159—2002 進行測定，總植物堿參照YC/T 160—2002 進行測定，總氮參照YC/T 161—2002 進行測定。

1.2.3 感官評價 參照YC/T 415—2011 進行煙葉感官評價。將煙葉樣品送至湖北省煙草科學研究院，由評吸專家以盲評的方式采用10 分制評吸方法對煙葉刺激性、苦感、雜氣、烤香和木香等5 個指標進行感官評價，各指標評分標準見表1。

表1 雪茄煙葉感官評價各指標評分要求

1.2.4 雪茄煙葉表面微生物的收集 取10 g 煙葉樣品剪切成段，使其與液體充分接觸；將其置于80 mL 無菌蒸餾水中，室溫靜置15 min，5 000 r/min 離心10 s，渦旋90 s，5 000 r/min 離心1 min，去除葉片殘留；將樣品在10 000 r/min 下離心10 min，收集微生物細胞；然后用洗滌緩沖液（100 mmol/L 的Tris-HCl，50 mmol/L 的EDTA-Na2，20 g/L 的聚乙烯吡咯烷酮，1 mL/L 的吐溫－20，1.4 mol/L 的NaCl，pH值為8）洗滌細胞顆粒；室溫旋轉45 s，65℃水浴5 min，6 000 r/min 離心6 min；重復洗滌直至上清液幾乎無色，然后收集微生物細胞。建議沉淀的量在200 mg 以上。微生物沉淀用液氮速凍20 min 以上，然后轉入－80℃冰箱中保存。

1.2.5 DNA 提取建庫及宏基因組測序 收集好的微生物菌體沉淀送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行DNA 提取建庫以及后續的宏基因組測序。

1.3 數據處理

所有試驗均設置3 個平行，采用Origin 2019 軟件進行分析作圖、美吉生信云在線平臺進行微生物多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 Bacillus megaterium m1 對雪茄煙葉化學成分及感官品質的影響

從圖1 可以看出，煙堿、還原糖、總糖、總氮含量在發酵后均呈下降趨勢，相比于自然發酵前，自然發酵后4 種物質的含量分別降低了8.55%、24.82%、14.29%、7.03%； 而Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后4 種物質分別比發酵前下降了17.31%、71.64%、55.81%、10.61%；與自然發酵相比，添加巨大芽孢桿菌和營養液協同發酵后，雪茄煙葉中煙堿、還原糖、總糖含量分別降低了9.58%、9.52%、9.53%；這說明Bacillus megateriumm1 加營養液協同發酵在一定程度上改善了雪茄煙葉的品質。

圖1 雪茄煙葉發酵前后煙葉化學成分的變化

由圖2 可知，發酵前雪茄煙葉刺激性較大，苦味明顯，雜氣重，烤香和木香都不突出，而經過自然發酵和Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后感官評價各指標均有了明顯改善。相比于自然發酵，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后，雪茄煙葉刺激性進一步降低，苦味、雜氣明顯改善，烤香、木香等香味得到提升。這說明經過Bacillus megateriumm1 加營養液協同發酵后，煙葉的刺激性、雜氣、苦感等顯著降低，煙葉品質明顯提高。

圖2 雪茄煙葉發酵前后的感官評價

2.2 雪茄煙葉化學成分與感官評定相關性程度分析

為進一步研究雪茄煙葉化學成分與感官評定指標間的關系，對其進行相關程度分析，結果如圖3所示。煙葉中煙堿、總糖、總氮含量與苦感、雜氣、刺激性均呈正相關，還原糖、總糖、總氮含量與烤香和木香均呈負相關。這種成分含量與感官指標之間的相關關系正好解釋了Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后，還原糖、總糖、煙堿、總氮含量降低，煙葉感官品質明顯改善的試驗結果。

圖3 雪茄煙葉化學成分與感官評定的相關程度分析

2.3 Bacillus megaterium m1 對雪茄煙葉表面細菌群落影響

2.3.1 細菌α 多樣性分析 多樣性可以用來反映物種組成的多樣性和豐富度。雪茄煙葉表面細菌多樣性指數如表2 所示，與Y0（發酵前煙葉）相比，Y2（自然發酵后煙葉）的細菌多樣性和物種組成存在較大差異。Chao 指數通常用來估計物種總數，自然發酵后煙葉的物種總數顯著降低（從發酵前13 432.33 降至發酵后4 880.33）。Simpson 指數和Shannon 指數常用來估計樣本中微生物的多樣性，Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越低，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高。表2 的結果顯示，與發酵前相比，自然發酵煙葉的Simpson 指數顯著上升，從發酵前的0.02 上升至0.56，Shannon指數明顯降低，從發酵前的5.47 下降至1.47，這說明經過自然發酵后，煙葉表面細菌多樣性顯著降低；而相較于自然發酵后的雪茄煙葉，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后雪茄煙葉的Chao 指數顯著降低，Shannon 指數有所降低，而Simpson指數稍微升高，表明煙葉表面的細菌多樣性有所降低，這意味著Bacillus megateriumm1 加營養液可能在一定程度上加速了細菌群落的自然演替進程。

表2 雪茄煙葉表面細菌群落α 多樣性分析

2.3.2 細菌OTU 分析 雪茄煙葉發酵過程中表面細菌群落結構存在顯著差異，由圖4 可知，門水平上，發酵前煙葉（Y0）表面有109 個OTU，屬水平上有2 378 個OTU，而自然發酵后煙葉（Y2）在門水平僅有29 個OTU，屬水平為1 137 個OTU，其中發酵前屬水平上特有的細菌OTU 有1 265 個，自然發酵后僅為24 個OTU。圖5 為自然發酵后煙葉與Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后煙葉（Y6）表面細菌多樣性的韋恩圖，由圖5 可知，與自然發酵后煙葉相比，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后煙葉表面細菌門水平和屬水平上細菌OTU 均顯著降低，門水平上只有22 個OTU，屬水平上為739個OUT，其中自然發酵后煙葉門水平上特有的細菌OTU 為 9 個，屬水平上有442 個，而經過Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后門水平上特有的細菌OTU 僅為2 個，屬水平上為44 個 。

圖4 基于門水平（A）和屬水平（B）自然發酵細菌OTU 分布的韋恩圖

圖5 基于門水平（A）和屬水平（B）不同發酵后細菌OTU 分布的韋恩圖

綜上所述，雪茄煙葉的發酵進程可能與其表面細菌群落演替存在一定的相關性。與發酵前相比，自然發酵后雪茄煙葉表面細菌多樣性顯著降低，而在添加Bacillus megateriumm1 和營養液發酵后，細菌多樣性又進一步降低，說明Bacillus megateriumm1加營養液發酵可能在一定程度加速了雪茄煙葉表面細菌群落的演替進程，這與雪茄煙葉表面細菌群落 多樣性分析的結果一致。

2.3.3 細菌群落組成分析 雪茄煙葉表面細菌群落相對豐度的變化如圖6、圖7 所示。從門水平（圖6）來看，發酵前煙葉（Y0）表面優勢細菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），自然發酵后煙葉（Y2）以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其相對豐度可達到93.36%，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后煙葉（Y6）表面的優勢細菌也是厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度可達到97.40%。從屬水平（圖7）來看，發酵前雪茄煙葉表面優勢細菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Aureimonas、假單胞菌屬（Pseudomonas）等，自然發酵后煙葉表面優勢細菌屬發生了顯著變化，葡萄球菌屬（Staphylococcus）成為絕對優勢細菌屬，相對豐度達91.59%，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后煙葉表面優勢細菌屬也為葡萄球菌屬（Staphylococcus），相對豐度達95.55%，而發酵前相對豐度較高的鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬等發酵后相對豐度均下降。這說明雪茄煙葉發酵后，葡萄球菌屬會成為絕對優勢細菌屬，其可能與雪茄煙葉的發酵進程密切相關。但相比于自然發酵，人工添加Bacillus megateriumm1 和營養液會在一定程度上加速煙葉表面細菌的群落演替，從而促進雪茄煙葉發酵進程。

圖6 不同雪茄煙葉表面門水平上的細菌相對豐度

圖7 不同雪茄煙葉表面屬水平上的細菌相對豐度

細菌群落互作關系分析結果（圖8）表明，在雪茄煙葉發酵過程中，細菌群落之間存在著顯著的相互作用。相對豐度較高的葡萄球菌屬（Staphylococcus）與其余菌屬均呈負相關，而其余菌屬間均呈正相關。這說明在雪茄煙葉發酵過程中，細菌群落除葡萄球菌屬外，其余菌屬間為共生關系，葡萄球菌與其余菌屬為競爭關系。這可能是因為葡萄球菌更能適應煙葉表面的環境，從而更好地利用雪茄煙葉中的營養物質，實現快速生長，同時這也解釋了葡萄球菌屬細菌在雪茄煙葉發酵過程中相對豐度顯著增加，發酵后成為雪茄煙葉表面絕對優勢微生物的原因。通過雪茄煙葉細菌群落（屬水平）與KEGG 功能貢獻度分析結果（圖9）可以看出，在屬水平上豐度排名前十的物種中，發酵前煙葉（Y0）中對次級代謝物的生物合成、不同環境微生物的代謝、氨基酸的生物合成、ABC 轉運等功能途徑貢獻度較高的細菌屬主要為鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬。而自然發酵后煙葉（Y2）和Bacillus megateriumm1加營養液發酵后煙葉（Y6）中對功能途徑貢獻度較高的主要為葡萄球菌屬。與自然發酵后煙葉相比，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后煙葉中葡萄球菌屬的貢獻度較高，可達98%以上。這說明葡萄球菌在發酵過程中對雪茄煙葉內部的功能途徑有著顯著影響，而這些功能途徑與雪茄煙葉的香氣產生可能有密切聯系；同時，也意味著加入Bacillus megateriumm1 和營養物質可能會協同促進雪茄煙葉的發酵進程，進而提高雪茄煙葉的品質。

圖8 雪茄煙葉細菌群落互作關系分析

圖9 雪茄煙葉細菌群落與KEGG 功能貢獻度分析

2.3.4 細菌多樣性與環境因子的關聯分析 為了確定雪茄煙葉細菌群落與化學成分和感官品質之間的關系，對其進行相關性熱圖分析，結果見圖10。從圖10A 可以看出，葡萄球菌屬（Staphylococcus）與還原糖、總糖、煙堿呈顯著負相關，甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Auremonas、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）與其均呈顯著正相關。從圖10B 可以看出，葡萄球菌屬（Staphylococcus）與刺激性、雜氣、苦味等不良指標呈顯著負相關，而甲基桿菌屬、Auremonas、鞘氨醇單胞菌屬與其均呈顯著正相關，葡萄球菌屬與烤香呈顯著正相關，其余菌屬與其呈負相關。這在一定程度也說明了在雪茄煙葉發酵過程中，細菌群落的演替，特別是葡萄球菌相對豐度的增加，對雪茄煙葉品質的提高有重要的影響。

圖10 雪茄煙葉細菌群落與化學成分（A）及感官評價（B）的相關程度分析

3 討 論

雪茄煙葉主要化學成分包括還原糖、總糖、總氮、煙堿等指標，其含量與煙葉的內在質量密切相關[20]。研究表明，煙葉中糖類物質在燃吸過程中可適度平衡煙氣，使雪茄煙的吃味更加醇和，糖類物質含量過高會破壞煙氣的協調與平衡，使得煙氣平淡無味[21]；含氮化合物含量過高，雪茄煙燃燒時會產生揮發性堿性物質，使煙氣的堿性和刺激性增強，進而影響雪茄煙的品質[22]；煙堿含量過高會影響雪茄煙的煙氣特征和安全性，適量的煙堿可以給吸食者帶來更好的體驗感[23]。感官評定也是判斷雪茄煙發酵效果的重要指標之一，是煙葉質量評價的主要手段和重要依據[24]。雪茄煙葉化學成分及感官評價結果表明，Bacillus megateriumm1 加營養液協同發酵后煙葉的還原糖、總糖、總氮、煙堿含量下降幅度較大。感官評價結果表明，相比于其他處理，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵處理的雪茄煙葉刺激性、苦味、雜氣等不良指標得到明顯改善，烤香、木香等香味更突出，這可能是由于加入的營養液中含有葡萄糖和谷氨酸，而氨基酸和葡萄糖在一定條件下會發生美拉德反應，產生致香物質；另外，Bacillus megateriumm1 具有產蛋白酶、淀粉酶、木質素酶的能力，能降解煙葉中的蛋白質、淀粉、木質素等大分子物質，進而改善煙葉品質。毛多斌等[25]在煙葉中添加枯草芽孢桿菌發酵后，煙葉的刺激性降低，香氣質和香氣量明顯提高。Li 等[26]在雪茄煙葉中添加纖維素降解菌和營養物質（葡萄糖、谷氨酸）進行發酵，發現雪茄煙葉香氣量顯著提升。這說明在雪茄煙葉發酵過程中添加外源微生物和營養物質能顯著改善雪茄煙葉品質。

為了進一步探究Bacillus megateriumm1 加營養液改善雪茄煙葉品質的作用機制，分析了不同發酵處理前后雪茄煙葉表面的細菌多樣性。細菌群落結構分析結果表明，相比于發酵前，自然發酵和Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后雪茄煙葉表面的細菌多樣性和豐度均顯著降低，其中Bacillus megateriumm1 加營養液發酵處理的細菌多樣性和豐度下降幅度較大，說明Bacillus megateriumm1 加營養液更有助于促進雪茄煙葉表面細菌群落的演替，這與Liu 等[27]關于發酵前后微生物多樣性的研究結果基本一致。細菌群落組成結果表明，在門水平上，發酵前雪茄煙葉表面的優勢細菌門主要為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，而在自然發酵后、Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后雪茄煙葉表面均以厚壁菌門為主，其中Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后厚壁菌門相對豐度較高，可達97.40%；在屬水平上，發酵前雪茄煙葉表面細菌種類較豐富，其優勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬等，自然發酵后、Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后雪茄煙葉表面均以葡萄球菌屬為絕對優勢細菌屬，其中Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后葡萄球菌屬的相對豐度較高，可達95.55%。這與葉長文等[28]通過高通量測序發現發酵后雪茄煙葉表面優勢菌門為厚壁菌門，優勢菌屬為葡萄球菌屬的研究結果一致。

通過互作關系分析可知，葡萄球菌與其余菌屬均存在競爭關系，這也解釋了發酵后期葡萄球菌屬成為雪茄煙葉表面絕對優勢微生物的這一現象。細菌群落與KEGG 功能貢獻度分析發現，相比于其他處理，Bacillus megateriumm1 加營養液發酵后，雪茄煙葉表面的葡萄球菌屬微生物對豐度排名前5 的代謝途徑貢獻度均較高，可達到98%以上，說明葡萄球菌屬微生物對發酵過程中煙葉內部的功能途徑有顯著影響，而煙葉內部的功能途徑又與煙葉的香氣品質及內在質量密切相關。這意味著加入Bacillus megateriumm1 和營養液協同發酵在一定程度上可促進雪茄煙葉細菌群落演替和發酵進程，提高雪茄煙葉的品質。Zhang 等[29]研究發現，在雪茄煙葉表面接入不動桿菌可促進微生物演替和煙葉發酵進程，縮短發酵時間。而該試驗利用Bacillus megateriumm1 和營養液協同發酵也取得了相似結果。

在細菌群落和功能分析的基礎上，對雪茄煙葉細菌群落與主要化學成分和感官品質的相關性進行研究，結果表明，葡萄球菌與還原糖、總糖、煙堿呈顯著負相關，與煙葉的雜氣、刺激性、苦味等不良指標也顯著負相關。這進一步說明在發酵過程中，葡萄球菌的相對豐度增加，可能對雪茄煙葉品質的改善發揮重要作用。研究還發現，葡萄球菌會參與脂肪代謝，并產生大量的脂肪酸，脂肪酸可以進一步降解形成醛類、甲基酮等香氣物質，是煙葉香氣的主要來源[30-31]。國內外關于葡萄球菌在食品領域的應用已有大量報道，該菌有助于改善發酵食品的感官，包括顏色、香氣和味道[32]。Wang 等[33]研究發現，添加植物乳桿菌和葡萄球菌發酵后的肉飯中橙花醇、醛類和部分氨基酸含量顯著提高，發酵肉飯的風味品質得到明顯改善。Li 等[34]在奶酪中添加乳桿菌和葡萄球菌進行發酵，發現奶酪中的蛋白質、游離脂肪酸含量顯著增加，奶酪的風味品質明顯提升。但關于葡萄球菌在雪茄煙葉中應用和發酵作用機制的研究鮮見報道，還有待進一步研究。

總的來看，在雪茄煙葉發酵過程中添加巨大芽孢桿菌和營養液協同發酵，可推動雪茄煙葉發酵進程，加速細菌群落演替，并明顯改善雪茄的香氣品質和安全性，降低煙葉雜氣。