環(huán)糊精對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血管功能的影響

柯永鑫 林立建

（福州市長樂區(qū)醫(yī)院心血管內科，福建 福州 350005）

隨著我國人口的老齡化，動脈粥樣硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的發(fā)病率和死亡率逐年攀升。脂質代謝改變、炎癥反應和氧化應激被認為是動脈粥樣硬化的主要發(fā)病機制[1]。控制甚至逆轉動脈粥樣硬化斑塊的進展，對于防治ASCVD具有重大的意義。環(huán)糊精是一種天然的由葡萄糖分子組成的環(huán)狀淀粉類物質，可在水溶液中形成環(huán)狀的空腔結構。研究發(fā)現，環(huán)糊精能夠與血液中的膽固醇和脂類相結合，形成水溶性的復合物，從而減少動脈壁的脂質物質的沉積，可能對動脈粥樣硬化的防治具有一定的潛在益處[2]。本研究擬通過高脂誘導的載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠構建動脈粥樣硬化模型，采用皮下注射環(huán)糊精，觀察其對ApoE-/-小鼠胸主動脈結構及內膜斑塊面積、血清膽固醇以及血管功能的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 ApoE-/-小鼠，C57BL/6小鼠（體重20～22 g，SPF級，許可證號：SYXK（京）2019-0022），羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，美國MCE公司），乙酰膽堿（Ach），去甲腎上腺素（NE），硝普納（SNP），RIPA蛋白裂解液、NO檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒，小鼠IL-6檢測試劑盒（云克隆），Tris-base緩沖液，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Millipore公司），NFκB p65抗體、p66Shc抗體、p-p66Shc抗體、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（美國CST公司），β-actin單克隆抗體和免疫印跡化學發(fā)光試劑。

1.2 實驗動物和分組方案 選取20只8周齡雄性小鼠做基因敲除，并被隨機分為2組：ApoE-/-組+安慰劑（安慰劑組）、ApoE-/-+環(huán)糊精2 g/kg（環(huán)糊精組），每組10只。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，人工光照明每天12 h，高脂飼料（在標準飼料配方中添加1%膽固醇，0.5%膽酸鈉，10%蛋黃粉、10%豬油）。自由飲水。另外選取10只8周齡雄性C57BL/6小鼠作為對照組，自由取食飲水。將HP-β-CD溶于生理鹽水中，每周皮下注射2次，連續(xù)12周，其他兩組小鼠均予注射等量生理鹽水。

1.3 蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin staining，HE染色）用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥于手術臺上，暴露腹主動脈，腹主動脈抽血處死動物，立即行腹主動脈插管，用0.1 mg/mL硝普鈉充分擴張血管后，用加入伊紅的10%甲醛溶液在60 cm H2O～80 cm H2O柱壓下灌注固定血管6 h～12 h。取小鼠降主動脈0.5 cm，PBS漂洗1～2 min，于10%福爾馬林浸泡24 h后自來水沖洗5～10 min，酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色，封片，顯微鏡下觀察拍照，采用自動成像軟件系統(tǒng)(Image5.0）分析并計算胸主動脈內膜斑塊面積。

1.4 小鼠血清樣本制備 采用摘眼球法約取0.5 ml小鼠全血于1.5 ml的EP管中，在室溫下靜置10 min；離心10 min，取上清液在離心管中備用。

1.5 胸主動脈血管環(huán)試驗 采用Powerlab多導生理記錄儀采集處理系統(tǒng)（ADInstruments，Australia），取胸主動脈放入4 ℃飽和氧 Kreb’s液中，在解剖鏡下分離出動脈周圍組織，顯微剪剪取3 mm血管環(huán)，掛鉤，連接張力換能器，調前負荷至0.5 g，加37℃Kreb's液5 ml并通入95% O2和5% CO2混合氣體；血管平衡20 min，通過PowerLab多導生理儀測血管環(huán)對Ach（10-9～10-5mmol/L）和硝普納（10-9～10-5mmol/L）的舒張反應。血管舒張效應=該血管舒張張力絕對值/ NE（10-5mmol/L）誘導血管收縮張力絕對值×100%表示，用Probit法計算半數最大效應濃度（EC50），舒張反應敏感性采用pD2值表示（pD2表示產生產生半數最大效應的摩爾濃度的負對數）。

1.6 小鼠血脂水平的測定 使用全自動血清生化分析儀測定各組小鼠的血脂水平，包括總膽固醇（TC）水平、甘油三酯（TG）水平、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平等。

1.7 硫代巴比妥酸（TBA）法測血清丙二醛（MDA）水平 根據試劑盒說明書準備測量試劑，吸取0.6 ml試劑1加入0.2 ml樣本血清混勻；90 ℃水浴30 min，10000 g室溫離心10 min，取上清液，測定樣品在532 nm和600 nm下的吸光度（A532，A600），按試劑盒上的說明進行MDA含量的計算：MDA含量（nmol/mL）＝[（A532-A600）×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣本＝25.8×（A532-A600）[6]。

V反總：反應體系總體積；ε：MDA 摩爾吸光系數；V樣本：加入樣本體積；d：比色皿光徑。

1.8 酶聯免疫吸附法（ELISA）測血清炎癥因子IL-6水平 應用ELISA法測血清中IL-6水平。根據ELISA試劑盒說明書步驟進行測定。用酶標儀（Thermo，USA）測定IL-6在450 nm處的吸光度。

1.9 硝酸還原酶法測血清NO含量 運用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，通過Griess試劑檢測亞硝酸鹽，測定總一氧化氮的含量。遵循試劑盒說明書中的步驟進行測定，使用酶標儀（Thermo，USA）測定一氧化氮在540 nm處的吸光度。

1.10 蛋白提取和免疫印跡法測定蛋白的氧化水平 選取ApoE-/-小鼠胸主動脈（隔肌上）長約1 cm，剝去血管外膜組織，用PBS漂洗1～2次，加0.5 ml RIPA裂解緩沖液勻漿，根據等體積 2×SDS上樣緩沖液，震蕩15 s，在放入100℃水浴煮10 min，12000 g 4℃離心10 min，靜置后取上清-80℃保存?zhèn)溆?。對蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉膜和封閉，加入一抗Total-p66Shc、p-p66Shc、NF-κB-P65、eNOS 抗體（1:1000）、β-actin（1:2000），二抗（1:5000）孵育、顯影，采用β-actin作為內參照，蛋白表達水平采用目的蛋白/β-actin的比值。測定各組小鼠胸主動脈促氧化銜接蛋白（p66Shc）磷酸化水平。

1.11 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計處理試驗數據時，采用SPSS 19.0軟件進行分析，實驗計量數據結果以表示。針對單一因素多個組的比較采用單向方差分析（one-way ANOVA），而兩兩比較則使用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法。顯著性水平設定為P＜0.05，表明存在統(tǒng)計學上差異。

2 結果

2.1 環(huán)糊精抑制ApoE-/-小鼠胸主動脈內膜粥樣斑塊的形成 病理結果顯示，對照組小鼠的胸主動脈內膜表現為平滑，無增厚，內皮細胞連續(xù)性良好且完整，中膜肌層的厚度均勻，平滑肌層的細胞排列整齊；安慰劑組小鼠的胸主動脈內膜出現增厚和斑塊形成，內皮細胞連續(xù)性中斷，中膜肌層的厚度不均勻且平滑肌層的細胞排列不規(guī)則；環(huán)糊精組小鼠的胸主動脈內膜相對光滑，內膜連續(xù)性相對較好且相對完整，中膜肌層的厚度相對均勻，平滑肌層的細胞排列規(guī)則。

斑塊面積及血管中膜厚度分析顯示：與對照組（無斑塊）相比，安慰劑組胸主動脈內膜斑塊面積（205.48±23.61）μm2顯著增加；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組胸主動脈內膜斑塊面積顯著減小[（78.06±9.03）μm2vs.（205.48±23.61）μm2，P＜0.01]（圖1）。

圖1 三組小鼠胸主動脈內膜粥樣面積的比較

2.2 環(huán)糊精對高脂誘導的ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 與對照組相比，安慰劑組和環(huán)湖精組小鼠空腹血TG、TC、LDL-C水平均增加（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組血TG、TC、LDL-C水平降低，環(huán)糊精可降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂水平（P＜0.01）；但HDL-C水平在三組間均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）。

表1 三組小鼠血脂水平的比較（mmol/L）

2.3 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠胸主動脈舒張功能的影響 與對照組相比，安慰劑組小鼠胸主動脈內皮依賴性（Ach介導）與非內皮依賴性（SNP介導）的舒張作用降低，當Ach為10-7mol/L，SNP為10-7mol/L時，安慰劑組舒張功能pD2值較對照組均顯著降低（Ach：10.187±1.162vs.74.254±0.481，t=19.647，P=0.000；SNP：22.543±2.712vs.43.248±5.556，t=10.622，P=0.000）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組胸主動脈內皮依賴性及非內皮依賴性舒張功能（pD2值）均明顯增高（Ach：7.286±0.432vs.6.147±0.285，t=6.949，P＜0.001；SNP：8.453±0.456vs.6.864±0.483，t=7.570，P＜0.001（圖2）。

圖2 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠胸主動脈舒張功能的影響

2.4 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠血清MDA、IL-6及NO水平的影響 與對照組相比，安慰劑組小鼠血清MDA、IL-6水平均升高（P＜0.01），NO水平降低（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠血清MDA及IL-6均降低（P＜0.01），NO水平均升高（P＜0.01）（表2）。

表2 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠血清丙二醛、IL-6及一氧化氮水平的影響

2.5 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠胸主動脈促氧化銜接蛋白（p66Shc）磷酸化水平的影響 與對照組相比，安慰劑組小鼠胸主動脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平增加（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠胸主動脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平降低（P＜0.01），提示環(huán)糊精可抑制ApoE-/-小鼠胸主動脈促氧化銜接蛋白磷酸化水平（圖3）。

2.6 環(huán)糊精對ApoE-/-小鼠胸主動脈NF-κB p65及eNOS表達水平的影響 與對照組相比，安慰劑組小鼠胸主動脈NF-κB p65蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），eNOS蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠胸主動脈NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），而eNOS蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01）（圖4）。

3 討論

高脂誘導的ApoE-/-小鼠作為動脈粥樣硬化的經典模型，已廣泛用于高脂血癥、動脈粥樣硬化的研究中[3]。本研究采用高脂誘導ApoE-/-小鼠成功建立動脈粥樣硬化模型。安慰劑組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平升高。此外，ApoE-/-小鼠內皮依賴性和非依賴性的血管功能下降。

環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖單體通過α-1，4-糖苷鍵相互連接而成的一類環(huán)狀化合物，環(huán)糊精內腔疏水而外腔親水,具備剔除脂蛋白復合分子中或活細胞表面脂質分子的能力。近年來環(huán)糊精在動物模型中對動脈粥樣硬化的治療作用已被大量研究所證實[4]。本研究結果顯示，環(huán)糊精組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低，胸主動脈內膜斑塊面積及血管中膜厚度減小，內皮依賴性和非依賴性血管功能顯著改善；環(huán)糊精可增加巨噬細胞和動脈粥樣硬化斑塊中氧化型低密度脂蛋白膽固醇的表達，增強膽固醇外流和抗炎作用，抑制動脈粥樣斑塊的病程進展[5]。

氧化應激在動脈粥樣硬化中起到至關重要因素，環(huán)糊精具有抗氧化作用，從而抑制氧化損傷動脈壁[6]。本研究中，環(huán)糊精改善血管功能可能與其改善血脂水平、減輕血管炎癥反應、抑制氧化應激等因素有關。Xiao等[7]研究顯示p66Shc介導的線粒體氧化應激損傷血管內皮功能。p66Shc是Shc蛋白家族成員之一，可表達于內皮細胞。在氧化應激條件下，Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶Cβ和P53等激活，促進線粒體產生活性氧，并且66Shc缺失抑制動脈粥樣斑塊形成，其機制與p66Shc的氧化還原功能有關[8]。ox-LDL通過NADPH氧化酶產生活性氧，進而激活PKCβ和JNK，促進p66Shc磷酸化，進一步促進活性氧生成。ox-LDL亦通過p66Shc啟動子去甲基化，促進p66Shc轉錄及活性氧生成，導致內皮功能障礙。與上述研究一致，本研究發(fā)現，相比對照組，安慰劑組胸主動脈p-p66Shc水平顯著上調，MDA水平升高，SOD活性下降，導致血管內皮功能障礙；環(huán)糊精可能通過降低p-p66Shc介導的線粒體氧化應激，上調eNOS的表達水平，改善動脈粥樣硬化小鼠的血管功能[9]。炎癥通路在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起重要作用，NF-κB作為炎癥通路的關鍵成員，其激活可導致eNOS表達下降，引起血管內皮功能障礙[10]。本研究結果顯示安慰劑組小鼠NF-κB p65蛋白表達水平顯著增加，IL-1β及IL-6水平升高，eNOS表達水平顯著下降；與安慰劑組相比，環(huán)糊精組小鼠NFκB p65蛋白、IL-1β及IL-6水平降低，eNOS表達水平升高。

綜上所述，基于環(huán)糊精在動物實驗中環(huán)糊精能夠降低血脂水平、減少動脈粥樣硬化面積、改善血管舒張功能等優(yōu)勢。因此，環(huán)糊精有望作為動脈粥樣硬化的潛在治療藥物。