大腸桿菌合成煙酰胺單核苷酸途徑構建及發酵工藝研究

程琳,龔勁松,Michael HALL,蘇暢,徐國強,許正宏1,,史勁松1,*

1(江南大學 生物工程學院,糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 4(Seragon Biosciences, Inc., California Irvine, 92618)

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的前體[1],NAD+是生物體內重要的調節輔酶,參與調節能量代謝、細胞凋亡和增殖[2-4]等諸多通路。補充NAD+可預防心血管疾病、修復腎臟損傷和保護視神經等,但NAD+因分子質量大難以直接進入細胞,而補充其前體NMN更能有效提高人體NAD+水平[5]。已有研究表明,補充NMN對機體的心腦組織損傷、代謝性疾病、衰老及其相關老化退行性疾病等均有較好的預防、治療和修復作用[6-8],并有望應用于治療肥胖相關的肝病、帕金森和阿爾茨海默癥,改善組織功能[3,9-10]。

目前合成NMN的方法主要有化學合成法、化學-生物酶法和微生物發酵法,化學法合成路線復雜、試劑昂貴、總收率相對較低[11];化學-生物酶法一方面需要高活性生物酶,同時采用的底物仍需要復雜的化學工藝支持,產品的綠色性、安全性有待提升,因此,近年來微生物發酵法生產NMN逐步受到重視[12]。NMN代謝合成途徑主要有3條,a)NAD+補救途徑,以5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribose 1-pyrophosphate,PRPP)和煙酰胺(nicotinamide,NAM)為底物通過煙酰胺磷酸核糖轉移酶(Nampt,EC 2.4.2.12)催化生成NMN[13-14];b)NAD+替代補救途徑,以煙酸核糖激酶(NPK EC 2.7.1.173)催化煙酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)和ATP生成NMN[15]。上述兩個途徑主要存在于哺乳動物生物體中;c)通過Preiss-Handler途徑,以磷酸核糖基轉移酶(NaPRT,EC 2.4.2.11)催化PRPP合成煙酸單核苷酸(niacin mononucleotide,NaMN),而來源于土拉弗朗西斯菌中的NMN合成酶則可以將NaMN轉化為NMN[16]。

由于替代補救途徑中的NR中間代謝物價格較為昂貴[5],是規模化制備NMN的一大障礙,因此目前微生物發酵法生產NMN大多采用NAD+補救途徑,通過異源篩選高效的NAMPT在細菌體內構建NAD+補救途徑[17]。2018年首次報道了以大腸桿菌為宿主表達來源于杜克雷嗜血桿菌的NAMPT用于合成NMN,胞外質量濃度為15.4 mg/L[18],此后的研究者通過對PRPP生物合成途徑酶進行過表達來增加PRPP的供應,或者通過增加底物NAM進胞、產物出胞的能力以提升NMN的積累[19],并通過染色體整合表達技術,顯著提高NAD+的產量和合成穩定性[20]。

本研究以大腸桿菌BL21(DE3)為出發宿主,通過異源表達Nampt構建NMN的合成途徑,在增強表達合成前體PRPP的途徑酶的同時,敲除NMN代謝降解相關基因pncC、ushA以弱化NMN的降解,并敲除NAD+衍生物調控基因nadR,探討采用多種代謝策略提高NMN的發酵產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

用于質粒構建的克隆宿主為大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109,表達宿主為E.coliBL21(DE3),用于大腸桿菌體系的表達質粒為pCDFDuet。實驗所用及構建的菌株、質粒如表1所示,引物序列參見表2,引物合成由天霖生物有限公司完成。

表1 本研究所用菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.1.2 實驗試劑

DNA聚合酶及Marker,TaKaRa公司;同源重組酶、DNA 純化及質粒提取試劑盒,諾維贊公司。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10,自然pH。

種子培養基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉5,NaCl 0.50,KCl 0.19,MgCl20.95,葡萄糖3.60,pH 7.0;微量元素2 mL/L。

發酵培養基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉5,NaCl 0.50,KCl 0.19,MgCl20.95,葡萄糖3.60,pH 7.0;微量元素2 mL/L。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in the study

補料培養基(g/L):葡萄糖400,胰蛋白胨100,酵母粉80,MgSO414;微量元素14 mL/L。

微量元素溶液(g/L):FeCl3·6H2O 6,ZnSO4·7H2O 0.58,CaCl20.20,CuCl2·2H2O 0.20,MnSO4·H2O 0.30,EDTA 0.50。

1.2 重組質粒的構建

以pCDFDuet-Nampt質粒構建為例,以大腸桿菌基因組為模板,擴增獲得基因片段(引物如表1所示),選用誘導型質粒pCDFDuet,用限制性核酸內切酶ndeI、kpnI雙酶切后,將其與目的基因進行同源重組連接,然后將重組產物轉入JM109感受態細胞,在含有鏈霉素的LB平板上篩選陽性克隆,得重組質粒。

1.3 CRISPR/Cas9系統敲除大腸桿菌基因

使用CRISPR/Cas9雙質粒系統敲除pncC、nadR、ushA基因,以敲除pncC為例,將含有Cas9編碼基因的pCas9質粒化轉入表達宿主中,然后制備成電轉感受態。

通過網站CHOPCHOP設計得到sgRNA序列,采用引物pncC-sgRNA-F和pncC-sgRNA-R將打靶質粒pTarget進行PCR反向擴增,引入20 bp的sgRNA序列,隨后進行轉化提取質粒,獲得基因敲除打靶質粒pTarget-pncC。

選取目標基因上下游各500 bp,采用引物分別擴增基因上游同源臂、基因下游同源臂,然后利用重疊延伸PCR技術獲得1 000 bp的上下游同源臂,構建獲得修復模板。

將敲除質粒和修復模板電轉入感受態中,驗證敲除正確后,誘導pCas9質粒定位pTarget質粒上的sgRNA,從而消除pTarget質粒;借助pCas9質粒是溫敏型質粒的特性,在42 ℃培養12～15 h,消除pCas9質粒,得到BL21(DE3)ΔpncC。

1.4 基因表達的鑒定

挑取單克隆于10 mL的LB培養基中,37 ℃培養12 h。再將上述菌液按1%接種量轉接30 mL發酵培養基中培養,37 ℃培養至OD600值為0.6～0.8時,添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,于25 ℃下誘導8～12 h,取樣,離心,菌體經超聲破碎,取上清液,采用SDS-PAGE檢測目標蛋白。

1.5 重組菌株的發酵研究

種子培養:從活化平板上挑取單菌落接種至10 mL LB液體培養基中,添加終質量濃度100 μg/mL鏈霉素,37 ℃、220 r/min 振蕩培養10～12 h。

搖瓶發酵:種子液按1%接種量轉接30 mL發酵培養基中,37 ℃培養至OD600值為0.6～0.8時,添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,于25 ℃下誘導8～12 h,測定NMN積累量。

5 L罐發酵:將種子培養液按照10%(體積分數)接種量轉接于5 L發酵罐,初始培養溫度37 ℃,pH值控制在7.0±0.2,通氣量設置為0.18 m3/h,轉速關聯溶氧量自動調節,溶氧量維持在10%～30%,裝液量3 L,菌體培養至OD600值為8～10時,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導,表達培養溫度為25 ℃,定期取樣測定生物量和NMN產量。

1.6 檢測方法

NMN檢測方法:取發酵液1 mL,離心取上清液即為發酵上清液;菌體經磷酸鈉緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌后超聲破碎,離心后取上清液即為胞內上清液。樣品測定前通過孔徑0.22 μm的濾膜過濾,然后用高效液相色譜進行檢測。液相色譜柱為Diamonsil 5 μL C18 250 mm×4.6 mm;流動相A:100%甲醇,流動相B:5 mmol/L四丁基氫氧化的5%甲醇水溶液。流速為0.7 mL/min;檢測波長為254 nm,進樣量為10 μL,柱溫30 ℃。洗脫方案:0～20 min,100% A;20～25 min,40% A、60% B;25～35 min,20% A、80% B;35～40 min,100% A。

發酵液中葡萄糖含量測定:利用西爾曼生物生物傳感器進行分析。

2 結果與分析

2.1 構建NMN合成途徑

大多數細菌通過NAD+替代補救途徑即煙酸核苷激酶從NR和ATP生成,而在哺乳動物生物體中,可以通過NAD+補救途徑即通過Nampt以PRPP 和NAM為底物生成NMN,因NR較為昂貴,目前微生物發酵法生產NMN大多采用NAD+補救途徑,通過篩選異源Nampt生產NMN[21]。本研究以大腸桿菌為表達體系,以松噬幾丁質菌來源的Nampt基因片段構建NMN合成途徑(圖1-a),首先,通過PCR擴增獲得Nampt基因片段,將目的片段和雙酶切載體進行同源重組、連接轉化獲得轉化子。Nampt基因片段長度約為1 400 bp,菌落PCR驗證,其目的條帶大小與預期一致,提取質粒送樣測序,確認重組質粒構建成功,轉入表達宿主,獲得了重組菌B1。將B1菌株發酵10 h后,收集菌體進行超聲破碎,取上清液進行SDS-PAGE分析(圖1-b)。

Nampt基因表達的目的蛋白理論分子質量為52.7 kDa,其SDS-PAGE目的條帶與理論值基本一致。將重組菌株進行搖瓶發酵,生成的NMN產量為12.1 mg/L,而對照組未測出NMN。

a-pcDFDuet-Nampt重組質粒圖譜;b-重組蛋白Nampt的 SDS-PAGE電泳分析圖( M-蛋白Marker;1-空白對照, 含空載質粒的BL21(DE3);2-發酵上清液;3-破壁上清液)圖1 重組蛋白Nampt的構建和驗證Fig.1 Construction and validation of the recombinant protein Nampt

2.2 增強PRPP途徑

合成NMN所需的前體之一是PRPP,PRPP的生物合成途徑與細胞生長競爭碳通量[22],因此提高NMN產量的重要策略之一就是增強PRPP的供應。根據代謝網絡,PRPP是細胞重要代謝中間體,涉及嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸、色氨酸、組氨酸等多種代謝產物合成。PRPP主要通過磷酸戊糖途徑生成,因此可將相關基因進行過表達來增強PRPP的供應,本研究構建了質粒pcDFDuet-zwf-pgl-gnd-rpiA-rpiB-prs-Nampt,表示為pcDFDuet-zwf→Nampt,如圖2-a所示,將該質粒導入獲得重組菌B2。通過SDS-PAGE對6-磷酸葡萄糖脫氫酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖內酯酶(pgl)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(gnd)、戊糖磷酸異構酶(rpiA、rpiB)、PRPP合酶(prs)的表達情況進行驗證分析,結果如圖2-b所示。zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、prs基因表達的目的蛋白理論分子質量分別為55.7、36.3、51.5、22.9、16.1、33.9 kDa,這6個蛋白的SDS-PAGE條帶與理論相符,大小一致,說明均已成功表達。經發酵驗證,其NMN產量為31.7 mg/L,是未強化的工程菌產量2.6倍,但是搖瓶OD600最大值為2.7,低于空白對照(OD600=3.1),推測單質粒共表達多個酶對宿主的負擔較大,影響了生長。

a-pcDFDuet-zwf→Nampt重組質粒示意圖譜; b-重組蛋白SDS-PAGE電泳圖 (M-蛋白質Marker;1-空白對照;2-破壁上清液)圖2 重組質粒pcDFDuet-zwf→Nampt的構建和驗證Fig.2 Construction and validation of the recombinant plasmid pcDFDuet-zwf→Nampt

2.3 NMN下游代謝途徑的基因敲除

弱化目的產物的降解是一種有效提高產量的代謝改造方式。大腸桿菌中NMN的下游代謝主要是進行NR、NAD的合成(圖3),如需在大腸桿菌有效積累NMN,必須對其代謝途徑進行阻斷。為此,本研究利用CRISPR/Cas9系統精準敲除了NMN代謝過程中關鍵基因pncC、ushA和NAD衍生物調控基因nadR,獲得有利于積累NMN的基因工程菌。

圖3 大腸桿菌利用葡萄糖和煙酰胺合成NMN的代謝途徑Fig.3 Synthesis of NMN by E.coli using glucose and niacinamide注:紅色箭頭表示利用質粒進行過表達,pncC、ushA、nadR為 本研究敲除基因。

2.3.1 NMN氨基水解酶的失活

大腸桿菌中的NMN氨基水解酶(PncC)可將煙酰胺單核苷酸脫氨為煙酸單核苷酸,本文在加強途徑酶表達的基礎上敲除NMN氨基水解酶,按照1.3節中的方法對該基因進行敲除。構建修復模板(圖4-a)和打靶質粒(圖4-b),驗證結果如圖4-c所示。NMN氨基水解酶基因大小為498 bp,若敲除成功,則條帶大小應約為1 200 bp,將條帶大小正確的擴增片段進一步測序驗證。測序結果顯示與同源臂序列一致,表明pncC基因敲除成功。將該工程菌B3進行搖瓶發酵,以HPLC檢測產量如圖5所示,發酵結果表明該基因敲除后未對菌株的生長造成影響,而產量提升至44.3 mg/L。

2.3.2 5-核苷酸酶的失活

如圖3大腸桿菌中代謝網絡所示,5-核苷酸酶(UshA)可催化NMN變成煙酰胺核糖苷NR。為進一步提高NMN的產量,在敲除NMN氨基水解酶的基礎上繼續敲除5-核苷酸酶。5-核苷酸酶基因大小為1 653 bp,敲除后約為1 200 bp,驗證結果如圖4-d所示,將該改造菌B4進行搖瓶發酵,結果如圖6所示,表明敲除5-核苷酸酶未對菌株的生長造成影響,NMN產量則提升至51.6 mg/L。

a-修復模板擴增產物(泳道1、2為擴增條帶);b-pTargetF質粒 擴增產物(泳道1、2為擴增條帶);c-pncC基因敲除驗證(泳道1為 對照菌株,泳道2為pncC基因敲除的菌株);d-pncC、ushA基因敲除 驗證(泳道1、3為對照菌株,泳道2、4分別為pncC、ushA基因敲除的 菌株);e-pncC、ushA、nadR基因敲除驗證(泳道1、3、5為對照菌株, 泳道2、4、6分別為pncC、ushA、nadR基因敲除的菌株)圖4 基因敲除菌株的電泳驗證圖Fig.4 Verification electropherogram of gene knockout strains注:M-DNA marker。

2.3.3 NAD衍生物合成調控酶的失活

大腸桿菌中存在一種調控酶(NadR),具有調控NAD衍生物合成的能力,這是一種負反饋調控,當NAD衍生物累積一定量時會抑制NMN合成關鍵酶Nampt的表達,不利于NMN的積累。NadR調控酶基因大小為1 233 bp,未敲除成功的條帶大小約為2 400 bp,成功敲除的約為1 200 bp(圖4-e)。將該改造菌進行搖瓶發酵,結果表明,敲除未對菌株的生長造成明顯影響,NMN能夠得到有效積累,產量提升至60 mg/L,為初始表達產量的4.95倍。

a-標準品的HPLC檢測圖譜;b-發酵破碎上清液的HPLC檢測圖譜圖5 NMN的標準品及發酵液HPLC檢測圖譜Fig.5 HPLC detection results of NMN standards and fermentation broth

a-最大OD600測定值;b-發酵結束NMN終產量圖6 重組菌株的搖瓶發酵參數Fig.6 Shaker fermentation parameters of recombinant strains注:B0-空白對照菌株;B1-BL21(DE3)pCDFDuet-Nampt;B2-BL21(DE3) pCDFDuet-zwf→Nampt;B3-B2ΔpncC;B4-B3ΔushA;B5-B4ΔnadR。

2.4 小罐發酵工藝研究

為了進一步探究工程菌的發酵合成潛力,在5 L小罐上進行發酵工藝研究。考察了兩種發酵策略對菌體生長及產量的影響(圖7)。第一種如圖7-a所示,當葡萄糖消耗完,開始流加葡萄糖和煙酰胺,葡萄糖作為菌體生長的碳源的同時也是合成NMN的前體物質,發酵過程中控制流加速度使葡萄糖和煙酰胺維持在較低濃度,最高NMN產量為290.7 mg/L;第二種如圖7-b所示,當葡萄糖消耗完后,開始補料培養基和煙酰胺,同樣控制流加速度使葡萄糖和煙酰胺維持在較低濃度,避免高濃度導致的高滲透壓對菌體生長帶來不利影響,在36 h時產量最高達到390.1 mg/L,是搖瓶水平的6.5倍,OD600值最高為16.4。相比而言,第二種補料策略較好,可能是培養基的成分更豐富,能充分滿足菌體生長的需要,進而影響NMN的合成。

a-流加葡萄糖、煙酰胺的發酵過程參數;b-補料培養基、 葡萄糖、煙酰胺的發酵過程參數圖7 重組菌在5 L發酵罐中發酵生產NMN的過程曲線Fig.7 Process curve of NMN production by the recombinant strain in 5 L fermenter

3 結論

本研究以大腸桿菌BL21(DE3)作為表達宿主,通過引入外源松噬幾丁質菌的Nampt基因,在大腸桿菌中成功實現了NMN的生物合成。通過強化表達大腸桿菌自身的zwf、pgl、gnd、ripA、ripB、prs基因,增強了PRPP途徑的合成能力。為了使大腸桿菌有效積累產物NMN,敲除了NMN的代謝基因pncC、ushA以及調控因子nadR。進而通過重組菌株的發酵工藝的初步研究,使菌株的搖瓶最高產量為60 mg/L,5 L發酵罐產量達到390.1 mg/L。后期研究將基于該工程菌株,重點開展關鍵合成基因的性能提升、前體物質的進胞、產物出胞以及基于細胞能量水平的優化工作,進一步探索高產NMN的工程菌株構建策略。