一種兼具腈水合酶活性與硫氰酸水解酶活性的新型腈類降解酶

吳桐,程中一,周哲敏

(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase;EC4.2.1.84)[1-2]是一種金屬酶,可以在溫和的反應條件下催化腈類物質生成對應的酰胺[3]。雖然腈水合酶已經成功應用于煙酰胺和丙烯酰胺的大規模工業生產[4-5],但是其完整的催化機制仍然不為人知,學者們已經為此進行大量的實驗和理論研究[6]。

常規的腈水合酶有異源的α和β兩個亞基[7-8],其可以結合成異源二聚體、四聚體、或者更高的聚合形式[9]。存在于腈水合酶基因簇下游的調控蛋白基因幾乎存在于已知的所有腈水合酶,它對腈水合酶的金屬攝取和翻譯后修飾是必不可少的[10-12](唯一例外的是來自于M.brevicollis的CtNHase,至今沒有關于它的調控蛋白的報道[13])。根據活性中心金屬離子的不同可以將腈水合酶分為鐵型腈水合酶(Fe-NHase)和鈷型腈水合酶(Co-NHase)。所有已知腈水合酶的金屬結合位點都存在于α亞基上[14],它們都含有一段共同的金屬結合基序[CXLC(SO2H)SC(SOH)],這段序列包含了2個氧化的半胱氨酸[7, 15]。質譜已經證明2個氧化的半胱氨酸和金屬離子組成了一個獨特的配位結構,被稱為“爪形”結構[16-17]。

硫氰酸水解酶(SCNase)是一種主要來自于硫桿菌屬的含鈷酶,能夠催化焦化廢水中的主要成分-硫氰酸鹽降解(SCN-+2H2O→COS+NH3+OH-),它由α,β,γ 3個亞基組成[18]。γ亞基與腈水合酶的α亞基有很高的序列相似度,α亞基和β亞基分別與腈水合酶β亞基的N端和C端相似。硫氰酸水解酶與腈水合酶同屬一個超家族,雖然SCNase在結構上與Co-NHase有很高的相似性,包括一個獨特的低自旋三價Co催化中心和2個氧化的半胱氨酸配體,但是它們只作用于各自的底物[19]。研究表明它們的底物結合口袋有差異,這可能是其活性不互通的原因[20]。SCNase可以降解硫氰酸鹽,這種物質通常在采礦、紡織的工業廢水中大量存在,不僅對環境造成污染,對人類也有嚴重的毒害作用。因此對硫氰酸鹽的研究可能幫助解決工業廢水的排污問題。

通過在公共數據庫里搜尋,我們發現了一種來源于Roseomonasstagni的新基因型的SCNase,其3個亞基的Genbank編號分別為SAMN02745775_103231、SAMN02745775_103232和SAMN02745775_103230。這3個亞基中SAMN02745775_103231所編碼的亞基與腈水合酶α亞基有較高的相似度,其余2個亞基分別與常規腈水合酶β亞基的N端和C端同源。本研究表達、純化并且對這個特殊的腈類降解酶(Rose.sSCNase)進行了表征。有趣的是,Rose.sSCNase不僅能催化腈類底物,對硫氰酸鉀也有催化活性,這是迄今為止發現的第一個存在活性互通的腈類降解酶。Rose.sSCNase可能對含氰基底物降解研究有巨大的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

由金唯智生物技術有限公司合成玫瑰單胞菌Rose.sSCNase基因,克隆到pET-Duet質粒上。Rose.sNHase在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達。吡啶和酰胺購自TCI(上海)發展有限公司。所有其他化學品都是通過商業途徑獲得的。

100 mmol/L KPB緩沖液:磷酸氫二鉀13.95 g、磷酸二氫鉀10.92 g,用磷酸二氫鉀調節pH為7.4,定容至1 L。蛋白純化用Binding buffer:10 mmol/L KPB緩沖液。Washing buffer:在上述Binding buffer中加入終濃度為500 mmol/L的氯化鈉。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息分析

利用NCBI-blast工具,將含有CTLCSC基序的酶進行初篩。調查研究背景,利用DNAMAN對酶活性中心的氨基酸序列進行復篩。最終選擇來源于玫瑰單胞菌Roseomonasstagni的腈水合酶(Rose.sSCNase)進行研究。并利用AlphaFold對所選酶進行三維結構預測。

1.2.2 表達載體的構建及表達

將Rose.sSCNase進行密碼子優化,將優化好的序列送至金唯智公司進行基因合成。各亞基前添加T7啟動子和優化過的RBS序列(AAGGAGATATAGAT)使其共表達。選擇pET-Duet-1為連接載體,基因插入位置為NdeⅠ和EcoRⅠ2個酶切位點。將連接成功的質粒pETDuet-1-Rose.sSCNase轉化至BL21(DE3)感受態細胞,涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板上。37 ℃倒放靜置過夜培養。挑取單菌落接于含有100 μg/mL氨芐青霉素的5 mL LB液體培養基的試管中。37 ℃,200 r/min培養8 h左右。將試管種子液以1%的接種量轉接至含有100 μg/mL氨芐青霉素的2YT培養基搖瓶中。37 ℃、200 r/min培養至OD600=0.6～0.8時[21],添加不同終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)和0.05、0.1、0.2、0.3 g/L Co2+的誘導劑,25 ℃,200 r/min誘導16 h。離心收菌并用10 mmol/L KPB重懸、破碎細胞、獲取上清液并通過SDS-PAGE分析蛋白表達情況。

1.2.3 酶的分離純化及濃度檢測

因標簽純化該酶效果較差,故采用傳統硫酸銨沉淀、陰離子層析交換、凝膠柱過濾的方法分布進行純化。具體步驟為將細胞破碎獲取上清液定容至30 mL。參照硫酸銨飽和度計算表(0 ℃),逐步緩慢加入質量分數依次為20%、40%、60%及80%的硫酸銨粉末,邊緩慢加入邊攪拌直至硫酸銨充分溶解。過程中要嚴格監測pH值和溫度變化,防止蛋白到達等電點或高溫變性沉淀。過程中可利用氨水和磷酸二氫鉀緩沖對調節pH值。每加完一個濃度梯度后繼續攪拌30 min,然后用離心機以12 000 r/min離心 20 min,重懸沉淀并收集上清液用于下一個梯度的硫酸銨沉淀。如此往復,直到硫酸銨溶液的飽和度為80%。每次收集的沉淀用適量10 mmol/L KPB緩沖液重懸,用于SDS-PAGE分析,由此確定目的蛋白所在的沉降區間,為下一次操作簡化步驟。獲得的含有目的蛋白的沉淀用10 mmol/L KPB緩沖液重懸至10 mL,并在4 ℃層析柜中透析12 h,期間每4 h更換一次透析液來去除高濃度的鹽離子。

Rose.sSCNase的理論等電點在5左右,所以選取DEAE陰離子交換柱,進一步純化透析好的蛋白[22]。首先用Binding-Buffer平衡,然后上樣,再用Washing-Buffer進行線性洗脫(0～500 mmol/L NaCl),將不同UV吸收峰的蛋白進行收集,SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白的洗脫范圍[23]。

凝膠過濾層析對以上獲得的蛋白樣品中含有分子質量差異較大雜蛋白的樣品進行分離。本研究中使用的凝膠柱為Superdex G200。首先用10 mmol/LKPB緩沖液以0.5 mL/min的流速平衡柱子,通過Loop環注入少量樣品(300～500 μL),切換流動線路使樣品進入凝膠柱中進行分離。最后根據吸收值再進行SDS-PAGE電泳分析。得到的蛋白用Brandford法測定蛋白質量濃度后稀釋至質量濃度1 mg/mL備用。

1.2.4 酶活力檢測

本研究中腈水合的活性通過催化腈類生成相應的酰胺量來計算[24]。反應體系為490 μL煙腈(200 mmol/L)及 10 μL酶溶液,在不同溫度的金屬浴中反應10 min,然后加入500 μL純乙腈終止反應。反應液使用0.22 μm的有機微孔過濾膜過濾,用HPLC檢測樣品。HPLC使用的色譜柱為C18反相色譜柱,檢測波長為215 nm,流動相為體積比為1∶2的乙腈與水的混合溶液。根據不同濃度煙酰胺標準品的對應吸收值作標準曲線,并依此計算樣品中的煙酰胺濃度。催化煙腈的酶活力單位定義為:在相應條件下每分鐘催化煙腈生成1 μmol煙酰胺所需要的酶量。催化丙烯腈的酶活力單位定義為:在相應條件下每分鐘催化丙烯腈生成1 μmol丙烯酰胺所需要的酶量。

水解硫氰酸鹽的活性通過催化硫氰酸鉀生成的銨鹽的量來計算,銨鹽檢測使用銨鹽檢測試劑盒(美國Sigma公司)。反應體系為450 μL硫氰酸鉀(50 mmol/L)及50 μL酶溶液,在不同溫度的金屬浴中反應10 min,然后100 ℃加熱20 min終止反應。硫氰酸水解酶的酶活力單位定義為:在相應條件下每分鐘催化硫氰酸鉀生成1 μmol銨鹽所需要的酶量。

1.2.5 酶學性質

最適溫度:分別測定該酶在20、30、40、50、60、70 ℃下的酶活力。

最適pH:配制含有終濃度為200 mmol/L煙腈、丙烯腈和終濃度為50 mmol/L硫氰酸鉀的不同pH梯度(pH=4、5、6、7、8、9)的10 mmol/L磷酸鉀緩沖液,測定該酶在各pH底物緩沖溶液下的酶活力,分析其隨pH的變化情況。

2 結果與分析

2.1 Rose.s NHase基因的異源表達及其分離純化

圖1為用于表達Rose.sSCNase的質粒示意圖。pETDuet-1作為載體,RBS是核糖體結合位點,質粒上帶有氨芐青霉素抗性基因。

圖1 表達含有βN、βC、α亞基的Rose.s SCNase的質粒Fig.1 Expression plasmid of Rose.s SCNase containing βN, βC and α subunits

優化劑濃度初步的確定參照文獻[25-26]的要求。Co2+對腈水合酶翻譯后修飾和發揮活性具有重要作用,過高濃度的Co2+會抑制菌體生長從而影響蛋白的表達。IPTG也對酶的誘導表達有影響。因此對Co2+和IPTG濃度進行優化,結果如圖2所示,從SDS-PAGE圖中確定最佳誘導條件為Co2+0.1 g/L、IPTG 0.6 mmol/L。

圖2 優化誘導表達條件的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of optimized induced expression conditions

因Strep親和層析純化效果不佳,因此在純化策略上選擇硫酸銨沉淀-陰離子交換-凝膠柱分步的方法。分級硫酸銨沉淀的結果如圖3-a所示,目的蛋白在飽和度20%～40%析出最多,通過硫酸銨沉淀,基本去除了雜蛋白。該酶的理論等電點為5.2,因此采用DEAE陰離子柱交換進行進一步純化,最后經過凝膠柱分離,得到了純度>95%的蛋白,成功實現了其純化(圖3-b)。

a-Rose.s SCNase分級硫銨沉淀樣品的SDS-PAGE分析; b-Rose.s SCNase純化的SDS-PAGE分析圖3 Rose.s SCNase純化過程的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification process of Rose.s SCNase

2.2 酶學性質的分析

不同的反應溫度對Rose.sSCNase酶活的影響如圖4-a所示,該酶對腈類和硫氰酸鉀底物的最適溫度均為40 ℃。催化腈類底物的最適pH為7.0,降解硫氰酸鉀的最適pH為6.0(圖4-b)。這表明Rose.sSCNase是中性的。

a-不同底物的最適溫度;b-不同底物的最適pH圖4 Rose.s SCNase的酶學性質Fig.4 Enzymatic properties of Rose.s SCNase

與其他腈類降解酶相比,Rose.sSCNase最為獨特的是它同時擁有硫氰酸水解酶和腈水合酶2種酶的活性。該酶在最適pH和溫度下對煙腈的比酶活為(17.8±1.3) U/mg,對丙烯腈的比酶活為(30.6±1.9) U/mg,對硫氰酸鉀的比酶活為(13.5±0.9) U/mg。具體見表1。

表1 Rose.s Nhase最適條件下的活性Table 1 activity of Rose.s Nhase under optimum conditions

2.3 序列比對

將Rose.sSCNase的氨基酸序列與Th-Scnase、Pt-NHase的序列進行比對,結果如圖5所示。Rose.sSCNase與Th-Scnase和Pt-NHase α亞基的相似度為65.05%,β亞基的相似度為36.32%。且均含有鈷離子結合位點CTLCSC。

a-α亞基序列對比;b-β亞基序列比對圖5 Rose.s SCNase與Th-SCNase和ptNhase的序列比對Fig.5 Enzymatic properties of Rose.s SCNase注:紅色表示在該位置有相同的氨基酸。

2.4 結構分析

圖6為使用AlphaFold預測得到的Rose.sSCNase的結構。用Verify 3D服務器對獲得的模型進行評估,最高得分為99.16%,表明所得的三維結構比較可靠。用所獲得的結構進行下一步結構比對。

根據之前的報道,腈水合酶和硫氰酸水解酶雖屬于同一家族但活性并不互通。2014年有學者研究發現是其底物結合口袋不同導致了不同的底物選擇性[20]。作者將硫氰酸水解酶底物結合口袋頂部2個精氨酸分別突變成了苯丙氨酸Phe和色氨酸Trp,這2個突變體喪失了降解硫氰酸鹽的活性,同時卻產生了腈水合酶的活性。基于這一研究,我們將Rose.sSCNase與嗜熱假諾卡氏菌P.thermophilaJCM3095腈水合酶(Pt-NHase)和ThiobacillusthioparusTHI115來源的硫氰酸水解酶(Th-SCnase)進行結構比對,二者的RMSD值分別為0.96和0.88,這表明這株新的腈類降解酶與腈水合酶和硫氰酸水解酶均有較高的結構相似度。結構對比上更偏向硫氰酸水解酶,所以本研究中命名其為Rose.sSCNase。

比對結果顯示三者的底物結合口袋非常相似。不同之處在于活性金屬上方頂部空間的氨基酸(圖7)。Rose.sSCNase和Th-SCnase在此位置是精氨酸Arg,精氨酸側鏈向口袋延伸,可使底物結合口袋頂部空間呈正電,更有利于結合硫氰酸鹽底物。而Pt-NHase對應的位置是色氨酸Trp,這個疏水基團可能更有利于其捕獲腈類底物。且色氨酸向口袋頂部延伸,增高了頂部空間,更有利于腈類底物進入活性中心。

a-Rose.s SCNase與Pt-NHase結合口袋對比圖; b-Rose.s SCNase與Th-SCnase結合口袋對比圖圖7 Rose.s SCNase底物結合口袋比對圖Fig.7 Comparison of substrate binding pocket of Rose.s NHase注:綠色為Rose.s SCNase,青色為Pt-NHase,紫色為Th-SCNase, 黃色代表關鍵位置上精氨酸Arg,橙色代表關鍵位置上的色氨酸Trp, 紫色球代表活性中心的Co。

3 結論

本文成功優化了Rose.sSCNase的異源表達,并通過硫酸銨沉淀、陰離子交換和凝膠柱過濾的方法實現了其純化。與傳統的腈水合酶不同的是Rose.sSCNase對腈類底物和硫氰酸鉀均具有催化活性。Rose.sSCNase在最適條件下對煙腈的比酶活為(17.8±1.3) U/mg,對丙烯腈的比酶活為(30.6±1.9) U/mg,對硫氰酸鉀的比酶活為(13.5±0.9) U/mg。比對Rose.sSCNase、Pt-NHase和Th-SCnase的底物結合口袋的氨基酸,發現活性金屬頂部的氨基酸有差異,這可能控制了酶的選擇性。