基于神經網絡和響應面法對比優化富硒綠豆芽蛋白提取工藝研究

王露露,明佳佳,2,楊濤,2,徐晨鳳,肖園園,張馳,鄧伶俐,商龍臣,2*

1(湖北民族大學 生物與食品工程學院,湖北 恩施,445000) 2(恩施土家族苗族自治州農業科學院,湖北 恩施,445000)

綠豆芽是綠豆種子經浸泡萌發后產生的具有豐富營養的蔬菜,含有大量的維生素、礦物質以及多種植物營養素(如硫代葡萄糖苷、酚類物質和異黃酮),兼具減少抗營養因子(如植酸、單寧酸和草酸鹽)、增加礦物質的生物可及性的功效[1]。另外,在綠豆萌發為綠豆芽的過程中,部分蛋白質會分解為人體所需的氨基酸,為食用者提供豐富的營養物質。生物硒強化正是利用種子萌發過程以提高芽苗菜有機硒含量的一種簡單而又高效的富硒食品開發技術[2]。種子萌發期間無機硒會轉化為硒蛋白、硒多糖等有機硒,而其中硒蛋白的生物利用度可高達90%以上[3]。

當前,已有眾多研究探討了各類有機硒化合物的提取工藝,響應面(response surface methodology,RSM)和人工神經網絡(artificial neural network,ANN)等技術被廣泛應用于工藝優化和過程模擬之中[4]。RSM是一種通過一系列確定性實驗,用多項式函數模擬真實極限狀態曲面的方法。但RSM模型中的所有試驗是基于單因素選擇的試驗點,當試驗點的選擇不合適時,則得不到理想的優化效果[5]。ANN是一種類似于生物結構的建模工具,通過尋找輸入和輸出數據中復雜的非線性關系,進而輸出預測數據的方法[6]。遺傳算法(genetic algorithm,GA)是“適者生存”概念啟發式方法的優化算法之一,可對已構建的神經網絡進行全局搜索與優化,進而獲得最優解[7]。迄今為止,遺傳算法-人工神經網絡(GA-ANN)已被應用于如甜葉菊葉提取物[8]、多酚[9]、類黃酮[10]、硒蛋白[11]和多糖[12]等各種天然產物的提取工藝優化。有研究表明,與RSM方法相比,GA-ANN的應用可實現更高的預測準確性,并且更接近實驗數據[13]。

本研究在單因素實驗基礎上,分別應用RSM和GA-ANN模型對蛋白提取工藝進行優化,并從多角度評估了2種模型的預測性能,在此基礎上分析了富硒綠豆芽蛋白的氨基酸含量和有機硒形態,本研究為人工智能技術在功能性富硒食品的開發提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆(內蒙古赤峰市所產),沈陽信昌糧食貿易有限公司。

牛血清蛋白,上海藍季生物有限公司;考馬斯亮藍G250、氯化鈉、氫氧化鈉、乙醇、甲酸、鹽酸、檸檬酸鈉,國藥集團化學試劑有限公司;乙腈,美國ACS公司;氨基酸混標,和光純藥工業株式會社;硒代甲硫氨酸,上海麥克林生化科技有限公司;硒代胱氨酸,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CB-A330豆芽機,佛山市順德區嘉壕實業有限公司;LD-Y500A粉碎機,上海頂帥電器有限公司;CARY300Conc紫外可見分光光度計,美國Varina公司;SH220F石墨消解儀,山東海能科學儀器有限公司;K9860全自動凱氏定氮儀,山東海能科學儀器有限公司;LA8080氨基酸自動分析儀,日本株式會社日立高新技術科學;1290-6470液相色譜儀質譜儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒綠豆芽粉的制備

選取大小均勻、完好無缺的綠豆,用分析天平稱重后清洗干凈[14]。然后使用10 mg/L的硒溶液浸泡綠豆,料液比為1∶3(g∶mL)。將浸泡后的綠豆置于豆芽機中進行避光培養3 d,取出放入45 ℃的電熱鼓風干燥箱內烘干24 h,用粉碎機粉碎,過60目篩后放入自封袋于干燥器內保存。

1.3.2 富硒綠豆芽蛋白提取溶劑的選擇

參考徐亞等[15]的方法測定上清液中蛋白含量,富硒綠豆芽粉中的蛋白含量參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。稱取4份富硒綠豆芽粉各1 g于4個離心管中,按液料比20∶1(mL∶g)分別向離心管中加入純水、NaCl溶液(0.5 mol/L)、乙醇溶液(體積分數75%)、堿液(0.1 mol/L NaOH溶液),在50 ℃下提取60 min后,10 000 r/min離心10 min,測定上清液內蛋白含量,根據4種溶劑的蛋白提取率來選擇提取溶劑。蛋白質提取率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:M1為上清液中蛋白含量,%,M2為富硒綠豆芽粉中蛋白含量,%。

1.3.3 單因素試驗設計

選取堿液濃度(0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1,mL∶g)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時間(30、60、90、120、150 min)和提取次數(1、2、3次)5個因素進行單因素試驗,探究其對蛋白質提取率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

根據單因素實驗結果,設計4因素3水平的響應面實驗,探究因素水平組合對蛋白質提取率的影響,確定最優提取條件。

1.3.5 人工神經網絡建模

選擇響應面模型中的89個數據構建ANN模型,其中模型訓練使用70%的數據,驗證訓練使用15%,其余的用于測試。計算模型各參數以評估模型的預測和優化性能,其主要系數包括:相關系數(R2)、均方根誤差(root mean square error,RMSE)、絕對平均偏差(absolute average deviation,AAD)和預測標準誤差(standard error of prediction,SEP),R2越高,RMSE、AAD和SEP越低,則表明所建立的模型越可靠[16]。R2、RMSE、AAD和SEP的計算分別如公式(2)～公式(5)所示:

(2)

(3)

(4)

(5)

式中:n代表樣本數,Ye代表實驗值,Yp代表預測值,變量上的“-”表示相關變量值的平均值。

1.3.6 GA優化人工神經網絡模型

以ANN的輸出值(蛋白質提取率)為適應度函數值,根據適應度值從每一代的個體中不斷地進行選擇、交叉和變異,直至獲得最優個體,并預測相應的提取條件(堿液濃度、提取溫度、提取時間、液料比)。隱含層神經元的個數設為3～12,遺傳算法的最大進化代數設為100,種群大小為50,交叉概率與變異概率分別為0.8和0.2[11]。在最優提取工藝下提取蛋白的得率參考YANG等[11]的方法。

1.3.7 綠豆芽蛋白中氨基酸含量的測定

氨基酸含量參照GB 5009.124—2016中的方法進行測定。

1.3.8 綠豆芽蛋白中硒代氨基酸含量的測定

硒代氨基酸含量采用液相色譜儀質譜儀進行檢測。首先稱取一定量樣品于離心管中,然后加入5 mL 的Tris-HCl緩沖溶液(30 mmol/L)和20 mg胃蛋白酶XIV,混勻,放入37 ℃恒溫箱中孵育24 h,取出冷卻后10 000 r/min離心10 min,取上清液過0.45 μm 微孔濾膜后上機檢測。儀器條件如下:色譜柱:C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);采集模式:ESI+;柱溫:30 ℃;進樣量:2 μL;流速:0.3 mL/min;流動相:0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相);梯度洗脫:0 min:67% A+33% B;0.6 min:67% A+33% B;1.3 min:63% A+37% B;2.8 min:62.5% A+37.5% B;3.0 min:57% A+43% B;3.8 min:90% A+10% B;4.5 min:90% A+10% B;4.8 min:67% A+33% B。

1.4 數據處理

使用IBM SPSS statistic 26.0軟件進行單因素方差分析。采用Design-Expert ver 13.0軟件設計響應面試驗,并使用Matlab R 2016 a構建人工神經網絡模型。實驗結果用Graphpad prism 8.0.2和Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白提取溶劑的選擇

由圖1-a可知,富硒綠豆芽粉經純水、NaCl溶液(0.5 mol/L)、堿液(0.1 mol/L NaOH溶液)、乙醇溶液(體積分數75%)提取,蛋白質提取率分別為26.44%、58.50%、61.87%、15.99%。由以上數據可知,在4種提取溶劑中,堿液的蛋白提取率最高,其次是NaCl溶液,然后為純水,而醇溶液的蛋白提取率最低,且不同溶劑組蛋白質提取率間存在顯著性差異(P<0.05)。結合前人相關研究推測,之所以堿液的蛋白提取率最高,可能主要是因為綠豆芽粉中谷蛋白含量較高,而谷蛋白難溶于純水、乙醇或中性鹽溶液,但較易溶于堿[17]。因此,基于當前的研究結果,后續蛋白的提取均選擇堿液為提取溶劑以獲得更高的蛋白質得率。

a-提取溶劑;b-堿液濃度;c-液料比;d-提取溫度;e-提取時間;f-提取次數圖1 各單因素對蛋白質提取率的影響Fig.1 Effects of single factors on protein extraction rate注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 富硒綠豆芽蛋白提取單因素實驗

由圖1-b可知,隨著堿液濃度的增加,蛋白質提取率先升高后降低,在堿液濃度為0.15 mol/L時,蛋白質提取率最高,各組間蛋白質提取率存在顯著性差異(P<0.05)。在堿液濃度為0.01～0.15 mol/L時,可能是由于蛋白被水解,增加了蛋白的親水性,因此提取率升高,但高堿濃度下會加強美拉德反應,造成部分氨基酸的降解,甚至會產生有毒物質[18]。因此選擇堿液濃度為0.1、0.15、0.2 mol/L進行響應面實驗。

由圖1-c可知,蛋白質提取率隨著液料比的增加先升高后降低,且各組間蛋白質提取率存在顯著性差異(P<0.05)。當液料比為40∶1(mL∶g)時,蛋白質提取率最高。可能的原因是,當液料比較低時,溶液的黏度和蛋白的濃度比較大,固相與液相濃度差較小,流動性小,導致蛋白質提取率較低;當液料比增加到40∶1時,綠豆芽粉與提取溶劑接觸面積增大,擴散程度就會增大;但當液料比大于40∶1后,蛋白質提取率表現出降低的趨勢,可能是因為過高的液料比降低了提取體系的黏度,使得溶出的蛋白在離心過程中更易沉降,一定程度上降低了上清液中的蛋白濃度,導致最終偏低的蛋白質提取率[11]。因此,選擇最佳液料比為30∶1、40∶1、50∶1進行響應面實驗。

如圖1-d可知,富硒綠豆芽蛋白質提取率隨著溫度的升高先增加后降低,在提取溫度為40 ℃時,蛋白質提取率最高。可能是因為適當的升溫使蛋白質分子結構舒展、運動速度加快,有助于蛋白質與水的相互作用,蛋白質提取率有所提高。但高溫會使部分蛋白結構發生改變而產生沉淀,溶解在溶液中的蛋白就會降低[19]。因此,選擇最佳提取溫度為30、40、50 ℃進行響應面實驗。

如圖1-e所示,當提取時間在30～120 min時,隨著提取時間的延長,蛋白質提取率逐漸升高,但繼續延長至150 min時,蛋白質提取率開始降低,且存在顯著性差異(P<0.05)。可能的原因是前期溶液中蛋白含量低,隨著提取時間的延長,樣品中的蛋白逐漸溶出;但過度延長提取時間,有可能導致充分溶出的部分蛋白因變性而沉降,或發生一定程度的降解,最終致使上清液中的蛋白濃度降低[11]。因此,選擇最佳提取時間為60、90、120 min進行響應面實驗。

如圖1-f所示,隨著提取次數的增加,蛋白質提取率逐漸升高,第2次的蛋白提取率顯著高于第1次(P<0.05),但第3次與第2次的蛋白質提取率已無顯著性差異(P>0.05),表明第3次只能提取少量蛋白質,這與YANG等[11]的研究結果一致。因此,選擇蛋白的最佳提取次數為2次。

2.3 響應面試驗與人工神經網絡訓練結果

2.3.1 響應面優化蛋白提取條件

在單因素的實驗基礎上,探究自變量及各因素間的交互作用對蛋白質提取率的影響。采用Design-Expert 13.0軟件進行多元回歸方程擬合,得到回歸方程:Y=81.16+0.58A-7.38B-1.82C+3.88D+3.30AB-6.02AC-3.67AD-0.87BC-1.28BD-4.26CD-5.65A2-8.82B2-2.31C2-5.56D2。響應面試驗設計方案及結果見表1。

對蛋白質提取率的回歸模型進行方差分析,回歸模型方差分析結果見表2。由表2可知,該模型的F值為43.14,P值小于0.000 1,表示模型極顯著,失擬項P值為0.334 7(P>0.05),說明實驗受失擬因素的影響較小。模型的相關系數R2為0.9773,調整后的R2與預測的R2相差小于0.2,表明該模型可以對富硒綠豆芽蛋白的提取條件進行分析。表3中B、C、D、A2、B2、C2、D2、AB、AC、AD、CD具有極顯著性(P<0.01),而BC、BD對應的P值大于0.05,表明BC和BD的交互作用對蛋白質提取率的影響不顯著。比較F值的大小可以得出各因素對蛋白質提取率的影響大小依次為B>D>C>A。圖2體現了各因素之間交互作用對蛋白質提取率的影響。由圖2可知,AB、AC、AD和CD的曲面較為陡峭,等高線形狀趨近于橢圓形,說明兩兩因素交互作用明顯。BC、BD的曲面較平滑,因此交互作用不顯著。

表1 響應面試驗設計方案及結果Table 1 The design scheme and its results of the response surface test

表2 回歸模型方差分析Table 2 Regression model analysis of variance

圖2 各實驗因素交互作用對蛋白質提取率的影響Fig.2 Effects of interaction of various experimental factors on protein extraction rate

響應面模型分析得到最佳提取條件為:堿液濃度0.15 mol/L、提取溫度45.46 ℃、提取時間102.72 min、液料比46.28∶1(mL∶g)。預測蛋白質提取率為84.69%。為便于實際操作,將提取條件調整為:堿液濃度0.15 mol/L、提取溫度45 ℃、提取時間103 min、液料比46∶1(mL∶g)。在此條件下經過3次重復實驗,得到蛋白質提取率為86.34%,預測值與實際值相差1.65%。

2.3.2 人工神經網絡模型訓練相關性評價

通過人工神經網絡模型訓練發現隱含層的個數為8時,均方誤差最小,因此確定神經網絡的最佳拓撲結構為4-8-1,如圖3所示。由圖4可知,訓練集(0.996)、驗證集(0.996 31)、測試集(0.992 82)和全部數據集(0.995)的相關系數(R2)值表明,ANN模型具有很好的回歸和擬合能力。因此,說明人工神經網絡對訓練、驗證和測試的預測能力和模型在預測響應方面的精確度較高。

2.3.3 利用GA優化及驗證蛋白質提取工藝結果

由圖5可知,隨著迭代次數的增加,蛋白質提取率呈現曲折上升的趨勢,種群迭代進化87代以后,蛋白質提取率達到最大值,適應度函數趨于平穩。預測最優蛋白質提取率為91.62%,提取條件為堿液濃度0.15 mol/L,提取溫度42.52 ℃,提取時間133.36 min,液料比49.99∶1(mL∶g)。為便于實際操作,將各參數值調整為:堿液濃度0.15 mol/L,提取溫度43 ℃,提取時間133 min,液料比50∶1(mL∶g)。重復提取3次后蛋白質提取率為90.32%,與預測值相差1.30%。

圖3 神經網絡拓撲結構Fig.3 Neural network topology architecture

2.4 響應面與人工神經網絡對比分析

2.4.1 模型參數的比較以及模型預測值與實驗值的比較

表3為RSM和ANN的模型參數,由表3可以看出,2種模型的相關系數R2均超過0.95,表明模型具有較好的擬合度,但ANN的R2要高于RSM,且RMSE、AAD、SEP的值更低。因此,與RSM模型相比,人工神經網絡模型具有更好的建模能力。圖6描述了RSM和ANN的實驗值和預測值。由圖6可以看出,ANN的預測值與實驗值更接近,表明了ANN模型的預測精度更高。

a-訓練集;b-驗證集;c-測試集;d-全部數據集圖4 蛋白質提取率的目標輸出和網絡輸出的回歸分析Fig.4 Regression analysis of target output and network output of protein extraction rate

圖5 種群適應度值(蛋白質提取率)迭代變化曲線Fig.5 Iteration curve of population fitness value (protein extraction rate)

表3 RSM和ANN模型參數的比較Table 3 Comparison of RSM and ANN model parameters

圖6 RSM和ANN的預測值與實驗值的對比Fig.6 Comparison of predicted and experimental values of RSM and ANN

2.4.2 模型最優解的比較

RSM和GA-ANN分析得到最佳提取條件如表4所示,由表4可以看出,RSM的預測提取率與實驗提取率相差1.65%,GA-ANN的預測提取率與實驗提取率相差1.30%,GA-ANN預測值與實驗值的差值較RSM更小。表明了與RSM相比,GA-ANN模型更適合用來預測富硒綠豆芽蛋白的提取條件,最佳提取條件為:堿液濃度0.15 mol/L,提取溫度43 ℃,提取時間133 min,液料比50∶1(mL∶g)。在此條件下提取蛋白的得率為62.23%。

表4 兩種模型預測最優條件下的對比Table 4 Comparison of the two models under optimal conditions

2.5 綠豆芽蛋白中氨基酸的營養評價

蛋白質中氨基酸的種類、數量及組成比例決定著其營養價值的高低[20]。聯合國糧農組織/世界衛生組織(Food and Agriculture Organization/World Health Organization, FAO/WHO)提出理想蛋白質中必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值為0.4左右,必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值大于0.6時,表明該蛋白質的營養價值比較高[21]。由表5可知,綠豆芽蛋白的氨基酸種類較為齊全,有17種氨基酸,其中7種為必需氨基酸。含硒組氨基酸總量和必需氨基酸的含量分別為48.89 g/100 g、19.82 g/100 g,對照組氨基酸總量和必需氨基酸的含量分別為55.81 g/100 g、22.03 g/100 g,對比發現含硒組蛋白中氨基酸含量比對照組低。含硒組蛋白中的必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值為0.4,高于對照組(0.39),且含硒組與對照組必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值都大于0.6,含硒組(0.66)略高于對照組(0.65),符合FAO/WHO提出的理想蛋白質條件。另外,富硒綠豆芽蛋白中含量最高的氨基酸為谷氨酸(7.85 g/100 g),而谷氨酸具有風味增強作用,因此,富硒綠豆芽蛋白及其水解物有望作為功能性蛋白用于食品加工以改善食品風味。

表5 綠豆芽蛋白的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of mung bean sprout protein

2.6 綠豆芽蛋白中硒代氨基酸分析

由表6可知,含硒組蛋白中硒代胱氨酸(selenocystine,SeCys)和硒代甲硫氨酸(selenomethionine,SeMet)含量分別為340.56 μg/kg、568.63 μg/kg,對照組蛋白中SeCys和SeMet含量分別為278.88 μg/kg、240.77 μg/kg,含硒組蛋白中的SeCys和SeMet含量分別為對照組的1.22、2.36倍,SeCys和SeMet含量的增加可能是因為硒與硫的代謝方式相似,進而代替了氨基酸中的硫元素。另外對照組SeMet含量低于SeCys的含量,而含硒組SeMet含量高于SeCys含量。因此,綠豆芽中氨基酸與硒的主要結合方式為SeMet。這與CHENG等[1]的研究結果一致,其研究表明,綠豆在萌發過程中將Se(IV)轉化為Se(VI),并運輸到莖、葉和根。Se(VI)或Se(IV)通過亞硫酸鹽還原酶和半胱氨酸合成酶催化轉化為SeCys,大部分SeCys通過胱硫醚β裂解酶轉化為硒同型半胱氨酸,轉運到質體中,最后通過甲硫氨酸合成酶轉化為SeMet。但高俁[22]的研究結果顯示,硒甲基硒代半胱氨酸為綠豆芽的主要硒代氨基酸,原因可能是由于綠豆的種類、硒的來源、培養條件以及提取方法的不同。

表6 富硒綠豆芽蛋白及對照組中氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of selenium-enriched mung bean sprout protein and control group

3 結論

本文從不同的角度比較了RSM與GA-ANN模型對富硒綠豆芽蛋白提取工藝的預測性能,結果表明,GA-ANN模型具有更高的準確性和預測能力,可以作為更好的替代方案;對富硒綠豆芽中的氨基酸和硒代氨基酸的含量進行檢測,含硒組蛋白和對照組的必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值分別為0.4、0.39,且必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值都大于0.6,基本符合FAO/WHO提出的理想蛋白質條件,表明該硒蛋白作為優質硒蛋白對于促進人體健康有一定意義。另外,富硒綠豆芽中氨基酸與硒的主要結合方式為SeMet,具有更高的安全性,可作為缺硒地區人群的營養補充劑。本研究結果可為GA-ANN模型用于優化硒蛋白的提取工藝以及富硒功能性食品的開發提供一定參考。