萬州尤力克檸檬果皮精油的提取工藝及其抗氧化、抑菌、抗腫瘤活性研究

張瀟雪,杜慧慧*,胡武靜,江鴻翎,肖國生,楊東林

1(重慶三峽學院,重慶,404120)2(重慶文理學院 創新靶向藥物國際研究院,重慶,402160)

檸檬(Citruslimon)富含檸檬酸、類黃酮、維生素和礦物質等多種營養物質,具有降低膽固醇、預防心血管疾病、護膚美容和抗腫瘤等功效,是繼柑和橙之后的第三大柑橘品種, 在全世界范圍內有廣泛的栽培。重慶市萬州區白羊鎮作為全國檸檬三大主產區之一,被譽為“重慶市檸檬之鄉”,檸檬年產量可達6萬t,但目前銷售模式多以鮮銷為主,加之檸檬加工產業起步較晚,加工產品單一,附加值較低,造成豐產不豐收的現狀[1]。因此,開發多樣化的檸檬加工產品是增加檸檬經濟效益亟需解決的問題。

精油是從植物中提取的天然化合物,具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗焦慮等作用[2-3],其成分及生物活性越來越受到人們的關注[4-5]。有學者[6-8]對檸檬果皮精油進行氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析發現,不同方法提取的檸檬果皮精油其揮發性成分均以烯類為主,醇類、酯類和醛類等含氧化合物次之。目前檸檬精油的研究和應用主要集中于芳香理療或改善神經系統作用和膜材料的制備[9-10],隨著一些活性成分生理活性的發現,檸檬精油作為功能食品及藥品化妝品的原料具有廣闊的應用和開發前景[11-12],需求將日益增加。為響應國家號召,堅持因地制宜、循序漸進的綠色發展理念和鄉村振興的戰略方針,本研究以萬州區白羊鎮尤力克檸檬果皮為原料,通過單因素、響應面實驗優化提取工藝獲取檸檬精油,并探究檸檬精油的抑菌、抗氧化及抗腫瘤活性,以期為萬州檸檬深加工產業以及廢渣利用的發展提供理論依據。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

萬州尤力克檸檬,重慶市萬州區白羊鎮;結直腸癌細胞SW620、HCT116、膠質瘤細胞U87、U251,宮頸癌細胞Hela、頭頸癌細胞SCC15、胰腺癌細胞BXPC-3、前列腺癌細胞PC3、人正常結直腸上皮細胞FHC,重慶文理學院創新靶向藥物國際研究院提供;金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌,重慶三峽學院生物與食品工程學院實驗室培養。

DPPH;碘化丙啶 (propidium iodide,PI)、核糖核酸酶(ribonuclease,RNase);噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT);二甲基亞砜 (dimethyl Sulfoxide,DMSO);RPMI-1640 (roswell park memorial institute-1640)液體培養基、DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)液體培養基、F12K液體培養基、無支原體胎牛血清、胰蛋白酶;抗體CDK1、CyclinB、LC3B、α-Tubulin;熒光二抗。

1.2 儀器與設備

GI80T高壓蒸汽滅菌鍋,上海躍進醫療器械有限公司;MINI G S25/Eppendorf AG輕小型離心機,德國艾本德股份公司;1-16K高速冷凍離心機,重慶市瑞利電子儀器設備有限公司;5K43734倒置顯微鏡,日本Olympus 公司;F2215-185A-460細胞計數器,賽默飛世爾科技;XB70-FZ/R34A制冰機,東南科儀有限公司;PowerPacTM Basic蛋白電泳/轉膜儀,美國BIO-RAD公司;Cycation 5多功能酶標儀,美國BIO-TEK公司;ODYSSEY CLX LI-COR Odeyssey激光掃描儀,美國Gene limited company基因有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檸檬精油提取工藝流程

檸檬精油提取工藝流程如下:

新鮮檸檬→清洗→切皮、去白瓤→破碎→超聲→蒸餾→無水硫酸鈉干燥→精油

1.3.2 超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取檸檬精油

新鮮檸檬皮去除白瓤,高速粉碎機研磨1 min,稱取30 g粉碎后的新鮮檸檬皮置于1 000 mL圓底燒瓶中,按照對應比例加入適量蒸餾水,超聲一定時間后,連接揮發油提取裝置,蒸餾一定時間,計算精油的提取率,提取率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:c,提取率,%;v1,檸檬精油體積,mL;m2,新鮮檸檬果皮質量,g。

1.3.3 單因素及響應面實驗優化提取工藝

結合文獻[13-15],分別以液料比3∶1～15∶1(mL∶g),蒸餾時間30～210 min,超聲時間10～60 min,氯化鈉添加2～15 g/L為基礎,進行單因素實驗。在單因素實驗的基礎上,以液料比(mL∶g)、超聲時間(min)、蒸餾時間(min)、氯化鈉添加量(g/L)為自變量,檸檬精油提取率(%)為響應值,按照B-Behnken Design原理[16]設計4因素3水平(表1),采用Design-Expert 8.0 軟件進行響應面實驗,根據實驗結果進行優化分析,以得到最優提取工藝。

表1 響應面因素水平表Table 1 Level of response surface experimental factors

1.3.4 GC-MS 分析檸檬精油成分

a)樣品預處理:取提取的檸檬精油用二氯甲烷稀釋 10 倍,經0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

b)氣相色譜條件:色譜柱為 HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm),載氣為高純氦氣(99.999%),流速為0.91 mL/min,不分流進樣。進樣口溫度為250 ℃,進樣量 0.4 μL。采用程序升溫模式:柱溫 80 ℃,保持3 min,再以 8 ℃/min升溫至280 ℃,保持23 min。

c)質譜條件:離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃,溶劑延遲2 min,EI電子源,電子能量70 eV,m/z掃面范圍1.5～1 090 amu。檢索庫為NIST庫。

1.3.5 抗氧化活性測定

稱取0.01 g DPPH,溶解于無水乙醇并定容至250 mL,配制成0.1 mmol/L DPPH溶液;取2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液和2 mL不同質量濃度(3、105、185、264、343 mg/mL)的檸檬精油溶液,混合均勻,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A1;取2 mL無水乙醇溶液和2 mL不同濃度的檸檬精油溶液分別混合,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A2;取2 mL無水乙醇溶液與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合,避光靜置30 min,在517 nm波長下測定其吸光度值A0;維生素C為陽性對照,所有樣品平行測定3次取平均值,根據公式(2)計算清除率(E):

(2)

1.3.6 抑菌活性測定

分別挑取金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種細菌單菌落,于LB液體培養基中37 ℃恒溫振蕩培養12 h,菌液濃度稀釋至106～107CFU。分別取4種待測菌懸液100 μL涂布于LB固體培養基,待其完全吹干,將滅菌后的濾紙片呈“品”字型貼3片于培養基表面,每片濾紙滴加10 μL檸檬精油,同時要以相同的操作以無菌水代替檸檬精油做空白實驗,以慶大霉素為陽性對照,37 ℃培養24 h后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄,實驗重復3次,結果取平均值[7]。

1.3.7 細胞培養

取出凍存于液氮罐中的腫瘤細胞進行常規復蘇,即在37 ℃水浴鍋中迅速完全融化,于800 r/min離心5 min,棄去上清液。分別將結直腸癌細胞SW620,宮頸癌細胞Hela,膠質瘤細胞U87、U251和頭頸癌細胞SCC15 接種于含10%(體積分數)胎牛血清的DMEM培養基,胰腺癌細胞BXPC-3接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,前列腺癌細胞PC3接種于含10%胎牛血清的F12K培養基,結直腸癌細胞HCT116接種于含10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養基,人正常結直腸上皮細胞FHC接種于含10%胎牛血清的F12K+DMEM混合培養基,置于培養箱中常規培養(37 ℃、5%體積分數CO2、飽和濕度),定期換液,待細胞生長融合達80%～90%時,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.8 MTT法檢測細胞增殖活性

9種細胞均分為不同質量濃度檸檬精油組(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)、陰性對照組為添加DMSO。分別取對數生長期的9 種細胞的細胞懸液200 μL(1×103個/孔)接種于 96 孔板,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,待細胞貼壁后,加入不同濃度的檸檬精油和DMSO(陰性對照),并將9 種細胞繼續培養48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續培養4 h,取出各組細胞,棄上清液后每孔加入200 μL DMSO,搖床10 min,酶標儀設定波長為570 nm,記錄吸光度值并計算檸檬精油對細胞增殖的抑制率,每組設6個復孔[17]。細胞增殖抑制率計算如公式(3)所示:

(3)

1.3.9 蛋白免疫印跡

取對數生長期的細胞2×106個接種于6 cm培養皿中,培養12 h待細胞貼壁且變形后,分別加入檸檬精油,使得終質量濃度為595、425、255 μg/mL,并以DMSO溶劑為對照組,培養24 h后收集細胞。使用Western及IP裂解液(含蛋白酶抑制劑)分別提取細胞的總蛋白質,并用BCA蛋白質檢測試劑盒進行蛋白質定量。上樣20 μg總蛋白質,進行10%～15% SDS-PAGE 膠電泳;采用濕轉方法(100 V,120 min)將PAGE膠上的蛋白質轉印至聚偏二氟乙烯膜上,再用5%(體積分數)脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗滌5次,每次5 min;相應的一抗按照推薦稀釋濃度4 ℃孵育過夜,TBST 洗滌3次,每次10 min;IRDye標記二抗稀釋比例為1∶15 000,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,每次5 min;采用LI-COR Odeyssey激光掃描儀檢測目的條帶,并分析檢測結果[18]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

液料比、蒸餾時間、超聲時間及氯化鈉添加量均對檸檬精油的提取率有較大的影響,檸檬精油的提取率隨液料比的增加呈現先增后減的變化趨勢(圖1-a),當液料比達到1∶9左右時檸檬精油的提取率曲線出現峰值,即提取率達到最大值,表明檸檬精油在此時達到飽和,繼續增加液料比反而會使蒸餾時間延長,從而延長受熱時間,使精油發生分解,提取率下降。因此,確定液料比在1∶9左右時為最佳。

蒸餾時間在120 min之內時,提取率隨著時間的延長呈穩步上升的趨勢,120 min左右時,提取率達到最大,之后隨著時間的延長,提取率不斷下降(圖1-b)。蒸餾時間過長會引起精油分解,導致提取率降低,說明蒸餾時間過長不利于提取的順利進行,因此最佳蒸餾時間應保持在120 min左右。

超聲波輔助提取利用超聲波的空化效應增加溶劑穿透力[19],提高檸檬精油的溶出速度和溶出量,從而提高檸檬精油的提取率。而超聲波也可以增加物質成分的擴散,若超聲時間過長,反而會使檸檬精油中的一些組分被破壞或成分揮發,甚至加劇乳化,降低檸檬精油的得率。因此本實驗選取超聲20 min左右為宜(圖1-c)。

隨著氯化鈉添加量的增加,檸檬精油的提取效果呈現先上升后下降趨勢,其中當氯化鈉添加量在6 g/L左右時,提取率達到最高值,此時的提取效果最佳(圖1-d)。

2.2 響應面實驗優化檸檬精油提取工藝

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對數據進行擬合分析[6](表2),得到了檸檬精油提取率與液料比(A)、超聲時間(B)、蒸餾時間(C)、氯化鈉添加量(D)的二次回歸方程模型:

Y=2.58+0.034A+0.10B+0.037C-0.047D+0.38AB+0.21AC+0.18AD+0.067BC+0.065BD+0.20CD-0.26A2-0.19B2-0.33C2-0.43D2

a-液料比;b-蒸餾時間;c-超聲時間;d-氯化鈉添加量圖1 液料比、蒸餾時間、超聲時間及氯化鈉添加量對檸檬精油提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, distillation time, ultrasonic time and sodium chloride addition amount on the extraction yield of lemon essential oil

表2 響應面實驗設計Table 2 Response surface experimental design

該模型的F=21.75,P<0.000 1(表3),表明該模型具有極顯著性,失擬項中P=0.185 6,說明僅有18.56%可能會因為各種因素影響導致模型不吻合,因而該模型擬合程度較好,實驗誤差小,可用此模型對檸檬精油提取率進行預測和分析。一次項中B(超聲時間)的P<0.05,說明超聲時間對檸檬精油提取率的影響顯著。二次項中C2、D2的P值均小于0.000 1,A2<0.01,B2<0.05,結合F值可知,各因素對檸檬精油提取率的影響大小依次為B(超聲時間)>D(氯化鈉添加量)>C(蒸餾時間)>A(液料比)。各因子交互作用的響應面中,兩兩交互作用的響應面都呈弧形(圖2),說明它們對響應值都具有顯著作用[20],根據響應面不難看出各因素對響應值的影響程度從大到小依次為B(超聲時)>D(氯化鈉添加)>C(蒸餾時間)>A(液料比),與方差分析中結果基本一致,進一步驗證了其結果。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性結果Table 3 Analysis of variance and significance results of regression model

通過響應面結果分析確定了最佳工藝的參數為液料比12∶1、超聲時間29.01 min、蒸餾時間133.21 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,在此條件下預測檸檬精油提取率可達2.72%。為方便實驗操作,調整工藝參數:液料比12∶1、超聲時間29 min、蒸餾時間133 min、氯化鈉添加量5.20 g/L,重復3次,檸檬精油的提取率為(2.61±0.12)%,與回歸模型預測值2.72%相近,說明該工藝條件可行。

圖2 兩因子交互作用對提取率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plot of the effect of two-factor interaction on extraction yield

2.3 檸檬精油組成成分分析

采用GC-MS對超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取的檸檬精油進行定性分析后,得到檸檬精油揮發性成分的總離子流圖(圖3)。檸檬精油成分保留時間集中在8.2～13.3 min,出峰數占總峰數的比例為48%。從尤力克檸檬果皮精油中共得到102種化合物(表4),其中相對含量較大的主要成分有1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環己烯(17.26%)、檜烯(10.62%)、β-蒎烯(9.91%)、左旋-α-蒎烯(6.93%)、γ-松油烯(6.11%)、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(5.5%)、檸檬醛(4.39%)、檸檬醇(3.09%)。

圖3 檸檬精油揮發成分總離子流圖Fig.3 Total ion diagram of volatile constituents extracted from lemon essential oil

2.4 檸檬精油具有抗氧化活性

檸檬精油清除DPPH自由基的原理是DPPH有單電子,其醇溶液呈紫色,在517 nm處有最大吸收峰,當存在自由基清除劑時能夠與其單電子結合而使溶液顏色變淺[21]。檸檬精油對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大,當質量濃度達343 mg/mL時有最大的清除率92.68%(圖4)。與維生素C相比,檸檬精油對DPPH自由基的清除效果稍差一些,但隨著質量濃度的增加,檸檬精油清除DPPH自由基的效果逐漸接近維生素C。由此可確定檸檬精油具有一定的抗氧化活性。

表4 尤力克檸檬精油的化學組分Table 4 Composition of essential oil from Eureka lemon

圖4 檸檬精油有效清除DPPH自由基Fig.4 DPPH radical scavenging effect of lemon essential oil

2.5 檸檬精油具有抑菌活性

檸檬精油對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌均具有一定的抑菌效果(表5),且維氏氣單胞菌對檸檬精油最敏感,嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌次之,副溶血性弧菌對檸檬精油敏感性最差。

表5 檸檬精油對4 種受試菌的抑菌活性Table 5 Antibacterial activity of lemon essential oil against four tested bacteria

2.6 檸檬精油具有抗腫瘤活性

2.6.1 檸檬精油抑制腫瘤細胞的增殖

為了評價檸檬精油的抗腫瘤活性,測定了檸檬精油對8種腫瘤細胞的細胞活力。檸檬精油在不同濃度(850、425、213、106、53、26、13、6.6、3.3 μg/mL)分別作用于(結直腸癌細胞SW620、HCT116、宮頸癌細胞Hela、膠質瘤細胞U87、U251、頭頸癌細胞SCC15、胰腺癌細胞BXPC-3、前列腺癌細胞PC3)8種腫瘤細胞和1種人正常結直腸上皮細胞FHC,48 h后測定細胞存活率。結果發現,隨著檸檬精油質量濃度的增加,細胞活力下降,抑制率顯著升高(圖5-a)。在人正常結直腸上皮細胞FHC中,IC50顯著高于腫瘤細胞,表明檸檬精油不影響人正常細胞的活力(圖5-b)。由此可見,檸檬精油增加細胞抑制率呈濃度依賴性,且具有抗多種腫瘤細胞的活性。

圖5 檸檬精油抑制腫瘤細胞增殖Fig.5 Inhibition of lemon essential oil on tumor cell proliferation注:***表示P<0.001。

2.6.2 檸檬精油誘導結直腸癌細胞周期阻滯

為分析檸檬精油抑制結直腸癌細胞增殖的機理,利用western blotting(WB)分析細胞周期相關蛋白表達情況(圖5-c),結果發現細胞周期蛋白Cyclin B1、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1隨檸檬精油質量濃度的增加而被顯著下調,表明檸檬精油可導致HCT116、SW620細胞周期發生阻滯,進而抑制細胞增殖。

2.6.3 檸檬精油促進結直腸癌細胞自噬

自噬在腫瘤細胞的生長過程中發揮重要作用,對自噬標志性蛋白進行WB檢測發現(圖5-d),檸檬精油促進結直腸癌細胞自噬,可見檸檬精油可以通過促進自噬抑制細胞增殖。

3 結論與討論

本研究通過超聲波輔助水蒸汽蒸餾法提取萬州尤力克檸檬精油,并通過單因素及響應面確定最佳工藝條件為:液料比12∶1(mL∶g)、蒸餾時間29 min、超聲時間133 min、氯化鈉添加量5.2 g/L,提取率達到2.72%。因氯化鈉溶于水不溶于油,可增大水的極性,且添加氯化鈉后,鹽水的密度增大,加速油層和水層的分離,進而提高了精油的提取率,該工藝方法比肖娟等[22]的水蒸氣蒸餾法的提取率高出0.75%,因此該工藝方法可以視為一種有效的提取方法。GC-MS測定組成成分發現萬州尤力克檸檬精油中烯類化合物居多,相對含量達62.89%,醇類、醛類、酯類化合物的相對含量次之,這與鄧紅梅等[7]和秦軼等[8]的研究結果相吻合。

萬州尤力克檸檬精油有較好的DPPH自由基清除能力,與現有的研究結果一致[21,23],證明其具有較強的抗氧化能力。已有研究表明檸檬精油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等抑制顯著,其抑菌作用主要是因為醇類、醛類、酚類和萜烯類等化合物的存在[3,24],本研究驗證了檸檬精油對本實驗室現有的金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌4種受試菌的抑制作用,且發現對維氏氣單胞菌抑制效果最明顯,表明萬州尤力克檸檬精油同樣具有良好的抑菌活性。

本研究發現檸檬精油具有抗多種腫瘤細胞活性,可能是因為含有豐富的烯類化合物,已有研究表明,烯類化合物具有一定的抗腫瘤作用[25]。它們能夠通過阻滯細胞周期,誘導細胞發生凋亡或自噬等方式來抑制并殺死腫瘤細胞[26]。本研究發現檸檬精油通過誘導結直腸癌細胞阻滯及促進自噬抑制細胞增殖。

綜上所述,通過本研究所優化的提取工藝,萬州尤力克檸檬可獲得更高的精油產量,有利于檸檬深加工產品及廢渣的開發與利用。此外,檸檬精油具有明顯的體外抗腫瘤作用,但還需要用更多技術指標進行完整的體內、體外評價,此方面的研究工作正在深入進行中。