植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠透明質酸和衰老的影響

鄭雪麗,毛丙永,唐鑫,趙建新,張秋香,崔樹茂

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

透明質酸(hyaluronic acid, HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid, GlcA)重復二糖組成的一種線性糖胺聚糖,與HA特定蛋白質TSG6或細胞膜受體CD44、RHAMM、HARE和TLR4/2相互作用,調節機體生長發育、細胞存活和炎癥反應[1],主要存在于皮膚真皮層、眼玻璃體液、滑膜關節液、關節軟骨和中樞神經系統等,具有高黏彈性,能維持皮膚彈性和保持皮膚水分、減少關節摩擦、調節眼壓和參與神經元網的形成的作用[2]。在健康個體中,HA的合成和降解處于一種動態平衡中。隨著機體的衰老,體內HA的合成減少,降解增加,導致體內HA總含量下降[3-4],隨之帶來一系列年齡相關問題,如眼花、皮膚老化、關節功能退化及僵硬、大腦記憶功能衰退等。因此增加相關部位HA的含量,可延緩機體的衰老癥狀。

口服外源性HA是目前增加組織部位HA含量的常用手段,但口服HA吸收利用率較低。一項研究發現大鼠口服99mTc-HA后糞便HA的排泄量達到92.3%[4]。口服125I-HA的動物實驗表明在2 h內胃和小腸的放射性降低,而大腸的放射性升高,同時組織的放射性也較低,說明HA較難從胃腸道吸收[5]。此外,HA的半衰期約為1～1.5 d,外源性HA進入體內迅速經HA酶降解后多數被排泄,難以持續有效地在組織部位發揮功效[6]。針對上述問題,有研究者將注意力從外源攝入HA轉移到促進內源HA合成上,以實現體內HA含量增加。后生元是一種由滅活益生菌制備的新型微生態制劑,比益生菌更具安全性和穩定性,也更易生產和貯存[7],其成分主要有肽聚糖、胞外多糖、磷壁酸、細菌素和有機酸等[8],研究發現一些由植物乳植桿菌制備的后生元具備促進HA合成的能力,例如,熱滅活的植物乳植桿菌L-137處理BALB/3T3成纖維細胞可提高HA含量和透明質酸合成酶2(hyaluronic acid synthase, HAS2)mRNA表達[9],由植物乳植桿菌K8制備的后生元促進了HaCaT細胞的HA含量和并上調了HAS2 mRNA表達[10]。但是植物乳植桿菌對HA合成研究多數僅限于細胞實驗,缺乏體內HA的合成數據,本研究通過向小鼠注射D-半乳糖建立衰老模型,探討植物乳植桿菌CCFM1296及其制備的后生元對小鼠組織中HA合成的影響,并進一步分析了其對抗衰老的效果,為開發調控宿主HA含量和抗衰老的益生菌產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

植物乳植桿菌CCFM1295、植物乳植桿菌CCFM1296、植物乳植桿菌CCFM1297均來自江南大學食品生物技術保藏中心(江蘇無錫)。

實時熒光質量PCR相關引物,上海生工公司;透明質酸試劑盒,上海酶聯公司;RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒,南京諾維贊公司;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)活性試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性試劑盒,南京建成公司;D-半乳糖,上海阿拉丁公司。

1.1.2 儀器與設備

隔水式恒溫生物培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;酶標儀,美國Thermo公司;高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;皮膚水分儀、皮膚彈性儀,德國CK公司;生化分析儀,深圳邁瑞公司。

1.2 菌懸液的制備

待植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297活化后將其接種于液體MRS培養基中37 ℃擴培24 h,于4 ℃、8 000 r/min離心20 min,無菌生理鹽水清洗菌泥2次,4 ℃備用。

1.3 后生元的制備

后生元的制備參照ALMADA等[11]的總結,采用了熱處理與高壓均質聯合的方式,并對具體條件稍作改動。過夜培養的植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297,傾注法計算總活菌數,并在制備前稀釋至與灌胃所需的活菌數一致,熱處理(65 ℃,30 min)并進行高壓均質(800～1 200 MPa,3次)后,得到后生元并凍干備用。

1.4 動物實驗設計

雄性BALB/c實驗小鼠(8周齡,SPF級,體重20～22 g)購于維通利華。動物實驗方案獲得江南大學實驗動物實驗倫理委員會批準(倫理編號為:JN.No20211215b2050601)。將40只實驗小鼠隨機分為空白組(Control)、模型組(Model)、植物乳植桿菌CCFM1295活菌組(CCFM1295-L)、植物乳植桿菌CCFM1295后生元組(CCFM1295-D)、植物乳植桿菌CCFM1296活菌組(CCFM1296-L)、植物乳植桿菌CCFM1296后生元組(CCFM1296-D)、植物乳植桿菌CCFM1297活菌組(CCFM1297-L)、植物乳植桿菌CCFM1297后生元組(CCFM1297-D),每組5只。適應性飼養1周后,除空白組(Control)外,其余各組小鼠每天皮下注射生理鹽水配制的D-半乳糖(500 mg/kg)[12],造模9周。造模期間,CCFM1295-L組、CCFM1296-L組、CCFM1297-L組小鼠每只每天灌胃5×109CFU/kg體重的菌懸液[13],CCFM1295-D組、CCFM1296-D組、CCFM1297-D組小鼠每天灌胃500 mg/kg體重的后生元溶液。空白組和模型組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。最后一次干預造模24 h后,稱記小鼠體重,處死小鼠,立即取樣。

1.5 皮膚水分、彈性測定

造模9周后,用無菌剃毛刀剃凈小鼠頸背部毛發,用皮膚水分和彈性測定儀[14]檢測每只小鼠的下背部至臀部區域的左側和右側皮膚水分,交替測量10次,分別剔除2個最低值和最高值后,以剩余6個值的平均數為小鼠皮膚水分和皮膚彈性,測量時固定小鼠,保證儀器表面與待測皮膚垂直接觸。

1.6 HA含量測定

取小鼠背部皮膚、關節組織、腦和眼球加入預冷的PBS于高通量組織研磨儀制成10%、16%、33%和20%勻漿后,4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,按照HA ELISA試劑盒說明書檢測各組織中HA含量。

1.7 實時熒光定量PCR檢測小鼠組織的mRNA表達

采用提RNA試劑盒按說明書提取小鼠皮膚、關節、眼、腦組織總RNA,用Nanodrop檢測OD260/OD280的數值,將1 μg總RNA通過逆轉錄試劑盒反轉錄成20 μL cDNA,以SYBR Green qPCR Master Mix用于實時熒光定量PCR反應體系配制。以GAPDH作為內參基因,基于2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

1.8 血清指標測定

采用眼眶靜脈叢采集小鼠血液,靜置2 h,3 000 r/min 低溫離心10 min,取上清液。采用生化分析儀測定與衰老相關的血清生化指標,包括C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、膽堿酯酶(cholinesterase,CHE)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)。

表1 小鼠用引物序列Table 1 Primer sequences of mice

1.9 皮膚組織CAT活力、GSH-Px和T-AOC測定

取小鼠背部皮膚加入預冷的PBS于高通量組織研磨儀制成10%勻漿后,于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明測定小鼠皮膚CAT活力、GSH-Px和T-AOC。

1.10 數據統計分析

采用SPSS 26.0統計軟件來對顯著性差異進行統計學分析,實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SE)表示,組間比較使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠體重的影響

實驗過程中,空白組小鼠皮毛順滑光亮,行動比較靈活;模型組小鼠毛色黯淡疏松,行動遲緩;而CCFM1296-L和CCFM1296-D組的小鼠毛色和活力相比較模型組有一定程度改善。各組小鼠在實驗期間體重均出現緩慢增長,組間無明顯差異(圖1),表明灌胃植物乳植桿菌和后生元對小鼠無副作用。

2.2 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚水分、彈性的影響

D-半乳糖的過量積累可引起皮膚發生氧化應激,其產生的自由基可攻擊HA聚合物導致HA降解[15],同時攻擊真皮層纖維細胞,導致屏障功能受損,發生皮膚水分和彈性均下降的衰老跡象[16]。由圖2-a和圖2-b所示,模型組小鼠皮膚水分和彈性相比于空白組組顯著降低(P<0.001),CCFM1296-L組顯著增加了D-半乳糖誘導小鼠的皮膚水分和彈性(P<0.001),而CCFM1296-D雖然也提高了皮膚水分與彈性,但皮膚水分與模型組相比無顯著性差異(P>0.05),其他植物乳植桿菌以及制備的后生元對注射D-半乳糖后的皮膚水分和皮膚彈性無顯著影響(P>0.05)。皮膚微生物組成具有年齡相關性,年輕女性的皮膚微生物多樣性高于年老女性[17],一些研究表示口服益生菌或后生元能夠改善皮膚微生物多樣性,減少皮膚衰老跡象[18],其次,腸道微生物群失衡導致的腸道微生態失調,與皮膚不良反應有關。腸道微生態失衡后分泌的游離苯酚和對甲酚進入循環并蓄積在皮膚中,導致角質細胞尺寸減小和水分流失[19]。口服益生菌和后生元可減少苯酚和對甲酚水平,并增強角質層水合作用[20-21],這表明益生菌可能通過調節腸道或皮膚微生物群平衡來恢復皮膚穩態。

圖1 實驗期間小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes in different groups of mice

a-皮膚水分;b-皮膚彈性圖2 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚水分、彈性的影響Fig.2 Effects of different Lactiplantibacillus planturum and postbiotics on skin moisture and elasticity in mice注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(下同)。

2.3 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠組織HA含量的影響

HA在皮膚組織中含量最高,并因為其極端的親水性和黏彈性保持著皮膚中的水分含量和彈性[22]。作為機體的天然潤滑劑,HA對眼睛和關節健康也至關重要[23],此外,HA構成的神經元網還涉及神經元的成熟[24]。灌胃不同植物乳植桿菌和后生元對小鼠皮膚、眼球、關節、腦的HA含量影響如圖3所示。相較于空白組,模型組的HA含量顯著降低(P<0.001),說明在衰老過程中,HA的流失增加。向小鼠給予CCFM1296-L和CCFM1296-D均顯著地增加了皮膚、眼球和關節組織的HA含量(P<0.05)。但是,CCFM1296-L干預并未對腦組織的HA含量產生顯著影響(P>0.05),只有CCFM1296-D相比模型組增加了HA含量(P<0.05),其他植物乳植桿菌及其制備的后生元對小鼠皮膚、眼、腦、關節等組織的HA含量無顯著影響(P>0.05)。上述結果表明CCFM1296-L顯著地提高了皮膚、眼球、關節的HA水平,而CCFM1296-D不但顯著增加了皮膚、眼球、關節組織的HA含量,也增加了腦組織的HA含量。CCFM1296-L和CCFM1296-D對腦HA含量影響的差異可能與活菌與后生元不同的免疫活性有關。在一項研究中發現植物乳植桿菌 L-137制備的后生元在激活IFN-γ或TNF-α后誘導了細胞HA的產生,若抑制IFN-γ或TNF-α則可限制HA的產生[9],這說明植物乳植桿菌活菌可能限制了IFN-γ或TNF-α的釋放抑制了腦中HA產生。

a-皮膚;b-眼球;c-關節;d-腦圖3 不同植物乳植桿菌及后生元對小鼠皮膚、眼球、關節、腦的HA含量影響Fig.3 Effects of different Lactiplantibacillus planturum and postbiotics on HA content in skin, eye, joint, and brain of mice

2.4 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠組織HA合成酶基因表達的影響

在HA合成過程中有4種重要的合成酶類,其活性直接調控著HA的含量,分別為UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase, UGDH)、HAS1、HAS2、HAS3。其中,UGDH是催化UDP-葡萄糖向UDP-GlcA轉化的限速酶,產生UDP-GlcA后,由HAS在細胞膜上通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵交替連接UDP-GlcA和UDP-GlcNAc,生成長鏈HA,而HAS的3種同工酶都能參與催化不同分子質量HA的合成[25]。為了探討影響機體HA合成的機制,進一步檢測了CCFM1296-L和CCFM1296-D干預后小鼠組織HA合成酶的表達情況(圖4)。在皮膚、關節、眼、腦組織中,與空白組比較,模型組UGDH、HAS1、HAS2、HAS3的mRNA相對表達量均顯著性降低(P<0.01),CCFM1296-L的干預顯著上調了關節中UGDH mRNA和HAS1 mRNA的表達(P<0.05),而CCFM1296-D顯著上調了腦UGDH mRNA和眼HAS1 mRNA的表達(P<0.05);對于皮膚、關節、眼組織的HAS2 mRNA表達,CCFM1296-L和CCFM1296-D口服均顯著上調(P<0.05),且CCFM1296-D還顯著上調了腦HAS2 mRNA的表達(P<0.01);另外,口服CCFM1296-L也顯著增加了皮膚HAS3 mRNA的表達(P<0.05)。HAS2是HA合成過程中最重要的一類合成酶,對哺乳動物的生存影響最大,HAS2在胚胎心臟形態發生的上皮間充質轉化和血管生成中起重要作用,其缺失導致機體嚴重畸形和死亡[26],研究表明促進細胞中的HAS2 mRNA過表達可使HA水平增加3倍以上[27],這說明CCFM1296-L和CCFM1296-D可能通過促進HAS2 mRNA表達水平來增加組織部位HA含量。

a-UGDH mRNA;b-HAS1 mRNA;c-HAS2 mRNA;d-HAS3 mRNA圖4 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠皮膚、眼球、關節、腦的HA合成酶基因表達的影響Fig.4 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on the expression of HA synthase gene in skin, eye, joint and brain of mice注:a～d圖中從左至右依次為皮膚、關節、眼球、腦。

2.5 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠血清指標的影響

為了進一步評估具有促進HA合成能力的CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠衰老的影響,我們檢測了血清中CRP的含量和ALT、AST、ALP、CHE、CK的活力狀況。由圖5-a～圖5-f可知,與空白組相比,模型組的CRP含量、ALT、AST、ALP、CK水平顯著增加(P<0.001),CHE水平顯著降低(P<0.05)。給予小鼠CCFM1296-L和CCFM1296-D則顯著地降低了血清中CRP、ALT、AST、ALP、CK水平,并上調了CHE活性(P<0.05)。綜合以上結果表明,植物乳植桿菌CCFM1296及其制備的后生元均具有緩解小鼠衰老的作用。

2.6 植物乳植桿菌CCFM1296及后生元對小鼠皮膚CAT、GSH-Px、T-AOC活力的影響

HA在體內具有良好的抗氧化能力,能夠提高機體抗氧化酶活性實現抗衰老作用[28],故對能夠促進HA合成的CCFM1296-L和CCFM1296-D的抗氧化能力進行檢測。圖6展示了皮膚的抗氧化水平,D-半乳糖誘導的模型組與空白組相比,顯著降低了CAT、GSH-Px和T-AOC活力(P<0.001),這意味著D-半乳糖引發了皮膚氧化應激。利用CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠進行干預后,結果CCFM1296-L組表現出了抑制氧化應激的行為,顯著提高了CAT、GSH-Px和T-AOC活力(P<0.05),增強了皮膚的抗氧化能力,而CCFM1296-D雖也增強了抗氧化能力,卻未與模型組表現出顯著性差異(P>0.05),這可能與CCFM1296-L比CCFM1296-D調控皮膚HA合成能力更強有關。一項研究表明裸鼴鼠體內分泌高水平的HA,使裸鼴鼠具有更強抵抗衰老和疾病的能力,降低HA含量后裸鼴鼠的抵抗能力也隨之下降[29],本研究中CCFM1296-L在皮膚中產生的HA水平高于CCFM1296-D,說明促進HA合成的益生菌能夠增強皮膚防御,且促HA合成能力越強,效果越強。

a-CRP;b-ALT;c-AST;d-ALP;e-CHE;f-CK圖5 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠血清生化指標的影響Fig.5 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on serum biochemical indexes in mice

a-CRP;b-ALT;c-AST;d-ALP;e-CHE;f-CK圖6 CCFM1296-L和CCFM1296-D對小鼠皮膚CAT、GSH-Px、T-AOC活力的影響Fig.6 Effects of CCFM1296-L and CCFM1296-D on the activities of CAT, GSH-Px and T-AOC in mice skin

3 結論

本研究利用D-半乳糖構建動物衰老模型,研究了植物乳植桿菌CCFM1295、CCFM1296、CCFM1297活菌和制備的后生元對內源性HA合成和衰老的影響,結果表明植物乳植桿菌CCFM1296活菌和制備的后生元能夠增加衰老小鼠的內源性HA含量,并通過增加CHE水平和降低血清AST、ALT、ALP、CK、CRP水平來抑制衰老的不健康狀態,同時增加小鼠皮膚含水量、皮膚彈性、CAT、GSH-Px和T-AOC活力,具有一定的體內抗衰老作用,為通過口服益生菌增加內源性HA含量并改善機體衰老提供了一種新的思路,然而植物乳植桿菌CCFM1296活菌及后生元調控宿主HA合成的關鍵功能成分和具體作用機制還需要進一步通過代組學技術和菌群分析進行確定。