常見肉制品動物源性的環介導等溫擴增高分辨熔解鑒別檢測方法

代欣,張月絨,澹臺瑋,李艷妮,徐秦峰

(陜西科技大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710021)

隨著國家綜合實力的增強,國民對于食品的需求已經從最開始的滿足基本溫飽,轉變為選擇更加營養、美味的食物。近年來,食品安全問題頻發引起消費者對肉制品感官和營養品質的重視?；煜忸惓煞忠殉蔀閯游镌葱允称焚|量和安全的重大挑戰,不法分子用較廉價的豬、鴨、雞肉冒充高價的牛羊肉。為保護消費者的權益,建立一種高效、準確的肉類摻假檢測方法顯得尤為重要,不僅可以在進出口肉制品檢測、市場的定期抽查發揮作用,還可以為中小型肉制品企業生產提供強有力的支持。

針對食品的真實性評估,較為傳統的是檢測人員依據經驗從形態上、感官特征上對肉制品進行分析,結果容易受加工過程的影響,局限性較大[1]?，F代分析方法是以核酸、蛋白質、脂肪等作為目標物進行定性定量分析。基于蛋白質的免疫分析方法[2]主要用于生肉樣品,因蛋白質在加工過程中穩定性差而受到限制。色譜、質譜[3]等大型儀器能夠提供準確的檢測結果,但由于儀器價格昂貴、檢測耗時長、樣品前處理復雜和數據分析復雜的特點,這些檢測方法主要用于實驗室精密痕量檢測而不適用于現場快速分析。

核酸擴增方法現已十分成熟,這類方法特異性強、靈敏度高,通常使用凝膠電泳、比色法等判斷實驗結果。主要有傳統聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術[4]、環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)法[5-6]、重組聚合酶擴增反應[7-8](recombinase polymerase amplification, RPA)等等。LAMP技術的發展與應用能夠實現對低濃度DNA進行擴增,并實時檢測出其含量,擺脫PCR技術對溫控設備的依賴,使得LAMP技術為檢測DNA提供一種可行且經濟的途徑,適用于現場檢測和基層應用[9-10]。

但以上方法只針對一種動物源性成分進行檢測[11-13],難以滿足實際應用中同時檢測多種肉類成分的需求。通過對LAMP技術的改進或與其他技術結合可以實現多重LAMP擴增技術檢測,充分利用LAMP技術的優勢,擴展其應用場景。多重檢測的常用方法之一是通過在探針上標記不同顏色的熒光標記,通過比色來得到實驗結果[14],缺點是熒光標記探針價格昂貴,引物間存在相互干擾、擴增效率存在差異且結果解析復雜。除此之外還可以通過空間分隔的方式實現多重同時檢測,例如ZHANG等[15]將LAMP技術與微流控芯片結合,實現對豬、牛、羊及鴨子的摻假肉制品進行檢測,檢測限可達到0.1%(質量分數),這樣的方法不受不同物種引物之間相互干擾影響,但需要具備專業的芯片設計制作技術。高分辨熔解曲線(high-resolution melting, HRM)是一種在擴增反應完成后監測擴增子熔解行為的分析方法,常被應用在基因分型、突變掃描和甲基化檢測領域可以區分目標基因序列的微小差異,具有靈敏、快速、高通量的優點[16]。HRM方法無需開管即可對DNA序列信息進行分析,核酸擴增中的氣溶膠污染的問題得以克服。已有文章設計通用型PCR引物擴增與HRM結合,實現對山羊、綿羊、水牛和牛4個物種的鑒別檢測[17]。本實驗室前期采用了牛羊特異性LAMP引物對牛羊乳摻假進行區分[18],但是2種靶標需要8條特異性引物,進一步增加至3種靶標將需要12條引物,這些引物間相互干擾、擴增效率存在差異,因此限制了靶標數量的增加[19]。為了克服這種局限,本方法僅采用一對通用引物,對豬、牛、羊3個物種線粒體DNA進行LAMP擴增,避免引物過多對反應造成干擾以及擴增效率不同的問題,通過分析HRM熔解曲線實現牛、羊肉制品中摻入豬肉成分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動物DNA(豬、牛、羊)標準樣本,四川華漢三創有限公司;牛肉卷、羊肉卷、豬肉等實際樣品,陜西科技大學附近某大型商場。

甜菜堿,Sigma公司;dNTP混合液、Bst 2.0 Warm Star DNA聚合酶和MgSO4等,NEB公司;EvaGreen,Biotium公司;磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker,天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MyGo Pro 熒光定量PCR儀,IT-IS Life Science Ltd;電熱恒溫水槽(DK-8D),上海精宏實驗設備有限公司;高速冷凍離心機(5424R),Eppendorf有限公司;超微量紫外分光光度計(NanoDrop 2000),Thermo Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 LAMP方法建立

1.3.1.1 DNA的提取

使用磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒,可以從大型商超隨機購買的牛肉卷、羊肉卷以及豬肉中提取到相應的基因組DNA。通過超微量紫外分光光度計對樣品DNA濃度進行精確檢測后,將DNA溶液稀釋到20 ng/μL,-20 ℃貯存以備后續使用。

1.3.1.2 LAMP引物設計及篩選

本研究中,根據GB/T 21104—2007《動物源性飼料中反芻動物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測方法PCR方法》設計一種LAMP通用型引物,如表1所示。生工生物(上海)有限公司成功合成并通過高效液相色譜技術純化。

參考文獻[20]報道的引物序列并稍做修改,以牛、羊線粒體保守序列為靶基因,并在PrimerExplorer V5網站進行多次篩選比對來設計PCR特異性引物,如表2所示。PCR引物由生工生物(上海)有限公司合成并經高效液相色譜純化。

表1 實驗中所用的LAMP通用引物序列Table 1 The sequence of the primers used in LAMP

表2 實驗中所用的PCR引物序列Table 2 The sequence of the primers used in PCR

1.3.1.3 LAMP-HRM 反應體系建立及條件優化

LAMP反應體系的組成及濃度如下:1×ThermolPol 緩沖液、1.4 mmol/L dNTPs、0.8 mol/L甜菜堿、4 mmol/L MgSO4、外引物F3和B3各0.4 μmol/L、內引物FIP和BIP各1.6 μmol/L、8 U Bst 2.0 Warm Star DNA聚合酶0.4 μL、20×EvaGreen熒光染料0.25 μL和DNA模板20 ng,總反應體系為10 μL。在64 ℃下,將混合體系放入MyGo pro中反應60 min,結束后在60～97 ℃完成熔解分析。通過瓊脂糖凝膠電泳技術對擴增產物進行準確表征。

1.3.2 LAMP體系靈敏度測定

通過10倍梯度稀釋,將豬、牛、羊的DNA提取液分別稀釋至30、0.3、0.03、0.003、0.000 3 ng/μL,并以每個梯度的稀釋液為基準,建立標準曲線,進行LAMP反應檢測,以評估單個物種DNA檢測的靈敏度的。

1.3.3 混合動物物種的檢測

通過LAMP-HRM實驗,研究了3種不同物種的DNA,分別是單組分3種、雙組分3種和三組分1種,以及7種混合物,以評估這種檢測方法的分類效果。

為了更好地分析這種方法的檢測限,選擇了30 ng/μL的牛DNA作為原液,并分別摻入了不同體積比例的豬DNA。這些混合物的體積比例分別為100%、80%、50%、10%、5%和0%。最后,選擇了1.2 μL 的混合物作為模板進行了LAMP擴增。通過將羊DNA與豬DNA按照100%、80%、50%、10%、5%和0%的比例混合,以確定該混合方法的最佳檢測范圍。

1.3.4 實際樣品的檢測

對市售的5種肉制品進行鑒定,分析LAMP-HRM方法的實際應用能力,與已有的實時PCR方法進行對比,驗證LAMP-HRM方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 通用引物的設計

使用BioEdit軟件,可以比較6個物種的完整擴增序列,其中以牛的擴增序列為基準,以此來確定它們的特征。由圖1可以看出,黑框內的堿基序列屬于通用型外引物,而紅框內的堿基序列屬于通用型內引物,而6個物種之間與引物互補的堿基序列完全一致,用圓點標記出來。通過對6種物種的堿基序列進行比較,可以發現它們之間存在一定的差異,其中牛和羊的差異為9.12%,而豬和牛的差異最大,達到 11.22%。經過測定,6種物種的堿基序列差異為9.19%。本方法對豬、牛、羊進行擴增,理論上以下6種以及其他序列匹配的物種均可以通過此方法進行區分。

圖1 通用引物對應的6個物種的核苷酸序列差異對比Fig.1 Sequence alignment of nine species corresponding to universal primers注:*表示一致。

2.2 LAMP-HRM方法可行性驗證

為了驗證方法的可行性,本實驗采用通用引物,以豬、牛及羊DNA為模板進行LAMP檢測。由圖2-a所示,只有在模板存在的情況下,才可觀察到明顯的擴增曲線。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后,觀察發現電泳結果與擴增結果基本一致。而且由于靶標序列的長度和目標片段的GC比例與Tm值(melting temperature,Tm)相關。因此,圖2-b進一步對不同靶標DNA的LAMP產物實行高分辨熔解曲線分析,豬、牛、羊這3個物種的峰有重疊,并不能很好地區分開來。但圖2-c歸一化熔解曲線中的豬、牛、羊DNA熔解曲線沒有出現交叉重疊,可明確對其進行區分和鑒定。WITTWER等[21]的研究文章中,對15種不同樣本對應的差異化曲線進行分析,差異化曲線的區分效果更好,區分能力優于歸一化熔解曲線,圖2-d結果與文獻報道一致。因此,采用LAMP-HRM方法對豬、牛、羊源性成分進行區分是可行的。

2.3 LAMP靈敏度測定

為了明確該方法的靈敏度,將其更好地應用于豬、牛、羊動物源性成分的測定。本實驗將依照10倍梯度稀釋3個物種的DNA模板。最后,分別進行LAMP反應。圖3結果表明,建立的LAMP-HRM方法能夠檢測到0.3 pg/μL、0.03 pg/μL、0.3 pg/μL的豬、牛、羊DNA。其他LAMP方法難以檢測DNA質量濃度在1 pg/μL以下的樣品[22],此方法將檢測靈敏度從10 pg/μL提高到0.3 pg/μL,具有較高的靈敏度。

2.4 混合物種的檢測

采用通用引物擴增單組分(豬、牛、羊)、二元混合物(豬+牛、豬+羊、牛+羊)、三元混合物(豬+牛+羊),并對以上7種樣本進行高分辨熔解。在二維主成分分析圖4-a中,每個樣品的3個平行被劃為一個聚類,混合物種樣品的聚類處于2個純品的聚類之間,證明該方法可以對7種目標物進行鑒別,適合多元混合物的摻假檢測。

將牛和羊物種分別和豬物種的DNA按照不同比例混合,進行LAMP-HRM檢測。檢測結果如圖4-b所示。當牛DNA中摻入5%豬DNA時,通過差異化曲線仍可觀察到明顯的區分效果。圖4-c結果表明,對于羊DNA中摻入豬DNA,通過差異化曲線分析,可以達到1%的檢出限。通過差異化曲線仍可觀察到明顯的區分效果。根據文獻報道[22],通過摻假5%外源物即可牟取經濟利益,因此本實驗證明基于LAMP-HRM的方法可以實現對牛肉和羊肉中分別摻入豬肉DNA的相對定量,且能夠達到5%的最低檢測標準。

a-實時擴增曲線;b-熔解曲線;c-歸一化熔解曲線;d-差異化熔解曲線圖2 基于通用引物的LAMP-HRM方法的可行性驗證Fig.2 Verification of LAMP-HRM feasibility

a -擴增曲線;b-靈敏度檢測標準曲線;圖3 豬、牛、羊源性成分的LAMP-HRM靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity detection of pig, cattle, and sheep derived ingredients by LAMP-HRM注:從上到下依次為豬源性成分、牛源性成分、羊源性成分。

2.5 實際樣品檢測

為了進一步驗證LAMP-HRM方法對實際樣品的適用性,本實驗選擇購買市售的新鮮牛肉卷、羊肉卷這兩種實際樣品,采用所設計好的通用性引物對這些樣品的豬、牛、羊源性成分進行LAMP擴增后采用高分辨熔解。如圖5-a所示,牛肉卷和羊肉卷樣品采用通用引物均有明顯的擴增曲線,通過圖5-b差異化曲線可以觀察到羊肉卷和牛肉卷樣品與豬、牛、羊標品具有明顯的區分。羊肉卷和牛肉卷均檢測出摻入豬源性成分,與標簽標識不符(表3),同時利用實時熒光PCR方法進行對比驗證,其結果與LAMP-HRM一致,證明LAMP高分辨熔解鑒別檢測方法在實際樣品檢測中的適用性良好,且檢測結果可靠。

a-二維PCA分析圖;b-牛物種中摻入不同比例豬物種的差異化熔解曲線;c-羊物種中摻入不同比例豬物種的差異化熔解曲線圖4 LAMP-HRM混合物種的檢測Fig.4 Detection of LAMP-HRM mixed different derived ingredients

a-實際樣品擴增曲線;b-實際樣品差異化曲線圖5 實際樣品檢測Fig.5 Detection of commercial products

表3 市售樣品檢測成分標簽判斷表Table 3 Judgment table of composition labels of commercially available samples

3 結論

本研究通過對豬、牛、羊3個常見動物源性肉制品進行LAMP-HRM測定,通過設計一組通用性引物對目標物種的線粒體DNA進行LAMP擴增,結合高分辨熔解曲線分析技術,對樣品的主成分進行分析,建立了一種可以檢測判定這3種動物源性成分的方法。本研究設計使用的通用性引物不僅減少同時加入多對特異性引物影響擴增反應的可能,而且能減少實驗人員的工作量,操作過程更加方便快捷,提高工作效率。同時在理論上該通用引物可擴增的物種不止實驗中進行區分的3種,也可用于區分其他序列滿足條件的物種。該方法滿足定量要求,具有基本的定量能力,可實現牛肉、豬肉中分別摻入5%和1%豬肉的鑒別。使用此研究體系對牛肉卷、羊肉卷這2種市售樣品進行測定,通過實驗數據分析發現此方法在定性上具有一定的準確性,具有一定的實際應用價值。

相對于現有的基于特異性引物LAMP擴增的方法,該方法具有簡便快捷、靈敏、高效以及高通量污染小的優點,能夠有效提高檢測的效率,擴展檢測的范圍,且具備基本定量能力,在肉及肉制品動物源性成分檢驗的快速檢測中具有良好的發展前景。