高效液相色譜法同時測定乳酸菌發酵液中L/D-乳酸方法的建立與驗證

陳文林,劉沖,于學健,張露,李婷,姚粟

(中國食品發酵工業研究院有限公司,中國工業微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)

乳酸廣泛存在于人體、動植物、微生物的代謝過程,其分子骨架中羧基α位碳原子為不對稱碳原子,可形成L(+)型和D(-)型2種旋光異構體。正常情況下,人體血液中乳酸主要為L-乳酸[1],其代謝成動態平衡[2],由于人體缺乏D-乳酸脫氫酶,D-乳酸代謝較慢而易在體內積累[3],當D-乳酸的產生/吸收超過消除速率,就可能在血液中積累[4],當血液D-乳酸濃度≥3 mmol/L時,則產生D-乳酸中毒,臨床表現為精神錯亂、嗜睡、記憶喪失、頭痛和上肢運動障礙等癥狀[5]。乳酸代謝清除主要在肝臟及腎臟中,而嬰幼兒因其肝腎功能不成熟導致對D-乳酸的代謝能力更低。人體中D-乳酸的來源主要由腸道微生物代謝產生,如Lactobacillusacidophilus,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis等微生物均可產生D-乳酸[6],食物、藥物的外源性攝入[7]與丙酮醛途徑代謝[3]產生的D-乳酸較少,腸道菌群的組成對D-乳酸的積累有重要影響[8],研究表明D-乳酸中毒與益生菌的攝入引起的腸道微生物群的改變有關,停用益生菌后癥狀得以緩解[9];并有兒童短腸綜合征患者在服用含有嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌的益生菌產品后,反復出現D-乳酸中毒癥狀,血清D-乳酸水平高達11.4 mmol/L[10]。因此嬰幼兒及腸胃消化不良人群應該選擇適宜的益生菌。

聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界衛生組織(World Health Organization,WHO)提出一些GRAS批準菌株具有產D-乳酸的代謝活性[11],存在潛在風險。WHO也對D-乳酸攝取量進行了限制(100 mg/kg體重)。此外,CXS 72—1981《嬰兒配方奶粉和嬰兒專用配方奶粉標準》中指出在嬰兒配方奶粉及特殊醫療目的的配方奶粉中單產L-乳酸的培養物可以被使用,并需證明在弱勢群體中使用的安全性。但國內還未有法規標準對食品用菌種產D-乳酸情況提出明確限定。僅在《食品用菌種安全性評價程序(征求意見稿)》中提出直接添加到供1歲以下嬰兒食用食品中的菌種,需按照國家標準規定的檢驗方法或其他等效方法進行D-乳酸的測定。因此食品用菌種產L/D-乳酸的檢測與評價至關重要。

目前還未有適用于微生物發酵液中L/D-乳酸同時定性定量的標準檢測方法,GB 1886.173—2016《食品安全國家標準 食品添加劑乳酸》采用液相色譜定性,滴定法定量,其適用范圍為食品添加劑乳酸含量的測定。QB/T 5712—2022《發酵液中L-乳酸的測定酶電極法》是采用酶電極乳酸分析儀測定發酵液中L-乳酸含量,定量限為10.0 μg/mL,但不能進行D-乳酸的檢測分析。ISO 8069—2005《奶粉-乳酸和乳酸鹽含量的測定》,利用L-乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)和D-乳酸脫氫酶(D-LDH)特異性反應,通過分光光度計可快速測定奶粉中L/D-乳酸含量,但此方法存在酶易失活、樣品中內源性L-LDH與L-乳酸反應生成中產物造成實驗誤差的風險[12-13]。此外還有其他方法,如氣相色譜法、毛細管電泳法、中和滴定法、EDTA定鈣法、原子吸收光譜法等,均只能測定產品中乳酸總量不能區分其光學構型[14]。高效液相色譜法通過手性色譜柱可實現對樣品中L/D-乳酸的分離,同時進行定性分析和定量檢測,在測定D-乳酸時檢測范圍廣,并具有良好的靈敏度、準確性和重復性,在微生物產D-乳酸評價具備良好應用前景[15-16]。

本研究采用高效液相色譜結合手性柱建立一種適用于乳酸菌發酵液中L/D-乳酸的定量檢測方法,并對所建方法的專屬性、精密度、準確性、定量限、線性范圍及穩定性指標進行驗證。利用該方法對乳酸菌類益生菌在特定培養條件下進行L/D-乳酸的定量檢測,對不同種乳酸菌產D-乳酸情況系統分析,旨在為益生菌安全性評價等行業標準法規制定提供技術參考,對促進益生菌在食品行業更加安全和廣泛的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株信息

實驗所用菌株如表1所示,共收集18株乳酸菌菌株,包括可用于嬰幼兒食品的菌株、酸奶發酵劑菌株以及自行分離自食品的菌株。

1.1.2 實驗試劑

L-乳酸(色譜純,98%純度)、D-乳酸(色譜純,90%純度),Sigma公司;異丙醇,色譜純,美國Fisher公司;甲醇(色譜純),美國Fisher公司;CuSO4·5H2O(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;MRS培養基、半胱氨酸鹽酸鹽,北京陸橋技術股份有限公司;厭氧產氣袋,日本三菱化學公司。

1.2 儀器與設備

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀,ThermoFisher公司;CRS10 W手性柱(4.6 mm×50 mm,3 μm),日本三菱化學公司;微量可調移液器、小型臺式冷凍離心機,德國Eppendorf公司;高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司;生物安全柜,新加坡ESCO公司;分析天平,梅特勒公司;隔水式培養箱,上海一恒科學儀器有限公司。

表1 菌株信息Table 1 Information of selected strains

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱:CRS10 W(4.6 mm×50 mm,3 μm);流動相:2 mmol/L CuSO4·5H2O水溶液;流速:0.5 mL/min;柱溫:25 ℃;紫外檢測器,檢測波長254 nm;進樣量:10 μL。

1.3.2 標準曲線制作

準確稱取L-乳酸標準品和D-乳酸標準品,用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成質量濃度4.0 mg/mL的L-乳酸、D-乳酸標準品溶液。并將其稀釋為不同質量濃度的L/D-乳酸混合標準溶液,分別為1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0、400.0 μg/mL。經水系0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測,根據檢測結果繪制峰面積及質量濃度的標準曲線。

1.3.3 乳酸菌發酵液樣品制備

選擇廣泛適用于乳酸菌生長的MRS培養基,并添加還原劑半胱氨酸鹽酸鹽改善厭氧乳酸菌生長,提高菌株生長活力[17]。將乳酸菌菌株轉接至0.05%半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養基中,37 ℃培養48 h,雙歧桿菌屬在厭氧條件下培養。發酵液離心收集上清液,稀釋適當倍數后經水系0.22 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC檢測。

1.3.4 專屬性驗證

將L/D-乳酸標準品溶液、空白培養基樣品和菌株發酵液樣品分別進行HPLC檢測,按1.3.1節色譜條件進行測定,記錄色譜圖。

1.3.5 檢出限及定量限測定

將L/D-乳酸混合標準品溶液逐級稀釋后進行HPLC檢測,通過信噪比(S/N=3)得出本方法中L/D-乳酸的最低檢出限(limit of detection,LOD),并通過信噪比(S/N=10)得出L/D-乳酸的定量限(limit of quantitation,LOQ)[18]。

1.3.6 精密度驗證

選取菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI為驗證菌株,每株菌株按照1.3.3節方法制備發酵液,并進行10次重復實驗,得到的發酵液進行HPLC檢測,計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.7 準確度驗證

以菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI為驗證菌株,根據菌株發酵液中的L/D-乳酸含量,在發酵液中添加5種不同濃度的L/D-乳酸標準品溶液,檢測并計算加標后的發酵液中L-乳酸、D-乳酸含量及回收率,每個濃度下進行3次重復實驗。

回收率計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.8 發酵液線性范圍驗證

將菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發酵液進行系列梯度稀釋,檢測不同濃度發酵液中L-乳酸、D-乳酸的含量,以檢測結果為因變量,樣品的預期濃度為自變量進行線性回歸分析,計算相關系數R2。

1.3.9 穩定性試驗

選取菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI的發酵液,在樣品制備0、8、16、24、32、48 h后進行HPLC檢測,通過標準曲線計算發酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量,計算不同貯藏時間檢測結果的相對標準偏差。

1.3.10 樣品測定

將18株乳酸菌菌株按照1.3.3節方法制備發酵液,并按照1.3.1節色譜條件檢測發酵液中的L-乳酸、D-乳酸含量。

1.3.11 數據處理

所有實驗進行3次平行實驗,采用SPSS 25.0的單因素方差分析(One-way AVONA)和Duncan′s多重比較法進行數據統計(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 L/D-乳酸的標準曲線

參照GB/T 35655—2017選取不同濃度范圍的L/D-乳酸標準品溶液建立回歸方程,以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,回歸方程及相關系數見表2。不同濃度范圍的L-乳酸和D-乳酸標準品溶液的檢測響應值呈良好的線性關系,未發現明顯的離群值或異常值。因此得到L-乳酸和D-乳酸在1.0～ 400.0 μg/mL范圍內的標準曲線分別為:y=0.148 6x+0.022和y=0.086 1x+0.018 9,用于乳酸菌發酵液中L/D-乳酸的定量分析。

2.2 專屬性驗證結果

在建立的色譜條件下,L/D-乳酸色譜圖如圖1所示,混合標準品溶液中D-乳酸的保留時間為13.68 min,L-乳酸的保留時間為17.92 min,根據保留時間對樣品進行定性分析。空白培養基樣品在L/D-乳酸位置處無干擾峰,在2株菌株發酵液中L/D-乳酸兩組分的分離度為4.0～6.0,可實現L-乳酸和D-乳酸的完全分離。

2.3 最低檢出限及定量限測定結果

通過將L/D-乳酸混合標準品溶液逐級稀釋,并結合信噪比計算得出本方法中L/D-乳酸的最低檢出限為0.25 μg/mL,以及L/D-乳酸的定量限為0.80 μg/mL。

2.4 精密度驗證結果

對菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI進行10次重復實驗,測得發酵液中L/D-乳酸含量如表3所示,在2株乳酸菌的發酵液樣品中L/D-乳酸的RSD值均在3.5%以下,表明此方法的精密度、重復性良好。

表3 精密度驗證結果 單位:mg/mL

2.4 準確度驗證結果

在菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發酵液中進行加標回收率檢測,實驗結果如表4所示,結果表明不同濃度的L-乳酸標準品溶液在2株乳酸菌發酵液中的回收率為94.0%～103.7%;不同濃度的D-乳酸標準品溶液在2株乳酸菌發酵液中的回收率為90.0%～99.3%,因此檢測結果準確,具有可靠性。

表4 菌株發酵液加標回收率結果Table 4 Results of standard recovery of fermentation broth of strains

2.5 線性范圍驗證結果

將菌株L.rhamnosusA和L.helveticusI發酵液樣品進行逐步稀釋,將不同稀釋度下測得結果與預期濃度進行線性回歸分析。結果如表5所示,2株菌株發酵液在進行50～3 200倍的稀釋過程中,L/D-乳酸的檢測結果與預期結果的R2均在0.999以上,因此菌株發酵液在較大的稀釋范圍內,L/D-乳酸檢測結果具有良好線性關系。

表5 菌株發酵液線性范圍驗證結果Table 5 Results of linear range verification of fermentation broth

2.6 穩定性驗證結果

測定存儲0、8、16、24、32、48 h后的L.rhamnosusA和L.helveticusI菌株發酵液樣品,檢測結果如表6所示,在2株菌株發酵液中L/D-乳酸含量的RSD值均小于5.0%。實驗結果表明,在樣品制備48 h內L-乳酸和D-乳酸含量檢測值變化差異不顯著,在檢測時間范圍內,L/D-乳酸在微生物發酵液中均可以穩定存在。

表6 穩定性驗證結果 單位:mg/mL

綜上,以上驗證指標結果符合《中國藥典》(2020版)0512高效液相色譜法方法學及9201藥品微生物檢驗替代方法驗證的要求,發酵液中L/D-乳酸兩組分的分離度>1.5、加標回收率≥70%、精密度RSD≤35%、線性范圍回歸曲線R2≥0.98。

2.7 乳酸菌發酵液樣品檢測結果

乳酸的2種異構體形式D(-)和L(+)可以通過不同的立體特異性NAD-依賴型乳酸脫氫酶(D-LDH或L-LDH),還原丙酮酸形成。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)根據L/D-乳酸產物的比例不同,可分為L-LAB、D-LAB和DL-LAB[19]。涵蓋4個屬8個種的18株乳酸菌菌株在改良MRS培養基中培養,測得發酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量如圖2所示,菌株S.thermophilusL和B.longumP～R發酵液中的L-乳酸光學純度均為100%,菌株在此條件下只產生L-乳酸。L.delbrueckiisubsp.bulgaricusK發酵液中的D-乳酸光學純度為100%,菌株在此條件下只產生D-乳酸。鼠李糖乳酪桿菌L.rhamnosusA～F發酵液中L-乳酸含量占比均在80%以上。B.animalisM～O同樣以產L-乳酸為主。L.acidophilusG、L.fermentumH、L.helveticusI呈現相似趨勢,產生的D-乳酸含量比例均在50%以上。

不同種乳酸菌產L/D-乳酸的情況具有顯著差異,同種乳酸菌產L/D-乳酸比例相近,而株間產L/D-乳酸的含量也具有差異,具有菌株特異性。6株L.rhamnosus產生少量D-乳酸,含量均在3.0 mg/mL以下,L-乳酸含量為12.5～14.7 mg/mL;2株L.helveticus的L-乳酸含量基本相同,D-乳酸含量具有顯著差異;3株B.animalis發酵液中D-乳酸在5%以內,L-乳酸含量具有顯著差異,為5.9～15.2 mg/mL。3株B.longum均不產D-乳酸,但其L-乳酸含量也具有顯著差異。同種乳酸菌具有相似的代謝模式,在18株菌株中Ld.subsp.bulgaricusK單產D-乳酸,并且D-乳酸量最高,為17.5 mg/mL,S.thermophilusL只產L-乳酸。研究表明S.thermophilus在發酵過程中只產生L-乳酸,S.thermophilus的基因組缺乏編碼D-LDH基因[20],L.delbrueckiisubsp.bulgaricus在生長過程中90%以上的丙酮酸通過糖酵解途徑轉化為D-乳酸,其D-LDH基因表達水平或酶活性較高[21],很少或不產生L-乳酸。本實驗建立的HPLC方法檢測范圍廣、準確性較好,適用于多種乳酸菌發酵液樣品中L/D-乳酸含量的分析。

圖2 發酵液中L/D-乳酸含量Fig.2 Content of L/ D-lactic acid in fermentation broth

3 結論與討論

目前已有研究利用高效液相色譜法和手性柱同時檢測白酒和藥物原料中L-乳酸和D-乳酸的含量,檢測結果準確度高、重現性好[22-23]。乳酸菌類食品用菌種合成D-乳酸的代謝活性已受到關注,因此對乳酸菌發酵液中L/D-乳酸的準確檢測具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜結合手性柱建立了一種適用于乳酸菌發酵液中L/D-乳酸同時定性定量的檢測方法。所建方法中L/D-乳酸質量濃度為1.0～ 400.0 μg/mL范圍內具有良好線性關系,L/D-乳酸檢出限為0.25 μg/mL,定量限為0.80 μg/mL。基于2株乳酸菌L.rhamnosus和L.helveticus的發酵液驗證表明,該方法專屬性、精密度、準確性、線性相關性和穩定性指標良好,適用于乳酸菌發酵液中L/D-乳酸的定量檢測。并對不同種乳酸菌產L/D-乳酸情況系統分析,利用該方法檢測18株乳酸菌菌株在改良MRS培養基中產生L/D-乳酸情況,結果表明,乳酸菌產L/D-乳酸含量及比例具有菌株特異性,因此對于乳酸菌產L/D-乳酸的評價需在菌株基礎上。此外,發酵條件如培養基種類、碳氮源、溫度、pH值、溶解氧含量等均可影響乳酸菌的生長,從而影響乳酸的產生,如在不同初始乳糖濃度下生長L.delbrueckii產D-乳酸的量隨乳糖增加而增加,由4.95到19.20 mg/mL[24]。因此未來基于此方法可進一步分析多種乳酸菌在不同培養條件下、不同應用場景中產L/D-乳酸情況。本研究所建立方法為食品用菌種安全性評價中菌株代謝產物D-乳酸的評價提供了有效數據支撐和實踐參考,以及為適用于嬰幼兒的益生菌資源的開發提供一定的技術參考,對促進益生菌在食品行業更加安全和廣泛的應用具有重要意義。