超高效液相色譜-串聯質譜-同位素標記-酸水解法同時測定嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿

詹勝群,葛城,劉金梅,丁玉珍,周榮杰,劉鋼,張浩,周鈞

(澳優乳業(中國)有限公司,湖南 長沙,410200)

膽堿(choline),在自然界存在游離態和結合態2種形式,其中結合態有如乙酰膽堿、與磷脂結合成的磷脂酰膽堿、鞘磷脂等。膽堿具有保障神經信息傳遞、促進腦發育和脂肪代謝等作用[1-3],最新研究表明,膽堿能夠保護和補償細胞因子、與藥物組合幫助治療肌萎縮性側索硬化癥、與丁酸鹽組合有益地調節腸道微生物組等[4-5]。左旋肉堿(L-carnitine)也存在游離態和結合態的形式,具有促進代謝、保護神經細胞、清除自由基等作用[6-8],最新研究表明,左旋肉堿在治療新生兒難治性線粒體心肌病、與其他藥物協同抗骨質疏松并改善藥物毒性等方面作用巨大[9-10]。成人所需的膽堿和左旋肉堿可以自身合成,而嬰幼兒由于身體發育未全,合成有限,所以在嬰配奶粉中普遍將膽堿和左旋肉堿作為可選擇性營養強化劑進行添加,保障嬰幼兒生長發育所需[11-12],故嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿的準確測定具有重要意義。目前,國內膽堿的最新標準為GB 5413.20—2022,該標準中第一、二、三法分別為酶比色法、離子色譜法和LC-MS/MS;左旋肉堿的標準為GB 29989—2013,標準中方法為酶比色法;即國內并無色譜類標準方法檢測左旋肉堿,也無標準方法可同時檢測膽堿與左旋肉堿。故如若能建立同時檢測該2種物質的方法,將顯著提升檢測效率并降低成本。

儀器法是大多數檢測方法的發展趨勢,特別是LC-MS/MS法,因其具有靈敏度高、抗干擾能力強和樣品定性不依賴保留時間的特點,在諸多文獻方法中研究廣泛。王艷等[7]、劉玲君等[13]、劉艷明等[14]采用LC-MS/MS法測定了奶粉中的左旋肉堿,但未對膽堿進行監測;詹越城等[11]、唐吉旺等[15]的方法雖然能同時檢測膽堿、左旋肉堿,但方法采用外標法定量,對于基質效應等可能引起的損失暫未提及;李麗萍等[12]、李秀英等[1]、黃金鳳等[16]、黃燾等[17]的方法雖然都采用了同位素內標法,但李麗萍等[12]、李秀英等[1]的方法中內標的加入在水解之后,且前者還需要用到超濾管進行冷凍離心凈化、后者需用微波消解儀消解,處理過程較為繁瑣的同時也可能造成目標物質的損失;黃金鳳等[16]的方法則稱樣量過小(0.2 g),其前處理采用亞鐵氰化鉀/乙酸鋅進行凈化沉淀,但詹越城等[11]在研究中表明亞鐵氰化鉀/乙酸鋅進行沉淀會導致回收率損失;黃燾等[17]的方法則在凈化上雖然考慮全面,但前處理無水解、消解等過程,這可能會導致結合態膽堿、左旋肉堿損失,最終使得測定結果偏低。因此,在現有研究基礎上,充分考察前處理過程及色譜、質譜條件,以期建立一個完善的超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)來同時測定嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸銨、甲酸(MS級),德國CNW公司;鹽酸(優級純),國藥試劑;氫氧化鈉(優級純),恒興試劑。標準品:膽堿酒石酸氫鹽(純度99.1%),上海安譜;左旋肉堿(純度98.2%),上海安譜;膽堿-D4(純度98.6%),加拿大TRC公司;左旋肉堿-D3(純度98.5%),加拿大CDN公司。質控樣:嬰幼配方乳粉膽堿左旋肉堿牛磺酸肌醇質控樣(QC-IP-707),中國檢驗檢疫科學研究院。

1.2 儀器與設備

Thermo Endura高效液相色譜-串聯質譜儀(ESI源),美國Thermo Fisher公司;Milli-Q超純水儀,美國Millipore公司;HWS-28電熱恒溫水浴鍋,上海一恒公司;ME204E電子天平、FE28 pH計,梅特勒托利多公司;舒美牌KQ-500DE超聲波恒溫水浴振蕩器,昆山市超聲儀器有限公司;ACQUITY UPLC HSS C18 SB柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),美國Waters公司;0.22 μm尼龍濾膜,上海安譜公司;2.5 mL聚丙烯注射器,湖南平安醫械科技有限公司;聚乙烯巴斯德塑料吸管(3 mL,160 mm),德國CNW公司。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

流動相:A:甲酸銨水溶液[10 mmol/L,甲酸調pH值至(5.0±0.1)];B:乙腈;流速:0.5 mL/min,進樣量:10 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.2 質譜條件

離子源:ESI+;鞘氣:50 Arb;輔助氣:5 Arb;吹掃氣:0 Arb;碰撞氣:氬氣(1.5 mtor);噴霧電壓:4 500 V;脫溶劑溫度:350 ℃;離子傳輸管溫度:300 ℃;掃描模式:多反應監測(multi reaction monitoring,MRM)。

1.3.3 標準工作溶液配制

a)膽堿、膽堿-D4、左旋肉堿及左旋肉堿-D3儲備溶液:質量濃度均為1 000 μg/mL,均用10 mmol/L甲酸銨水溶液配制;b)膽堿、左旋肉堿標準混合中間液:膽堿、左旋肉堿標準混合中間液質量濃度分別為10 μg/mL;膽堿-D4、左旋肉堿-D3內標混合中間液質量濃度分別為20 μg/mL,均用10 mmol/L甲酸銨水溶液配制;c)膽堿、左旋肉堿工作溶液:用乙腈將中間液逐級稀釋、混合,配成的工作液中膽堿左旋肉堿質量濃度為0.8、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0 ng/mL,其中內標質量濃度均為50 ng/mL。臨用現配。

1.3.4 前處理方法

準確稱取1～5 g(精確至0.001 g)試樣,用溫水溶解后,轉移至100 mL容量瓶中,冷卻至室溫后用水定容,混勻。吸取1 mL樣液于100 mL燒杯中,備用。在上述燒杯中,加1 000 μg/mL的膽堿-D4、左旋肉堿-D3內標儲備液各50 μL后,加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL,小心搖晃均勻,用保鮮膜蓋住燒杯超聲振蕩5 min。樣液在(70±2) ℃水浴中加熱2 h(每隔30 min搖勻一次)冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至5.0～5.3,轉移至100 mL容量瓶,用水定容,混勻。然后用乙腈將定容后的樣液稀釋10倍,經0.22 μm有機相濾膜過濾至進樣瓶中,待測。

2 結果與分析

2.1 質譜參數的優化

質譜參數優化采用蠕動泵注射質量濃度為1 μg/mL 左右的標準溶液分別對目標化合物進行參數優化。電噴霧正離子模式下,通過MRM模式優化各個碎片離子的去簇電壓和碰撞電壓。具體的化合物碎片二級質譜參數見表2。

2.2 流動相的選擇

流動相參照GB 5413.20—2022標準中第三法進行配制,即水相為10 mmol/L甲酸銨水溶液[甲酸調pH值至(5.0±0.1)],有機相為乙腈。水相中加入一定量的甲酸可促進目標化合物的電離,起到提高離子化效率的作用;乙腈與水的體系對目標化合物的響應效果好于甲醇與水的體系,這在一些相關文獻方法中有應用[11,15]。

表2 膽堿、左旋肉堿及其內標的質譜參數Table 2 Mass spectrometry parameters of choline, L-carnitine, and their internal standards

2.3 色譜柱的選擇

膽堿、左旋肉堿化學結構中都含有強極性的堿性季銨基團,故選擇親水性強的色譜柱有助于二者的保留。HILIC色譜柱在劉玲君等[13]、劉艷明等[14]、詹越城等[11]的研究中有采用,Amide色譜柱在李麗萍等[12]、黃燾等[17]的研究中有采用,而親水性的C18色譜柱在唐吉旺等[15]、潘拾朝等[18]、高進等[19]的研究中有采用,故本次研究選擇了這3種應用相對較多的色譜柱進行對比。由圖1可知,鍵合相為三鍵鍵合的酰胺柱對于膽堿和左旋肉堿的響應最高、峰形最好;無鍵合的BEH顆粒的HILIC色譜柱保留較酰胺柱稍強,但響應次之,且膽堿色譜峰存在拖尾,峰形也不對稱,故該柱僅合適分離左旋肉堿;無封端的HSS C18色譜柱保留最強,對膽堿的分離峰形也較佳,只是響應稍差,但左旋肉堿出現了峰展極寬的情形,故該柱單獨分離膽堿較合適。綜合對比下,同時分離膽堿、左旋肉堿采用Amide柱最佳。

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖1 不同色譜柱對膽堿、左旋肉堿的分離效果Fig.1 Separation effect of different columns on choline and L-carnitine

2.4 柱溫的選擇

柱溫不僅影響各化合物的分配系數同時也影響傳質速率。本次研究預設了30、35、40 ℃ 3個不同水平以考察柱溫對色譜柱分離的影響。如圖2所示,柱溫升高,膽堿和左旋肉堿的保留均減弱,膽堿出峰提前更明顯,響應和峰形上各化合物在不同柱溫下均相差不大,但柱溫的升高能顯著降低系統背壓,故選擇40 ℃作為色譜柱柱溫。

2.5 流速的選擇

流速與化合物的保留、峰形、響應以及柱壓大小密切相關。膽堿國標方法(GB 5413.20—2022)中液質法的梯度條件參考流速為0.3 mL/min,本次研究預設了0.4～0.7 mL/min 4個不同的流速與其對比。如圖3所示,流速增加,膽堿和膽堿-D4色譜峰出峰提前、響應明顯增強;左旋肉堿和左旋肉堿-D3色譜峰出峰同樣提前,但響應上基本無區別。考慮到膽堿的響應應選擇高流速,而考慮系統背壓和溶劑節省等因素應選擇低流速。因本研究中化合物響應均較好,故折中選擇0.5 mL/min流速即可。

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖2 柱溫對色譜柱分離的影響Fig.2 Effect of temperature on column separation

a-膽堿;b-膽堿-D4;c-左旋肉堿;d-左旋肉堿-D3圖3 流速對分離的影響Fig.3 Effect of flow rate on separation

2.6 溶劑效應

2.6.1 溶劑效應的影響

在前述色譜柱、柱溫、流速的選擇研究中,有注意到膽堿色譜峰底部存在肩峰或緊臨的干擾峰,而左旋肉堿容易過載,即在進樣量稍微增加時左旋肉堿色譜峰易變形(無樣品基質情況)。如圖4-a和圖4-b所示,對于膽堿,主要的溶劑效應是導致色譜峰出現肩峰或分叉峰。在進樣量0.5 μL增加至1.75 μL過程中,膽堿色譜峰從肩峰變成明顯的分叉峰且2個分叉峰分離度逐漸增加,主峰位置從左側轉換至右側,在進樣量從1.75 μL繼續增加至7 μL過程中,膽堿左側小的分叉峰逐漸減小直至消失,且與右側主峰的分離度逐漸增加。對于左旋肉堿,由圖4-c和圖4-d可知主要的溶劑效應是色譜峰發生變形或導致肩峰,在進樣量從0.5 μL增加至3.0 μL過程中左旋肉堿色譜峰峰形和響應均較好,而進樣量增加到4.0 μL時色譜峰左側開始變寬,在5.0、7.0 μL時已經出現明顯肩峰,且底部峰展寬峰形極差。由此可見,溶劑效應與進樣體積因素密切相關,同時會因存在樣品基質而影響加重,對于膽堿,只有當進樣量大于至7 μL時溶劑效應才會消除,而對于左旋肉堿只有當進樣量小于4 μL時溶劑效應才不會對峰形造成影響,而這存在矛盾,故需要在最終樣液稀釋過程中選擇合適比例的稀釋溶劑消除溶劑效應,并確定合適的進樣量。

a-膽堿(0.5～1.75 μL);b-膽堿(1.75～7.0 μL);c-左旋肉堿(0.5～1.75 μL);d-左旋肉堿(1.75～7.0 μL)圖4 不同進樣體積下溶劑效應的影響Fig.4 Influence of different injection volumes on solvent effects

2.6.2 溶劑效應的消除

由于溶劑效應受進樣量影響,故本次研究設置1 μL和10 μL以分別考察不同進樣體積下稀釋溶劑對溶劑效應的消除作用,試驗方法為用不同體積比的乙腈/甲酸銨水溶液(10 mmol/L)將水解定容后的樣液統一稀釋10倍。如圖5-a和圖5-b所示,對于膽堿,當進樣量為1 μL時,膽堿存在右側肩峰或分叉峰,隨著乙腈體積分數從0%增加至30%,右側分叉峰逐漸縮小變成肩峰,在乙腈體積分數繼續增加直至100%時,肩峰逐漸變小直至消失;當進樣量為10 μL時,隨著乙腈體積比增加,膽堿峰型從矮胖的肩峰逐漸變為瘦高峰(在30%處峰形有一次變化),即在乙腈體積分數分別為0%、10%、50%時峰形為肩峰,且主峰從左側轉換至右側,保留時間也出現先縮短后延長的明顯變化,直至乙腈體積分數為70%后峰形趨于穩定。對左旋肉堿,由圖5-c和圖5-d可知,在進樣為1 μL時,所試驗的乙腈體積比的變化對峰形均未造成影響,而在進樣量為10 μL時,乙腈體積比的增加使得峰形從明顯的前伸峰變成瘦高峰,且峰高增加并在100%處達到最大。綜上,故選擇純乙腈作為水解樣液的稀釋液,在稀釋10倍這一情況下,稀釋后的樣液體系與初始流動相正好一致。

2.6.3 進樣量的確定

消除溶劑效應影響后,對同一樣液進樣不同體積以考察進樣量,如圖6所示,除膽堿和膽堿內標在進樣0.5～3 μL過程中保留時間變化外,大于3 μL進樣體積后的保留時間均穩定,且膽堿和左旋肉堿及內標的峰高均隨進樣體積增加而增加,進樣至30 μL時峰形仍對稱良好,故考慮響應和色譜柱載量預留等因素折中選擇10 μL為進樣體積。

2.7 水解時間對結果測定的影響

水解時間的長短主要影響結合態的膽堿和左旋肉堿的測定。在同一樣液中均加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL,70 ℃下分別水解不同的時間[15],測定結果如圖7所示,相對于水解時間為0 h,在水解0.5、1 h時測定結果明顯隨水解時間延長而增加,而在1 h之后測定結果沒有明顯增加,說明樣品中存在結合態的膽堿和左旋肉堿,且在水解1 h時結合態部分的膽堿和左旋肉堿已基本水解完畢并全部游離出來。為保證樣品充分水解,可適當延長水解時間,可選擇2 h。

a-膽堿(進樣1 μL);b-膽堿(進樣10 μL);c-左旋肉堿(進樣1 μL);d-左旋肉堿(進樣10 μL)圖5 不同稀釋溶劑對膽堿、左旋肉堿溶劑效應的影響Fig.5 Effect of different diluted solvents on solvent effects of choline and L-carnitine

a-不同進樣量下膽堿的響應和保留;b-不同進樣量下膽堿-D4的響應和保留;c-不同進樣量下左旋肉堿的響應和保留; d-不同進樣量下左旋肉堿-D3的響應和保留圖6 進樣量的確定Fig.6 Determination of injection volume

2.8 pH調節對測定結果的影響

根據膽堿國標方法(GB 5413.20—2022)中的液質法,前處理水解后需要將pH值調節至5.0～5.3,因為水解后溶液pH值依舊小于2,而酰胺柱pH值耐受范圍為2～11,故需要對樣液進行pH調節。如圖8所示,對同一水解后的樣液用氫氧化鈉溶液進行pH調節,結果發現pH值在2～9內對測定結果基本無影響,故pH值的調節大致調至5.0左右即可。

2.9 基質效應與過程回收率

采用提取后添加法對基質效應和過程回收率進行評估[20]。由于未尋得絕對空白的膽堿、左旋肉堿嬰配奶粉樣品,故采用添加膽堿、左旋肉堿同位素內標的方式進行考察。在空白試劑中進行水解前和水解后的內標加標,分別測定加標后的響應值,通過t檢驗可判斷水解過程是否存在回收率的損失;在樣品水解后的基質中加內標并與試劑空白水解后加內標對比,通過t檢驗可判斷是否存在基質效應。由表3和表4可知,參與比較的所有數據均方差同質,過程回收率均差異不顯著,但基質效應檢驗上發現膽堿差異極顯著,在有基質存在的情況下膽堿的測定結果較空白中低,存在基質抑制,故對于膽堿的測定需采用同位素內標法來進行校正。

a-膽堿;b-左旋肉堿圖7 水解時間對結果測定的影響(n=2)Fig.7 Effect of hydrolysis time on result determination (n=2)

a-膽堿;b-左旋肉堿圖8 pH調節對測定結果的影響(n=2)Fig.8 Effect of pH regulation on assay results (n=2)

2.10 質控樣和回收率的測定

通過測定膽堿、左旋肉堿的質控樣QC-IP-707和在含有本底的牛乳基質樣品中進行低、中、高三水平的膽堿、左旋肉堿加標(n=3),以驗證方法的正確性。由表5可知,膽堿、左旋肉堿的3平行測定結果均在質控樣特性值范圍內,且均接近特性值;由表6可知,膽堿平均回收率為96.9%,左旋肉堿平均回收率為98.0%,且膽堿、左旋肉堿各重復水平的回收率均為95%～105%,均符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求,說明方法正確性均良好。

表3 膽堿、左旋肉堿的加標測試結果Table 3 Spike test results of choline and L-carnitine

表4 膽堿、左旋肉堿的基質效應與過程回收率的t檢驗Table 4 T-test for matrix effects and process recovery of choline and L-carnitine

表5 膽堿、左旋肉堿外部質控樣測試結果Table 5 Choline and L-carnitine external quality control sample test results

表6 膽堿、左旋肉堿樣品加標結果Table 6 Sample spike results of choline and L-carnitine

2.11 線性范圍

以待測物的濃度為橫坐標、待測物信號強度與其內標的比值為縱坐標,并以1/X為權重的加權最小二乘法對各坐標點進行線性回歸擬合。結果表明,膽堿和左旋肉堿均在0.8～200 ng/mL呈良好的線性關系,線性方程分別為,膽堿:Y=0.045 58X-0.007 751,相關系數R=0.999 7;左旋肉堿:Y=0.019 95X-0.010 51,相關系數R=0.999 8。

2.12 檢出限和定量限

采用信噪比法評估檢出限和定量限。當稱樣量為2 g時,以3倍信噪比定為檢出限、10倍信噪比定為定量限,通過對膽堿、左旋肉堿樣品的不斷稀釋,在低含量水平(0.3 ng/mL)下上機分析得到信噪比數據,經計算得到膽堿、左旋肉堿定量限分別為3、0.3 mg/kg,檢出限分別為1、0.1 mg/kg。

2.13 精密度

儀器精密度:通過對一質量濃度為0.8 ng/mL的標準溶液進行連續測定(n=8),結果表明,膽堿的均值為(0.921 6±0.016 27) ng/mL,RSD為1.77%,左旋肉堿的均值為(0.955 1±0.041 68) ng/mL,RSD為4.36%。方法精密度:通過對一嬰配奶粉樣品進行平行測定(n=9),測定結果中膽堿均值為(209.7±5.0) mg/100 g,RSD為2.37%,左旋肉堿均值為(16.2±0.4) mg/100 g,RSD為2.71%。根據GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求,膽堿方法精密度≤2.7%、左旋肉堿方法精密度≤3.8%,儀器精密度需均≤5.3%,由以上數據可知均滿足標準要求。

3 結論

通過對色譜柱進行比較研究,發現Amide柱同時分析膽堿和左旋肉堿的效果較HILIC色譜柱和親水性的C18色譜柱好,故選擇鍵合相為酰胺基的色譜柱為分析柱,同時優化確定了最佳柱溫、流速參數;在溶劑效應考察中發現在樣液的溶劑比例與初始流動相不一致時會導致嚴重的溶劑效應,通過試驗不同稀釋溶劑對溶劑效應的消除作用,發現在稀釋10倍的情形下用純乙腈作為水解樣液的稀釋溶劑效果最好;溶劑效應消除后,確定10 μL體積為進樣量。在前處理條件優化過程中,對水解時長的考察發現,水解1 h后結合態的膽堿和左旋肉堿已基本游離釋放,對pH調節的考察發現,pH值在2～9內對測定結果基本無影響,回收率試驗發現過程無回收率損失,基質效應考察發現膽堿存在基質抑制,故采用同位素內標法來進行基質效應的校正。本次研究建立了以同位素為標記、酸水解法為前處理、酰胺柱為分析柱的UPLC-MS/MS法,方法限值低、前處理簡單、準確性高,方法驗證各項參數均滿足國標要求,適用于嬰配奶粉中膽堿和左旋肉堿的同時測定。