食源性副溶血性弧菌生物被膜調控機制的研究進展

唐佳靈,郭星藍,饒鈞玥,楊茂杰,曹蕓榕,韓國全,2*

1(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625014)2(四川農業大學食品加工與安全研究所,四川 雅安,625014)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)隸屬于弧菌科弧菌屬,為革蘭氏陰性嗜鹽性海洋細菌,VP主要存在于淺海地區,并且在幾乎所有水生生物中可大量生長繁殖。常存在于魚、蝦、貝等日常食用的海產品中,是在我國沿海地區導致食物中毒和夏季腹瀉的主要病原菌,臨床上可引起人類腹痛、嘔吐及腹瀉等癥狀,甚至會導致死亡;由于其生成的被膜加強了自身的抗性,導致其對環境有著很強的抵抗力,普通的加熱方式難以將其殺滅,該菌也是高居微生物性食物中毒的榜首[1],因此探究生物被膜(biofilm,BF)的生成機制極其重要。表1是我國部分地區VP的檢出率。由表1可以得知,在我國各地的水產品中,VP的檢出率均較高。

表1 我國部分地區副溶血性弧菌陽性檢出率Table 1 Positive detection rate of V.parahaemolyticus in some regions of China

BF是微生物在特定條件下形成的一種特殊群體結構,是細菌為了適應環境、利于自身生存的一種存在形態,具有很強的抗性,當形成至成熟階段,不僅容易產生毒素污染食品,還容易造成食物中毒,危害人民群眾健康安全。BF是微生物群落附著在各種載體上,通過分泌多糖、纖維蛋白與脂質蛋白等胞外基質,將載體包繞其中而形成的大量高度組織化、系統化的膜樣聚合物。據美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)統計,人類細菌性感染中大約65%是由BF引起的[8]。同時,隨著廣譜抗菌藥物的大量使用,多重耐藥的VP的檢出率越來越高,有研究表明,其耐藥性的產生與生物被膜形成密切相關[9]。

VP能夠在生物和非生物表面形成BF,甚至可以黏附到人體的腸道中,進而引發一系列疾病。有研究表明,BF還會促使更多的細菌協同共生,使宿主表面污染的更加嚴重,例如在VP的BF里,會與單增李斯特菌協同生長,對人體或者食品起著更大的破壞作用[10]。同時在自然環境中,BF是大部分細菌的溫室,它使得細菌對環境的壓力抗性增強。目前,關于研究細菌BF的形成機制中,多集中在銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌中,對VP生物被膜的形成原理的探討相對較少。因此,本文通過對VP BF形成的動態過程、信號分子以及它的具體調控過程進行綜合論述,為解決該菌的BF出現在人類疾病治療、食用食品和食品生產工具上等難題提供理論依據,并期望從中得出解決辦法。

1 BF的形成過程

近年來,隨著越來越多的國內外學者參與BF機制的研究,對BF的了解越發深入。BF的形成是一個復雜的動態過程,目前,學術界內普遍將BF的形成過程分為5個階段,如圖1所示,即分別為可逆附著階段、不可逆附著階段、微菌落的形成、BF的成熟及最終的分散階段[11]。細菌在BF模式下抵抗力的強度是單個浮游細菌的上千倍,這就導致在宿主表面很難將其徹底消滅。

在第一階段,由于細菌與被接觸物體表面的非特異性相互作用,包括靜電力、疏水作用等,以附著在宿主表面。在此期間,菌體一般都是通過浮游細菌形式存在的。此時菌體與被附著物體之間相互作用不強,可通過簡單溫和的方式將二者進行分離。第二階段主要是細菌開始分泌群體感應分子和黏性聚合物,同時也因為細菌的一些附屬結構(例如鞭毛和菌毛等),增強了與被接觸物品之間的相互作用,導致其從第一階段的可逆附著變為不可逆附著。在第三階段中,由于第二階段中的細菌數量逐漸增加,細菌會因為BF的形成而使得一些相關基因被激活和表達,在胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)內繁殖形成單一菌落,隨后大量聚集而形成微菌落,同時大量的微菌落還會促使BF加厚。第三階段中,隨著大量的微菌落形成,BF的厚度逐漸增大,BF最終成熟并定殖于被附著物體表面。此階段的BF,對惡劣的環境有著更強的抗性。最后階段,細菌從成熟的BF中游離出來,再次轉變為浮游狀態,以尋求更適宜的生長環境,尋找適合的物體表面形成新的BF,形成浮游細菌-細菌BF-浮游細菌-細菌BF的循環形態,以此進行大量增殖直至污染物體表面各處,這是一個沒有休止的循環。

成熟的BF對食品的加工過程和安全造成極大的影響。BF附著在食品,生產設備等表面,甚至還會附著在動物表皮、人的牙齒表面,對人體的健康以及財產造成極大的危害。其生長在食品表面,會造成食品的貨架期和保質期的縮短,使經濟遭受極大損失。李安琪[12]研究表明在VP(ATCC17802和VP-0)的生物被膜形成過程中,0～12 h為可逆黏附階段,12～48 h為不可逆黏附和微菌落形成階段,48～72 h為成熟階段,72～144 h為分散階段;這對VP的BF形成過程有了更進一步的了解,若在第一階段就將其消滅,就可得到良好的控制,這對食品生產具有指導意義。由于現實環境的復雜性,BF的形成與實驗室條件下存在一定差距,因此還需要更深一步研究。

階段1:可逆附著階段;階段2:不可逆附著階段;階段3:微菌落的形成;階段4:生物被膜的成熟;階段5:單個細菌從微菌落分散出來圖1 細菌生物被膜發育階段的模Fig.1 Model of the developmental stage of bacterial biofilm

2 影響生物被膜形成的調控因素

2.1 環二鳥苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)調控生物被膜的形成

2.1.1 c-di-GMP的形成及作用

在細菌中,c-di-GMP是最重要和最常見的第二信使分子,主要是由兩分子的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)經二鳥苷酸環化酶催化縮合形成的環狀二核苷酸[13],其通常存在于原核生物細胞中,在革蘭氏陰性菌中最為普遍;它是控制著細菌從游離狀態、表面附著、形成成熟的BF到再次改變為游離狀態的核心調控因子[14],其具體作用為誘導效應蛋白構象變化、轉錄激活、蛋白間的相互作用、基因下調和增強酶活性,從而調控生物被膜的形成、細菌動力和毒力因子等。c-di-GMP對細菌的BF形成具有重要的意義,不僅可以通過直接誘導蛋白產生BF,亦可通過間接調節EPS的方式來參與生成BF;但在不同生物中,EPS對生物被膜的形成和抗逆性了解的并不清晰,需更進一步的了解。

根據最近研究表明,c-di-GMP調節細菌下一步表型的方式大致有3種:c-di-GMP的受體蛋白與轉錄因子進行結合,進而調控轉錄因子對相關基因轉錄的調控[15];c-di-GMP通過調控靶蛋白來影響細菌的生命活動[16];c-di-GMP作為核糖開關,在核糖體上的mRNA結合位點結合,進一步調節mRNA的轉錄和翻譯[17]。但是,通過第三步的方式來調控下游表型的細菌較少。

2.1.2 二鳥苷酸環化酶與磷酸二酯酶調控c-di-GMP的機制

含有GGEEF或GGDEF結構域的二鳥苷酸環化酶(diguanylate cyclases,DGCs)和含有EAL或HD-GYP結構域的磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)參與c-di-GMP的共同調節。最新的研究表明,含有GGDEF結構域的DGCs會導致c-di-GMP濃度增高,即DGCs可合成c-di-GMP?；钚訢GCs由2個被GGDEF結構域整合的亞基組成,DGCs的催化活性位點插入到2個亞基的界面上,每個亞基可以結合一個GTP分子,這個位點對GGDEF基序有回應,并且這個基序處的任何突變都會導致DGCs失活[17]。具體合成c-di-GMP的機制是2個GTP以反平行的方式被DGCs的2個亞基結合,生成一個c-di-GMP分子。當細胞內存在Mn2+和Mg2+時,具有EAL或HD-GYP結構域活性的PDEs可以催化c-di-GMP降解,其中EAL結構域降解c-di-GMP為2分子GMP,HD-GYP結構域降解為5′-磷酸鳥苷酸-(3′-5′)-鳥苷(pGpG)[18]。對其晶體結構的研究表明,EAL二聚體具有一種蛤殼狀的開啟和關閉機制,負責調節PDEs的活性,其保守的二聚界面由2個螺旋組成,其中一個是α5,通過形成β5-α5環直接連接到2個中心的Asp殘基,后者與活性位點上的金屬離子進行配位,從而調節PDEs的活性[19];此外,在EAL二聚體的打開和關閉運動中,β5-α5環可能發生顯著重排,該環可作為一個“鉸鏈關節”,通過金屬離子在活性位點上的定位,將EAL構象與PDEs的活性進行聯系起來,一些含有c-di-GMP效應因子的EAL結構域蛋白通過使用這種底物結合的二聚體和β5-α5重排來調節細菌生理過程,進而抑制c-di-GMP形成[20]。其次,各種不同的受體對c-di-GMP濃度變化的感應,導致c-di-GMP與受體共同作用于下游的靶標,將信號傳達下去,最后,將信號轉化成對各種生物學性狀的調控,具體如圖2所示[21]。近年來,也新發現了一系列的含GGDEF結構域的基因,如cdgA、cdgB、cdgC、cdgD、cdgE、cdgF、cdgG和cdgH等,其中cdgF編碼的二磷酸環化酶通過控制細菌的生長方向來完成向生物被膜的轉換[22]。

圖2 c-di-GMP分子調控模式Fig.2 c-di-GMP molecular regulatory model

不過,GGDEF和EAL結構域可能同時出現于同一個蛋白質中,這種蛋白被稱作“混合型”蛋白質[23]。二者任何一個結構域被催化活化,另一個結構域即獲得調控功能或出現第三方調控結構域來實現二者功能的分離,進而影響生物被膜的形成。有研究表明,若是細菌胞內的c-di-GMP濃度高于某一標準值,則可以促進生物被膜的形成,反之,若濃度過低,則可抑制生物被膜的形成[24]。GALPERIN等[25]發現,弧菌比其他細菌含有更多的DGCs和PDEs,說明c-di-GMP對弧菌生物學的重要意義,也反映了c-di-GMP在調控生物被膜中的重要作用。對不同的菌種而言,細菌體內的DGCs和PDEs含量不盡相同,但都處于動態平衡,在各自的生命活動中發揮著獨特作用。

2.1.3 VP中c-di-GMP的具體表達

VP中的c-di-GMP受到ScrA、ScrB、ScrC、ScrG等十幾個蛋白的調控,其中ScrA、ScrB、ScrC由操縱子scrABC編碼;當ScrC與ScrA和ScrB共同存在時,它可以作為磷酸二酯酶減少細胞中的c-di-GMP;相反,ScrC在ScrA和ScrB兩個都缺失的情況下,將作為二鳥苷酸環化酶產生c-di-GMP[26]。但沒有研究表明ScrC或ScrA缺失一個是否會對BF的形成有影響。ScrA是一種存在于胞漿中的磷酸吡哆醛依賴型的氨基轉移酶,其功能主要是產生分泌性信號(S信號),能與ScrB(一種存在于周質中的依賴蛋白)發生相互作用[27],當細胞中出現S信號后并達到一定標準后,使蛋白ScrC(為一種潛在的感覺蛋白)的EAL結構域表現出PDEs活性,使c-di-GMP發生降解,同時通過激活laf基因(鞭毛基因)使其運動能力增強,并抑制cps基因(莢膜多糖基因)的表達,從而使BF的形成能力減弱;當S信號濃度降低時,ScrC蛋白將會表現出GGDEF結構域的作用,開始表現出DGCs活性,以此來促進c-di-GMP的合成[28]。不過當scrABC操縱子突變后,由于其抑制了laf基因和cps基因的表達,將會導致菌體的爬動能力逐漸喪失并且呈現出皺縮的菌落形態,導致其比野生型菌株有更強的形成BF能力[29]。綜上可知,Scr轉錄因子家族在VP BF發育所需的靶基因中發揮了獨特和重疊的調控作用,如何避免或降低ScrABC操縱子突變率,也是抑制形成生物被膜的重要因素。

綜上,若能提前抑制DGCs或激發PDEs的活性,即可以使細菌胞內的c-di-GMP含量降低到難以進行下一步表達的濃度,進而阻斷VP產生部分后續的生理效應。根據研究表明,一些物質能提前抑制c-di-GMP的轉錄,具體見下表所示:

表2 抑制c-di-GMP轉錄的物質Table 2 Substances that inhibit c-di-GMP transcription

但上表介紹的2種抑制劑對人體都有著較強的毒性,因而應用面較窄;而藍光和NO的應用,卻有著較高的經濟成本,故若能發現一種對人體無害、成本低、且能抑制BF形成的物質或方法,將對食品行業帶來積極的影響。

2.2 群體感應系統調控生物被膜的形成

群體感應(quorum sensing,QS)又稱為“細胞與細胞的交流”,是微生物間通過化學信號分子進行信息傳遞的一種方式,且需要信號分子濃度達到一定的數值時才能發生的感應現象;當信號分子達到一定閾值時,可與相對應的應答原件結合,改變細菌代謝狀態、某種特定蛋白轉錄及表達水平,進而形成對環境抗性極強的BF系統。這類分子被稱為自誘導物(autoinducer,AI),AI通?？杀环譃槿箢?自誘導子-2(autoinducer-2,AI-2)、N-?；呓z氨酸內酯(N-acryl homoserine lactones,AHLs)和自誘導肽(autoinducing peptide,AIP)。AI-2是一種存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的信號分子,其可以實現細菌的種間交流,促進混合菌BF的形成[34]。AHLs是存在于大多數革蘭氏陰性菌的信號分子,其分子結構主要是由N-酰基高絲氨酸內酯環外加一個含4～18個碳的酰基側鏈構成[35],這是一類水溶性、膜透過性分子,可自由出入細胞。被修飾后的寡肽分子AIP是革蘭氏陽性菌的主要信號分子[36],其氨基酸數量通常為5～17個,氨基酸側鏈一般含有異戊烯,硫內酯環等修飾基因[37],但在不同細菌中產生的AIP信號分子,它的大小和結構略有差異。本節主要從AI-2、AHLs 和AIP這3個研究的較為徹底的QS信號分子為例,闡述其參與調控細菌BF形成的機制。

2.2.1 AI-2的形成及表達

自誘導子-2也就是呋喃硼酸二酯(furanosyl borate diester, AI-2),是甲基循環中的前產物,其產生依賴于S-核糖同型半胱氨酸酶 (S-ribose homocysteinase, LuxS)蛋白。其合成過程中為,蛋氨酸(methione,MET)結合ATP在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)作用下生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM),SAM主要作為甲基供體,其在轉甲基酶作用下產生的中間產物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosine homocysteine, SAH)被S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosine homocysteine nucleosidase, SAHN)水解成S-核糖同型半胱氨酸(S-ribose homocysteine, SRH)和腺嘌呤;LuxS蛋白催化SRH裂解成4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)和同型半胱氨酸(homocysteine,HCY),繼而DPD與硼酸結合產生高活性的AI-2并通過自由擴散轉運至細胞外,而HCY可接受甲基,繼續參與SAM的循環[38]。在所有的細菌中,幾乎都存在以AI-2為信號分子的群體感應系統;在細菌各自的生理活動過程,不僅參與自身蛋白表達,也積極參與和其他細菌之間的信息交流,進而形成共同的群體表達,例如形成BF、產生多種不同的毒力因子等。

圖3 AI-2合成過程Fig.3 The AI-2 synthesis process

2.2.2 AHLs的形成及表達

AHLs的表達是由信號分子合成酶LuxI族蛋白和AHLs受體LuxR類結合轉錄激活蛋白組成;LuxI蛋白為AHLs的合成酶,通常SAM的高半胱氨酸基團被酰基-?；d體蛋白(acyl-acylated carrier proteins,acyl-ACP)上的酰基側鏈結合,產生具有特異性的?；呓z氨酸內酯(homoserine lactone,HSL)分子,再內酯化就形成了AHLs[39]。LuxR類蛋白由兩個結構域組成,分別是由N端負責識別并結合酰基高絲酸內酯(acyl homosilkolactone,Acyl-HSL)的結構域和C端包含一個螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)結構、并負責DNA結合及轉錄激活功能的結構域[40]。隨著細菌密度的不斷增加,AHLs合成后分泌到胞外,且當其濃度隨著細菌細胞密度的提高而不斷增加,達到一定閾值時,能被LuxR蛋白所感知并結合,形成LuxI-LuxR蛋白復合體,從而調控特定基因的表達,主要包括生物被膜的形成和毒力因子的釋放[41]。

革蘭氏陰性菌中除了典型的LuxI/LuxR型的QS系統外,還根據AHLs?；鶄孺湹呐帕胁灰恢?分為Lasl/LasR和Abal/AbaR型等QS系統,也都分別調控細菌的生物被膜和毒力因子的形成[42]。例如,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有Lasl/LasR和RhlR/Rhll兩個體系的群體感應系統;鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)具有Abal/AbaR為體系的群體感應系統。兩者的研究表明在不同的細菌中,盡管具有調節蛋白和與它相結合蛋白功能的物質都大致相同,但在具體的某種菌體內,調節系統都根據其自身性質和具體環境條件而較為唯一。

2.2.3 AIP的形成及表達

AIP是由細胞中的核糖體合成的無活性的前體肽,在向細胞外輸出過程中經過處理和修飾,經過修飾的前體肽由ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter protein, ABCTP)輸出,并通過蛋白水解去除其前序列來進行激活[43]。當AIP的濃度隨細菌增長到一定閾值時,位于細胞膜上的AIP信號識別系統識別AIP并與之結合后,能夠進行自磷酸化,并激活細胞膜上的雙組分磷酸激酶系統(two-component phosphokinase system,TCS),磷酸化后的受體蛋白能與DNA特定靶位點相結合,兩者結合后使組氨酸蛋白激酶被激活從而調控QS相關基因的表達[44];細菌BF的生成并不僅僅是由單一調控機制而決定,還會與其他機制相結合來表達此種生理性狀。同時,因為不同細菌的AIP分子質量不同、結構不同,所以也會展示出不同的表達性,這就導致AIP信號分子只能用于細菌的種內交流。

2.2.4 VP中QS系統及其表達

在VP中,有3種不同類型的QS系統:利用CAI-1自我誘導的CqsA/S系統,CqsS為感應信號分子;利用AI-2自誘導因子,由LuxS合成信號分子,由LuxP/Q為感應信號分子;利用HAI-1自動誘導LuxM系統,由LuxN為感應信號分子[45]。在VP中,自誘導因子產生后,擴散穿過細胞膜再與膜上的受體蛋白結合,且AphA和OpaR蛋白是VP中群體感應2種主要調節因子,它們分別在低細胞密度(low cell density,LCD)和高細胞密度(high cell density,HCD)下大量產生和作用。當VP在低細胞密度中生長時,因與膜受體蛋白結合的自誘導因子濃度太低,受體蛋白作為激酶磷酸化磷酸轉移蛋白LuxU, LuxU將磷酸基團轉移到調控因子LuxO上,磷酸化的LuxO(LuxO-P)促進群體調節RNA(quorum regulatory RNAs,Qrr sRNA)的轉錄[46]。在LCD中,轉錄后的Qrr sRNA通過與aphA的mRNA堿基進行互補配對,促進轉錄因子AphA的翻譯,并與AphA一起抑制OpaR的翻譯,在此時期,AphA處于最高水平,OpaR處于最低水平;當VP在高細胞密度生長時,受體蛋白結合自動誘導劑轉換為磷酸酶,調節回路中的磷酸鹽使LuxO去磷酸化,促使Qrr sRNA不再表達,此時OpaR高表達,而AphA的表達受到抑制,OpaR開始積累并抑制aphA、opaR以及BF的相關基因的轉錄[46]。當所有的信號分子濃度達到穩定時,群體感應開始結束,這也是VP從群體感應開始表達到結束的整個階段。跟絕大多數的細菌一樣,完成了從前期信號分子開始分泌,到感應期的基因進行表達,最后在到結束期的整個階段。

BF的形成是一個受多因素影響的過程。WANG等[47]研究表明BF的形成需要AphA;AphA屬于有翼螺旋轉錄因子,其活性蛋白為二聚體結構,并具有DNA結合結構域,可以促進BF基因和毒力基因的轉錄,導致BF的形成。在ZHANG等[45]的研究中,OpaR通過降低細胞內c-di-GMP的濃度來抑制野生型VP RIMD2210633菌株形成生物被膜,其主要是OpaR通過對編碼為GGDEF或EAL結構域蛋白7個基因的轉錄調控來直接影響細菌內c-di-GMP濃度的變化來影響BF的形成。雖然證實了AphA會促進BF的形成,但同時AphA會抑制MfqABC操縱子的轉錄,MfqABC是細胞膜融合轉運蛋白,也是一種促進BF發育的膜融合轉運蛋白;相反的是,OpaR卻會與MfqABC蛋白結合,增強其轉錄[48]。在VP的QS系統中,它會與c-di-GMP這個調控因素相結合,共同參與BF的生成。

圖4 副溶血性弧菌群體感應系統Fig.4 V.parahaemolyticus quorum sensing system

研究表明,越來越多的物質被發現能夠對QS系統進行干涉,抑制其BF的形成,例如:槲皮素[49]、青霉酸[50]和溴化噻吩酮化合物[51]可以提前對QS系統進行干預。

總之,VP的QS系統是一個十分復雜的信號調控網絡,在毒力基因和BF基因轉錄之間起著非常重要的作用。該調控系統的復雜性和所需大量不同轉運蛋白是整合大量信號分子、并進化出最適合細菌生存條件所必需的。

2.3 雙組分系統調控生物被膜的形成

2.3.1 TCS的組成及表達

雙組分系統(two-component system,TCS)是在所有生物中普遍存在的信號轉導系統。該系統最早發現于大腸桿菌中,后來的研究者發現在所有已測序的細菌基因組中幾乎都有TCS。TCS主要由2種蛋白組成:接受外部信號刺激的傳感器蛋白組氨酸激酶蛋白(histidine protein kinase,HK)和調控基因表達的響應調節蛋白(response regulator,RR),表明了這2種蛋白與BF形成的相關性、重要性。

HK是一個跨膜感應蛋白,是由2個亞基組成的同型二聚體的膜蛋白,每個亞基包含一個ATP結合的催化結構域,一個二聚體結構域和一個組氨酸磷酸化位點,且每個組氨酸磷酸化位點嵌入二聚體結構域內;RR是胞內蛋白,含有保守的N端接收器結構域和C端可變的效應器結構域。接收器結構域中有一個保守的天冬氨酸(Asp)磷酸化位點,催化其同源組胺酸激酶的磷酸轉移,進而引起本身的構象變化[52]。當細胞外刺激信號被HK接收時,激活自身和ATP結合部位,并將ATP轉化為ADP,然后ATP的磷酸基團轉移到二聚體功能區,與組氨酸結合,并在組氨酸殘基處發生自磷酸化反應,然后磷酸化的HK基團轉移至RR的N端處的天冬氨酸殘基位點處,于是磷酸化的RR被激活,暴露出DNA結合位點,再與靶細胞基因的啟動子序列進行特異性結合,從而調控特定基因的表達和蛋白的轉錄和合成[53]。同時,需要注意的是,不同細菌種類的HK和RR不同。例如,在銅綠假單胞菌中,目前鑒定出了60多種TCS,而GacS(HK)/GaxA(RR)是研究的最為深入的,同時也是控制BF形成的關鍵因素之一[54];在大腸桿菌中,KdpD(HK)/KdpE(RR)雙組分系統響應K+的刺激,進而調控生物被膜、細菌毒力等基因的表達[55]。可以看出,不同細菌體內的各種應答蛋白并不相同。

研究表明,一些化合物質能夠抑制雙組分系統的表達,例如傳感器激酶的抑制劑噻吩并吡啶化合物,它可以干擾TCS系統自磷酸化和磷酸轉移反應[56];調節蛋白的抑制劑石膽酸,能夠干擾TCS系統磷酸化作用或阻止信號與靶DNA結合[57]。但此2種物質應用面較為局限,只適用于金黃色葡萄球菌、結核桿菌和幽門螺旋桿菌,本身也都具有一定的毒性,不可大規模使用在食品行業中。

2.3.2 VP中TCS系統及其表達

在VP中,TCS系統中的EvnZ(HK)/OmpR(RR)蛋白調控生物被膜的形成[58]。當環境滲透壓發生顯著變化時,EvnZ肽段C端的His消耗一個ATP,發生自磷酸化(其中His243是EvnZ自磷酸化點),將磷酸基團傳遞給細胞內的OmpR上的Asp殘基(Asp55是磷酸化轉移的受體位點),激活OmpR磷酸化產生OmpR-R,從而調控膜孔蛋白OmpF和OmpC的表達來應對環境滲透強度的變化,進一步參與生物被膜形成的調控[59]。張藝蓓[60]通過EvnZ/OmpR對副溶血性弧菌毒力因子的調控實驗也驗證了EvnZ/OmpR會促進VP中BF的形成。但是否在該細菌中還有其他不同的HK和RR蛋白,還值得繼續探索。

3 總結

VP本身作為一種食源性致病菌,具有較強的致病性,而當VP形成生物被膜以后,其抗性和毒性也會不斷增加。綜上所述,VP生物被膜的形成機制是一個極其復雜的過程,涉及多因素的獨自參與、共同參與、直接參與或間接參與;QS系統會與c-di-GMP相結合,共同作用于生物被膜的生成,同時TCS系統與c-di-GMP和QS之間也存在著一些相同的功能。信使分子c-di-GMP對BF的形成有著核心調控作用,但是否還有效應蛋白能夠參與調控形成BF的生物行為還需進一步研究。大多文獻都探討了c-di-GMP和QS對BF的形成的重要性,但由于環境中微生物的多樣性、復雜性及微生物的種間交流,仍需要對TCS如何影響BF的形成進行更深入的研究,有助于探究抑制生物被膜的形成的方法,為食品生產提供安全指導,為人民健康生活提供有力保障。