白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡影響

游福蓉 杜占慧 宗麗娟 王勤拯 張成 邢泉生

［收稿日期］2023-03-07;? ［修訂日期］2023-07-17

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82071583）

［第一作者］游福蓉（1996-），女，碩士研究生。E-mail：157306-88277@163.com。

［通信作者］張成（1967-），男，副主任醫(yī)師。E-mail：15805321-977@163.com。邢泉生（1964-），男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：qsxing@163.com。

［摘要］? 目的

探討白藜蘆醇對(duì)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）鐵死亡的影響。

方法? 利用ox-LDL誘導(dǎo)建立HUVECs鐵死亡模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、ox-LDL組和白藜蘆醇低、中、高劑量組。分別檢測(cè)各組細(xì)胞存活率及細(xì)胞中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、亞鐵離子（Fe2+）、活性氧（ROS）水平；采用免疫印跡法及免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和鐵蛋白重鏈（FTH1）蛋白表達(dá)。

結(jié)果? 與對(duì)照組相比，ox-LDL組細(xì)胞存活率及細(xì)胞中GSH、GPX4、SLC7A11和FTH1表達(dá)明顯降低，MDA、Fe2+和ROS水平顯著升高；與ox-LDL組相比，白藜蘆醇低、中、高劑量組細(xì)胞存活率及細(xì)胞中GSH、GPX4、SLC7A11和FTH1表達(dá)明顯升高，MDA、Fe2+和ROS水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.93～722.16，P<0.05）。

結(jié)論? 白藜蘆醇可能通過(guò)激活SLC7A11/GPX4信號(hào)通路保護(hù)HUVECs免受鐵死亡的影響。

［關(guān)鍵詞］? 白藜蘆醇；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；鐵死亡

［中圖分類(lèi)號(hào)］? R329.2;R972.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］? A

［文章編號(hào)］? 2096-5532（2023）05-0633-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.144

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231114.1021.001;2023-11-15? 10：23：50

INFLUENCE OF RESVERATROL ON OX-LDL-INDUCED FERROPTOSIS IN HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS

YOU Furong， DU Zhanhui， ZONG Lijuan， WANG Qinzheng， ZHANG Cheng， XING Quansheng

＼ （Heart Center， The Affi-

liated Women and Childrens Hospital of Qingdao University， Qingdao 266034， China）

＼; ［ABSTRACT］＼ Objective＼ To investigate the influence of resveratrol on oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）-induced ferroptosis in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）.

＼ Methods＼ The ferroptosis in HUVECs was induced by ox-LDL. In this study， control group， ox-LDL group， and low-， middle-， and high-dose resveratrol groups were set. Cell viability and levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， ferrous ion （Fe2+）， and reactive oxygen species （ROS） in cells were measured. Western blot and immunofluorescence method were applied to measure the protein expression of glutathione peroxidase 4 （GPX4）， solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11）， and ferritin heavy chain 1 （FTH1） in cells.

＼ Results＼ Compared with the control group， the ox-LDL group had significantly decreased cell viability and expression levels of GSH， GPX4， SLC7A11， and FTH1， and significantly increased MDA， Fe2+， and ROS levels. Compared with the ox-LDL group， the low-， middle-， and high-dose resveratrol groups had significantly increased cell viability and expression levels of GSH， GPX4， SLC7A11， and FTH1， and significantly decreased MDA， Fe2+， and ROS levels （F=9.93-722.16，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ Resveratrol may protect HUVECs from ferroptosis by activating the SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

［KEY WORDS］＼ resveratrol; human umbilical vein endothelial cells; ferroptosis

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是以脂質(zhì)蓄積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的慢性炎癥性過(guò)程，是冠心病、心肌梗死、腦卒中等眾多心腦血管事件的病理基礎(chǔ)[1-3]。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種因素密切相關(guān)，其中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[4]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有利于氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）浸潤(rùn)至內(nèi)皮下層，同時(shí)選擇性招募單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下層轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，通過(guò)吞噬經(jīng)理化修飾的脂蛋白形成泡沫細(xì)胞引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)AS的發(fā)生發(fā)展[3，5]。鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴(lài)的新型細(xì)胞死亡方式，其特征是鐵依賴(lài)的活性氧（ROS）和脂質(zhì)過(guò)氧化物的蓄積、谷胱甘肽（GSH）的耗竭以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的失活等[1-2]。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，鐵死亡是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要原因，在推動(dòng)AS進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[3-4]。白藜蘆醇為一種天然植物多酚，主要存在于葡萄、花生、虎杖、大豆等多種植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等功效[6-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂水平、抗血小板聚集、抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抑制斑塊內(nèi)新生血管等作用發(fā)揮抗AS作用[8-10]。但有關(guān)白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用鐵死亡誘導(dǎo)劑ox-LDL建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）鐵死亡模型，探討白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響及機(jī)制，從而為明確中醫(yī)藥治療AS疾病作用機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 主要材料

HUVECs購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；ox-LDL購(gòu)自美國(guó)默克公司；白藜蘆醇，分子式為C14H12O3，分子量228.24，純度99.94%，購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)白鯊生物有限公司；亞鐵離子（Fe2+）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司；GSH及丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；CCK-8溶液購(gòu)自武漢Proteintech公司；兔抗GPX4以及鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗鐵蛋白重鏈（FTH1）單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司；兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）單克隆抗體、山羊抗兔lgG-HRP及山羊抗鼠lgG-HRP二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)及分組? HUVECs置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將正常的HUVECs隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、ox-LDL組（B組）及白藜蘆醇低、中、高劑量組（C、D、E組）。A組在正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，B組加入含有100 mg/L ox-LDL的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，C、D、E組分別用白藜蘆醇5、10、20 μmol/L預(yù)處理4 h后，更換為含有100 mg/L ox-LDL的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.2? CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，以每孔5 000個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁、按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。然后計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3? 細(xì)胞中Fe2+、ROS、MDA和GSH含量檢測(cè)

將HUVECs按每孔2×105個(gè)接種于6孔板內(nèi)，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物進(jìn)行處理。收集各組細(xì)胞，使用Fe2+、ROS、GSH、MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS、GSH、MDA含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4? 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GPX4、SLC7A11和FTH1蛋白表達(dá)? 將HUVECs接種于6孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理。收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳反應(yīng)后，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（β-actin、GPX4、FTH1和SLC7A11，以1∶1 000抗體稀釋液稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗（以1∶5 000抗體稀釋液稀釋?zhuān)┖脱蚩故蠖梗ㄒ?∶10 000抗體稀釋液稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，洗去二抗，用ECL試劑盒顯色，在凝膠成像儀上顯影并拍照，用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5? 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GPX4、SLC7A11和FTH1表達(dá)? 將HUVECs按每孔2×103個(gè)接種于24孔板內(nèi)，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理。用40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，PBS浸洗，5 g/L Triton X-100透膜15 min，50 g/L BSA封閉1 h，去除封閉液，加入GPX4（應(yīng)用1∶200抗體稀釋液稀釋?zhuān)LC7A11（應(yīng)用1∶200抗體稀釋液稀釋?zhuān)┮约癋TH1（以1∶100抗體稀釋液稀釋?zhuān)┮豢? ℃孵育過(guò)夜。用PBS洗凈一抗后，加入熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗（以1∶200抗體稀釋液稀釋?zhuān)┦覝乇芄夥跤? h。用PBS洗凈二抗后，以DAPI染核10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。應(yīng)用Image J軟件分析記錄每張圖片的平均熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? ox-LDL和白藜蘆醇對(duì)HUVECs存活率影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL濃度為50、100、150、200 mg/L逐漸升高時(shí)，HUVECs存活率逐漸降低。當(dāng)ox-LDL濃度為100 mg/L時(shí)，與對(duì)照相比，細(xì)胞存活率為54.30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=655.08，P<0.01）。因此，為保證有足夠活力的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，本研究選擇100 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h作為誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的條件。見(jiàn)圖1。與對(duì)照相比，5、10、20 μmol/L濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響（P＞0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中所用不同劑量的白藜蘆醇對(duì)HUVECs無(wú)損傷作用。見(jiàn)圖2。

2.2? 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組HUVECs存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=200.00，P<0.01）。B組細(xì)胞存活率較A組顯著降低（P<0.01）；而經(jīng)低、中、高劑量白藜蘆醇預(yù)處理可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷，并呈劑量依賴(lài)性，與B組比較，C、D、E組細(xì)胞存活率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖3。

2.3? 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量的影響

各組HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.26～415.07，P<0.05）。與A組相比，B組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著增加，而GSH含量顯著降低（P<0.05）；與B組相比較，C、D、E組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著降低，GSH含量顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.4? 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)的影響

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.62～88.92，P<0.05）。與A組相比較，B組HUVECs中GPX4、FTH1以及SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與B組相比較，C、D、E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著增加（P<0.05）。見(jiàn)圖4和表2。

免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.18～722.16，P<0.05）。與A組相比，B組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與B組相比，E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)顯著增加（P<0.05）。見(jiàn)圖5和表3。

A、B、C分別示A組、B組和E組GPX4的表達(dá)，綠色為GPX4染色，藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核；D、E、F分別示A組、B組和E組FTH1的表達(dá)，綠色為FTH1染色，藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核；G、H、I分別示A組、B組和E組SLC7A11的表達(dá)，綠色為SLC7A11染色，藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核。白色箭頭示目的蛋白表達(dá)區(qū)域。免疫熒光染色，100倍。

3? 討? 論

隨著社會(huì)老齡化加重及居民不健康生活方式增加，我國(guó)AS誘發(fā)的多種心血管疾病發(fā)病率、死亡率持續(xù)升高。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血栓形成及脂質(zhì)浸潤(rùn)等密切相關(guān)[1-3]。目前逆轉(zhuǎn)AS嚴(yán)重后果的療法仍然有限。白藜蘆醇作為多酚類(lèi)植物化合物的代表，可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制ROS生成、維持內(nèi)皮功能穩(wěn)定等來(lái)發(fā)揮抗AS作用。但白藜蘆醇的具體作用機(jī)制至今尚未完全闡明。因此，本研究從鐵死亡的角度來(lái)探討白藜蘆醇對(duì)AS的作用及其潛在機(jī)制。有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞用ox-LDL處理后表現(xiàn)出鐵死亡的特征，使用鐵死亡抑制劑則明顯逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的死亡[11]。因此，本研究使用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生鐵死亡。本文結(jié)果顯示，ox-LDL處理后內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降，出現(xiàn)鐵死亡；經(jīng)白藜蘆醇（5、10、20 μmol/L）預(yù)處理可以降低細(xì)胞鐵死亡，減少ROS和MDA產(chǎn)生，顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞活力，且該效應(yīng)隨著白藜蘆醇劑量增加而增強(qiáng)。這表明白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的鐵死亡有拮抗作用，從而可以延緩AS病程進(jìn)展。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS早期病理改變。有研究表明，鐵死亡通過(guò)多種生理機(jī)制參與AS的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，如鐵過(guò)載可以促進(jìn)ROS產(chǎn)生并且激活局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，增加AS斑塊的不穩(wěn)定性[12]；鐵死亡抑制劑通過(guò)減輕鐵死亡引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷而發(fā)揮抗AS作用[3]。由此可見(jiàn)，鐵死亡已成為調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵角色。

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)的可調(diào)節(jié)的氧化性細(xì)胞死亡方式[13]，在生物化學(xué)方面表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)GSH/GPX4失活，過(guò)量的Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量的ROS，與細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物積累，使MDA生成增多。本研究經(jīng)ox-LDL處理的HUVECs中，F(xiàn)e2+、ROS和MDA含量增加，F(xiàn)TH1和GSH水平下降；而白藜蘆醇干預(yù)可降低細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS和MDA含量，提高FTH1和GSH的水平。MDA是ROS介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化生成的一種不飽和醛類(lèi)物質(zhì)，由于它與親核化合物的反應(yīng)性以及在沒(méi)有活性的情況下，能使蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，生成特殊的加合物而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[14]。相關(guān)研究表明，MDA可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，從而加重血管周?chē)难装Y反應(yīng)并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性并造成內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)AS的發(fā)生[15]。因此，MDA被認(rèn)為是造成血管功能障礙的介質(zhì)之一。GSH是體內(nèi)的非酶抗氧化劑，可以作為硒依賴(lài)性GPX4的輔因子和底物來(lái)減少脂質(zhì)過(guò)氧化物，在降低氧化應(yīng)激水平中起著關(guān)鍵作用[16-19]。由此可見(jiàn)，白藜蘆醇通過(guò)提高HUVECs抗氧化能力和降低MDA含量來(lái)減輕ox-LDL誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞損傷。鐵蛋白為細(xì)胞提供了一種以氧化還原非活性形式鎖住過(guò)量鐵的手段，以防止鐵介導(dǎo)的細(xì)胞和組織損傷。鐵蛋白由鐵蛋白輕鏈和FTH1構(gòu)成，是一種儲(chǔ)鐵蛋白復(fù)合體，可調(diào)控儲(chǔ)存的鐵離子。FTH1在鐵蛋白結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用，也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志性蛋白，可催化Fe2+氧化發(fā)揮儲(chǔ)鐵功能進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)Fe2+。FTH1水平降低導(dǎo)致體內(nèi)Fe2+水平升高，過(guò)量的Fe2+會(huì)引起脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致ROS水平升高，促進(jìn)鐵死亡發(fā)生[18，20]。本研究結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激清除過(guò)量的Fe2+，抑制鐵死亡的發(fā)生。

GPX4作為細(xì)胞內(nèi)唯一可直接降低磷脂過(guò)氧化的抗氧化酶，是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子[21]。GPX4以GSH為還原劑，催化過(guò)氧化物的過(guò)氧鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基，將過(guò)氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)脂醇，使其失去氧化活性，進(jìn)而抑制鐵死亡[16，22]。GSH和GXP4被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的標(biāo)志物[23-24]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL組HUVECs存活率降低，GSH含量降低，GPX4蛋白的表達(dá)下調(diào)；給予白藜蘆醇預(yù)處理后，細(xì)胞存活率升高，GSH含量升高，GPX4蛋白表達(dá)上調(diào)，提示白藜蘆醇可以減輕HUVECs鐵死亡。

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)體（System Xc-）的底物特異性亞基，在抗氧化劑GSH的生物合成中起著核心作用。SLC7A11的活性被抑制會(huì)導(dǎo)致GSH合成減少，引發(fā)氧化損傷，最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。研究表明，System Xc-和GPX4的活性狀態(tài)是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制[25]。有文獻(xiàn)報(bào)道，高良姜素通過(guò)激活SLC7A11/GPX4軸抑制鐵死亡，從而對(duì)腦缺血再灌注后沙鼠的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用；淫羊藿苷通過(guò)調(diào)節(jié)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡；鹿紅方通過(guò)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路減輕心肌缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞鐵死亡[26-33]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL組HUVECs中，GPX4和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著降低；而給予白藜蘆醇預(yù)處理后，細(xì)胞中GPX4和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著升高。由此推測(cè)，白藜蘆醇可能通過(guò)激活SLC7A11/GPX4軸來(lái)對(duì)抗ox-LDL誘導(dǎo)的鐵死亡。

綜上所述，調(diào)控鐵死亡可能為白藜蘆醇治療AS的重要機(jī)制，本研究結(jié)果為深入挖掘中醫(yī)藥治療AS疾病作用機(jī)制提供了新思路。但本研究?jī)H在細(xì)胞層面初步探討了白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)鐵死亡的可能作用機(jī)制，存在一定的局限性，后續(xù)將深入研究白藜蘆醇調(diào)節(jié)鐵死亡的直接機(jī)制和作用靶點(diǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

[1]MOU Y H， WANG J， WU J C， et al. Ferroptosis， a new form of cell death： opportunities and challenges in cancer[J]. Journal of Hematology & Oncology， 2019，12（1）：34.

[2]YAN N， ZHANG J J. Iron metabolism， ferroptosis， and the links with Alzheimers disease[J]. Frontiers in Neuroscience， 2020，13：1443.

[3]BAI T， LI M X， LIU Y F， et al. Inhibition of ferroptosis alleviates atherosclerosis through attenuating lipid peroxidation and endothelial dysfunction in mouse aortic endothelial cell[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2020，160：92-102.

[4]YANG K， SONG H J， YIN D L. PDSS2 inhibits the ferroptosis of vascular endothelial cells in atherosclerosis by activating Nrf2[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2021，77（6）：767-776.

[5]GIMBRONE M A Jr， GARCA-CARDEA G. Endothelial cell dysfunction and the pathobiology of atherosclerosis[J]. Circulation Research， 2016，118（4）：620-636.

[6]MENG T T， XIAO D F， MUHAMMED A， et al. Anti-inflammatory action and mechanisms of resveratrol[J]. Molecules， 2021，26（1）：229.

[7]BREUSS J M， ATANASOV A G， UHRIN P. Resveratrol and its effects on the vascular system[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019，20（7）：1523.

[8]GUO S T， ZHOU Y， XIE X J. Resveratrol inhibiting TGF/ERK signaling pathway can improve atherosclerosis： backgrounds， mechanisms and effects[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2022，155：113775.

[9]ZHANG X H， JIANG L P， CHEN H B， et al. Resveratrol protected acrolein-induced ferroptosis and insulin secretion dysfunction via ER-stress-related PERK pathway in MIN6 cells[J]. Toxicology， 2022，465：153048.

[10]KHALIL A， BERROUGUI H. Mechanism of action of resve-ratrol in lipid metabolism and atherosclerosis[J]. Clinical Lipidology， 2009，4（5）：527-531.

[11]WUNDERER F， TRAEGER L， SIGURSLID H H， et al. The role of hepcidin and iron homeostasis in atherosclerosis[J]. Pharmacological Research， 2020，153：104664.

[12]MARQUES V B， NASCIMENTO T B， RIBEIRO R F Jr， et al. Chronic iron overload in rats increases vascular reactivity by increasing oxidative stress and reducing nitric oxide bioavai-

lability[J]. Life Sciences， 2015，143：89-97.

[13]XIE Y， HOU W， SONG X， et al. Ferroptosis： process and function[J]. Cell Death & Differentiation， 2016，23（3）：369-379.

[14]KILLER H E， LAENG H R， FLAMMER J， et al. Architecture of arachnoid trabeculae， Pillars， and septa in the su-

barachnoid space of the human optic nerve： anatomy and clinical considerations[J]. The British Journal of Ophthalmology， 2003，87（6）：777-781.

[15]BUERLE J， SCHUCHARDT F， SCHROEDER L， et al. Reproducibility and accuracy of optic nerve sheath diameter assessment using ultrasound compared to magnetic resonance imaging[J]. BMC Neurology， 2013，13：187.

[16]YANG W S， SRIRAMARATNAM R， WELSCH M E， et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[J]. Cell， 2014，156（1-2）：317-331.

[17]KOPPULA P， ZHANG Y L， ZHUANG L， et al. Amino acid transporter SLC7A11/xCT at the crossroads of regulating re-

dox homeostasis and nutrient dependency of cancer[J]. Cancer Communications， 2018，38（1）：12.

[18]ZHANG Y， XIN L Y， XIANG M， et al. The molecular me-

chanisms of ferroptosis and its role in cardiovascular disease[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2022，145：112423.

[19]FENG H Z， STOCKWELL B R. Unsolved mysteries： how does lipid peroxidation cause ferroptosis[J]？ PLoS Biology， 2018，16（5）：e2006203.

[20]HENTZE M W， MUCKENTHALER M U， GALY B， et al. Two to tango： regulation of Mammalian iron metabolism[J]. Cell， 2010，142（1）：24-38.

[21]IMAI H， NAKAGAWA Y. Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione pe-roxidase （PHGPx， GPx4） in mammalian cells[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2003，34（2）：145-169.

[22]MORINOBU S， KUMAGAI S. Glutathione， glutathione pe-

roxidase （GPx）， glutathione S-transferase （GST）[J]. Nihon Rinsho Japanese Journal of Clinical Medicine， 2004，62（Suppl 11）：557-559.

[23]ZHANG Y L， SWANDA R V， NIE L T， et al. mTORC1 couples cyst（e）ine availability with GPX4 protein synthesis and ferroptosis regulation[J]. Nature Communications， 2021，12（1）：1589.

[24]URSINI F， MAIORINO M. Lipid peroxidation and ferroptosis： the role of GSH and GPx4[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2020，152：175-185.

[25]WANG K， CHEN X Z， WANG Y H， et al. Emerging roles of ferroptosis in cardiovascular diseases[J]. Cell Death Discove-

ry， 2022，8（1）：394.

[26]GUAN X， LI Z H， ZHU S， et al. Galangin attenuated cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibition of ferroptosis through activating the SLC7A11/GPX4 axis in gerbils[J]. Life Sciences， 2021，264：118660.

[27]FU C， WU Y F， LIU S J， et al. Rehmannioside A improves cognitive impairment and alleviates ferroptosis via activating PI3K/AKT/Nrf2 and SLC7A11/GPX4 signaling pathway after ischemia[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2022，289：115021.

[28]YU P， ZHANG J， DING Y， et al. Dexmedetomidine post-conditioning alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by ferroptosis inhibition via SLC7A11/GPX4 axis activation[J]. Human Cell， 2022，35（3）：836-848.

[29]LIU T Y， CUI Y T， DONG S S， et al. Treadmill training reduces cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting ferroptosis through activation of SLC7A11/GPX4[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2022，2022：8693664.

[30]王瑤，陳士坤，段晨陽(yáng)，等. Sirt6通過(guò)調(diào)控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌細(xì)胞鐵死亡[J]. 中國(guó)病理生理雜志， 2023，39（2）：335-344.

[31]芮玲，王文靜，倪海萊，等. 銀杏素調(diào)節(jié)Nrf2、SLC7A11、GPX4信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞及鐵死亡的影響[J]. 中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志， 2022，30（12）：2677-2682.

[32]蔡婉，周華，徐基杰，等. 鹿紅方通過(guò)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022，36（S1）：137-142.

[33]高世龍，蔡欽欽，金小健，等. 淫羊藿苷調(diào)節(jié)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡的影響[J]. 中國(guó)藥師， 2022，25（11）：1878-1883.

（本文編輯? 馬偉平）