廣東和山東地區鼻咽癌組織EB病毒BART miRNAcluster 1多態性比較

高龍峰 王巧祎 張增霞 王云

［收稿日期］2023-01-12;? ［修訂日期］2023-05-15

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81171571）

［第一作者］高龍峰（1996-），男，碩士研究生。

［通信作者］王云（1970-），女，博士，教授，碩士生導師。E-mail：qdwangyun@aliyun.com。

［摘要］? 目的

了解廣東和山東地區鼻咽癌（NPC）以及健康人群中EB病毒（EBV）BamHⅠ A右向轉錄產物（BART）微小RNA（miRNA）cluster 1基因多態性，探討其與NPC發生的關系。

方法? 采用巢式PCR和DNA測序檢測183例NPC（廣東79例，山東104例）和113例健康人群（廣東59例，山東54例）樣本中BART miRNA cluster 1序列，應用Lasergene和MEGA軟件對序列進行比對和系統進化樹分析，以特征性突變和系統進化樹對變異分型。比較不同人群和不同地區基因變異型/亞型的分布。

結果? 296例樣本的BART miRNA cluster 1基因序列可分為6種變異型/亞型（BART-A、-B1、-B2、-C、-D1和-D2），其中BART-D2和-D1是主要變異亞型。廣東地區以BART-D2多見，而山東地區以BART-D1多見。廣東地區NPC和健康人群中BART-D2的檢出率分別為86.1%（68/79）和44.1%（26/59），高于山東地區NPC（27.9%，29/104）和健康人群（1.9%，1/54），差異均有統計學意義（χ2=61.032、27.632，P<0.001）；兩個地區NPC中BART-D2的檢出率均高于健康人群，差異有統計學意義（χ2=27.444、15.660，P<0.001）。

結論? EBV BART miRNA cluster 1基因變異在廣東和山東地區存在差異，BART-D2亞型可能主要在廣東地區流行且與NPC的發生相關。

［關鍵詞］? 鼻咽癌；皰疹病毒4型，人；BamHⅠ A右向轉錄物；微RNAs；多態性，單核苷酸

［中圖分類號］? R373.9;R739.63

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2023）05-0639-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.152

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231204.1022.001;2023-12-04? 15：06：43

POLYMORPHISM OF EPSTEIN-BARR VIRUS BART MIRNA CLUSTER 1 IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA TISSUES FROM GUANGDONG AND SHANDONG， CHINA

＼ GAO Longfeng， WANG Qiaoyi， ZHANG Zengxia， WANG Yun

＼ （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

＼; ［ABSTRACT］＼ Objective＼ To determine the polymorphism of Epstein-Barr virus （EBV） BamHⅠ A rightward transcript （BART） microRNA （miRNA） cluster 1 gene in patients with nasopharyngeal carcinoma （NPC） and healthy donors from Guangdong and Shandong， China， and to investigate its association with the occurrence of NPC.

＼ Methods＼ Nested polymerase chain reaction and DNA sequencing were used to detect the sequences of BART miRNA cluster 1 gene in samples from 183 patients with NPC （79 patients from Guangdong and 104 patients from Shandong） and 113 healthy donors （59 donors from Guangdong and 54 donors from Shandong）. Lasergene and MEGA were used to perform comparison and phylogenetic tree analysis for the sequences， and the variations were typed according to the signature changes and phylogenetic tree. The distributions of BART miRNA cluster 1 gene variants/subtypes were compared between different populations and different areas.

＼ Results＼ Six variants/subtypes， namely BART-A， -B1， -B2， -C， -D1， and -D2， were identified in BART miRNA cluster 1 gene sequences from 296 samples. Among them， BART-D2 and -D1 were the main subtypes. In Guangdong， BART-D2 was most common， while in Shandong， BART-D1 was most common. The detection rates of BART-D2 in patients with NPC and healthy donors in Guangdong were 86.1% （68/79） and 44.1% （26/59）， respectively， which were significantly higher than those in patients with NPC （27.9%， 29/104） and healthy donors （1.9%， 1/54） in Shandong （χ2=61.032， 27.632;P<0.001）. More importantly， BART-D2 was more prevalent in NPC cases than in healthy donors in both areas （χ2=27.444， 15.660;P<0.001）.

＼ Conclusion＼ The variations of EBV BART miRNA cluster 1 gene have differences between Guangdong and Shandong. BART-D2 subtype may be mainly prevalent in Guangdong and related to the occurrence of NPC.

［KEY WORDS］＼ nasopharyngeal carcinom; herpesvirus 4， human; BamHⅠ A rightwardtranscripts; microRNAs; polymorphism， single nucleotide

EB病毒（EBV）在人群中普遍感染，但鼻咽癌（NPC）、Burkitts淋巴瘤和結外NK/T細胞淋巴瘤等EBV相關腫瘤的發病呈明顯的地域性分布[1-3]，其中NPC只在中國南方部分地區（廣東、香港、廣西和湖南等）和東南亞高發[1]。造成EBV相關腫瘤地域性分布的原因尚不明確，可能與病毒、遺傳和環境等多種因素相關[1-3]。是否存在與EBV相關腫瘤發生及地域性分布相關的EBV基因變異是腫瘤病因學研究的熱點。以往研究多針對EBV編碼蛋白的基因進行[4-7]，較少關注其非編碼基因。EBV是第一個被確認編碼微小RNA（miRNA）的人類病毒，共編碼44個成熟的miRNA，其中40個由BamHⅠ A右向轉錄產物（BART）生成。BART區域又分為cluster 1和cluster 2兩個區域，其中cluster 1區域包含8個miRNA前體和14個成熟miRNA，cluster 2區域包含有14個miRNA前體和26個成熟miRNA[8-9]。研究表明，BART miRNA在病毒持續性感染和腫瘤發生發展過程中起重要作用[9-11]。最近有研究對BART miRNA啟動子區域和BART miRNA cluster 2區域進行了序列分析，發現這些基因也存在變異，且某些變異可能與腫瘤相關[12-14]，但目前尚無對cluster 1區域基因多態性分析的報道。本研究檢測廣東地區（NPC高發區）和山東地區（NPC低發區）NPC和健康人群中BART cluster 1基因變異情況，探討該基因變異與NPC的關系，以期為揭示EBV基因變異在腫瘤發生中的作用提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 研究對象

廣東地區樣本取自中山醫科大學第一附屬醫院和第三附屬醫院，山東地區樣本取自青島大學附屬醫院。NPC樣本為經病理學檢查確診的石蠟包埋組織；健康人群樣本為取自健康查體人員的咽漱液，其性別及年齡與NPC病人匹配且排除腫瘤病史。石蠟包埋組織和咽漱液標本DNA提取和EBV陽性標本鑒定的具體方法和步驟見文獻[15]。對EBV陽性標本進行BART miRNA cluster 1序列測定，成功獲得序列的296例樣本納入本研究。其中廣東地區NPC病人79例，男58例，女21例，年齡26～69歲，平均（48.63±10.61）歲；健康人群59例，男45例，女14例，年齡27～69歲，平均（49.41±9.85）歲。山東地區NPC病人104例，男79例，女25例，年齡11～71歲，平均（48.16±12.71）歲；健康人群54例，男40例，女14例，年齡24～69歲，平均（48.19±11.42）歲。NPC和健康人群之間及兩個地區人群性別和年齡構成差異均無顯著性（P>0.05）。所有NPC病人和健康人群均為漢族，廣東地區樣本來自祖籍為廣東的當地居民，山東地區樣本來自祖籍為山東的當地居民。

1.2? BART miRNA cluster 1基因序列分析

采用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在線設計引物，擴增區域包括完整的BART cluster 1序列，在EBV標準株EBV-RefSeq（GenBank收錄號：NC_007605）中的位置為nt139087-140093[4]。引物及其序列見表1。采用巢式PCR對BART cluster 1序列分兩段進行擴增。外巢PCR擴增體系為20.0 μL，其中包括2×PCR 預混液（Taq Green PCR Master Mix，美國賽默飛世爾科技公司）10.0 μL，上下游引物各0.8 μL（0.4 μmol/L），DNA 模板2.0 μL（100 ng），去離子水6.4 μL。循環條件為：94 ℃預變性30? s；然后98 ℃變性10 s，55 ℃退火30? s，72 ℃延伸1 min，擴增35個循環；最后72 ℃延伸3 min。內巢PCR的反應體系為30 μL，包括：2×PCR預混液15.0 μL，上下游引物各1.2 μL（0.4 μmol/L），模板1 μL外巢PCR產物，去離子水11.6 μL；循環反應條件同外巢PCR。分別用EBV陽性細胞系Raji和EBV陰性細胞系HONE1提取的DNA作為PCR反應的陽性和陰性對照。

采用末端終止法對25 μL 內巢PCR產物進行雙向測序，測序由北京華大基因有限公司完成。用Chromas軟件查看測序峰圖文件，以EBV-RefSeq作為參比序列，采用Lasergene軟件（version 7.0）進行序列剪接和對排[16]。

1.3? 系統進化樹分析

采用MEGA 7.0軟件，將本研究所獲得的廣東地區和山東地區BART cluster 1序列用Clastal W方法進行比對，采用臨接法根據進化距離繪制系統進化樹[17]。

1.4? 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結? 果

2.1? BART miRNA cluster 1基因序列變異

本文296例樣本測序成功。與EBV-RefSeq比較，296條序列均出現單核苷酸突變，其中251條序列同時伴有插入和（或）缺失。插入和缺失主要位于3個位置。①nt139196-139209：EBV-RefSeq在此處形成14個單堿基G重復序列，標本序列在此處的堿基G數量為7～19個，從而形成插入或缺失，236條序列出現1～7個堿基G缺失，有5條出現插入。②nt139612-139613：248條序列在nt139612-139613之間插入1個堿基T，1條插入堿基C，1條插入堿基G。③nt140056-140062：EBV-RefSeq在此處形成7個單堿基T重復序列，標本序列在此處的堿基T數量為0～7個，共220條序列出現1～7個堿基T缺失。

本文296條序列的單核苷酸突變情況見圖1。由圖1可見，出現相同突變的序列以1例標本序列作為代表，共發現47條不同序列。共出現突變49處，其中≥2例樣本出現突變22處，A139600G、G139628A和T139650C見于所有樣本，A139654C見于295例樣本，G139196C、G139199T、G139200T和C139210A位于nt139196-139-209單堿基重復序列部位。根據其他部位出現的共有突變及系統進化樹對BART miRNA cluster 1序列變異進行分類，共分為4種變異型，命名為BART-A、-B、-C和-D，BART-B和-D又進一步分為2種亞型（BART-B1和-B2；BART-D1和-D2）。

本文研究20例樣本（6.8%）為BART-A變異型，其共有突變包含上述4處見于所有樣本的突變。BART-B變異型除上述4處突變外，還出現1處共有突變，為T139657G；另外4處突變T139684C、A139784G、C139946T和T140002G呈不同組合，其中包含共有突變T139657G和另外1處突變T139684C或T140002G的序列分類為BART-B1亞型，包含共有突變T139657G和另外4處突變中的2～4處突變的序列分類為BART-B2亞型（均出現C139946T突變），二者分別見于8例（2.7%）和33例（11.1%）樣本。BART-C變異型出現3處突變T139193G、T139882C和A139932C或其中2處突變，見于5例（1.7%）樣本。BART-D變異型除見于所有樣本的4處突變外，還含有2處共有突變A139441G和A139496G，其中又出現共有突變C139946T的序列分類為BART-D2亞型，其余為BART-D1亞型，二者分別見于124例（41.9%）和106例（35.8%）樣本。

2.2? 系統進化樹分析

以47條不同序列繪制系統進化樹，系統樹分為2大支，其中一支包含3個主要分支，分別對應3個變異型：BART-A、-B和-C；另外1支對應BART-D。BART-B和-D又分為不同分支，結合其突變特點分別分為2個亞型（圖2）。

2.3? BART miRNA cluster 1基因變異類型在廣東和山東地區標本中的分布

廣東地區NPC和健康人群中BART miRNA cluster 1變異型（亞型）的分布不同，主要表現為NPC以BART-D2亞型為主；而健康人群除BART-D2外，BART-B2和-D1的比率亦較高，BART-D2在NPC中的檢出率（86.1%，68/79）高于健康人群（44.1%，26/59），差異有顯著性（χ2=27.444，P<0.001）。見表2。

山東地區NPC和健康人群中BART miRNA cluster 1變異型的分布亦不同，主要表現為健康人群以BART-D1亞型為主；而NPC中除BART-D1外，BART-D2和-B2的比率亦相對較高，BART-D2在NPC中的檢出率（27.9%，29/104）高于健康人群（1.8%，1/54），差異有統計學意義（χ2=15.660，P<0.001）。見表2。

廣東和山東地區NPC人群間BART miRNA cluster 1變異類型的分布不同，其主要表現為廣東地區NPC主要為BART-D2亞型，而山東地區的BART-D1亞型相對較多，廣東地區NPC中BART-D2的檢出率高于山東地區NPC，差異具有顯著性左邊第1列和第2列分別為變異型和變異亞型的名稱；左邊第3列為標本名稱，綠色、紫色、黑色和紅色分別表示廣東NPC、廣東健康人群、山東NPC和山東健康人群，標本名稱后括號中數字表示與該標本序列單核苷酸突變相同的樣本例數；第1行數字和第2行字母分別表示發生突變的核苷酸在標準株EBV-RefSeq中的位置和序列，每一條標本序列僅顯示與標準株比較出現變異的核苷酸。圖中顯示的突變為在≥2例樣本中出現的突變，帶星號的序列表示其還含有僅在1例樣本中出現的其他突變。

（χ2=61.032，P<0.001）。廣東和山東地區健康人群之間BART miRNA cluster 1變異類型的分布亦不同，表現為山東地區健康人群主要為BART-D1亞型，而廣東地區健康人群中BART-D2和BART-B2檢出率高于山東地區健康人群，差異有顯著性（χ2=27.632、14.083，P<0.001）。見表2。BART-A、BART-C和BART-B1僅見于少數樣本，未表現出地區和人群分布差異。

47條不同序列分別以1例標本序列作代表，標本名稱后括號中數字表示與該標本序列單核苷酸突變相同的樣本數。

3? 討? 論

本研究首次對廣東和山東地區NPC和健康人群中EBV BART miRNA cluster 1序列進行了分析，結果顯示，與EBV標準株比較，所有樣本均出現變異，包括單核苷酸突變、插入和缺失。依據特征性突變和系統進化樹，BART miRNA cluster 1基因

可被分為6種變異型/亞型，對不同地區樣本的分

析表明，BART miRNA cluster 1基因變異存在地區差異。最主要的地區差異表現為BART-D1和BART-D2兩個變異亞型分布不同，BART-D2主要見于廣東地區，是NPC中的主要亞型，也是健康人群中檢出率最高的亞型；而BART-D1亞型主要見于山東地區，是健康人群中的主要亞型，也是NPC中檢出率最高的亞型。BART-D2在廣東地區NPC和健康人群中的檢出率均顯著高于山東地區，差異有顯著性。

BART-D2不僅與地域相關，也呈現疾病相關性。在廣東地區和山東地區NPC中的檢出率均顯著高于同一地區健康人群，提示BART-D2與NPC的發生相關。既往研究表明，同一個體不同樣本如癌組織、咽漱液和血液中多個EBV編碼基因的變異相同，提示其毒株來源相同[18-20]。因此，標本類型的差異不影響NPC腫瘤組織與健康人群咽漱液標本比較的結果。

本研究結果顯示，BART-D2在廣東和山東地區的分布特點與既往研究報道的EBER基因EB-8m變異型類似，EB-8m在廣東和山東地區NPC中的檢出率分別為82.0%（41/50）和33.7%（32/95），在健康人群中的檢出率則分別為32.4%（24/74）和1.1%（1/92）[21]。BART-D2亞型在廣東地區的分布特點與既往香港地區的NPC-EBERvar變異型和廣東地區BALF2基因的單核苷酸多態性（SNP）163364T類似，NPC-EBERvar在香港NPC和健康人群中的檢出率分別為96.8%（60/62）和 40.1%（57/142），SNP 163364T在廣東地區NPC人群和健康人群中的檢出率分別為84.98%（543/639）和45.71%（298/652）[22-23]。EB-8m、NPC-EBERvar及SNP 163364T均被報道在中國NPC高發區流行，且與NPC發病風險相關[21-24]。本文初步利用GenBank中已發表EBV基因組序列，對BART-D2與163364T做了關聯分析，結果顯示在同一基因組中BART-D2幾乎總是與163364T同時出現，它們之間存在連鎖不平衡，進一步提示BART-D2與NPC相關。

目前，有少數研究對BART miRNAs編碼區域的基因多態性進行了分析。KIM等[12]研究顯示，BART啟動子區域nt138557位點堿基G缺失可提高BART啟動子活性，且該缺失SNP即G138857在NPC來源的EBV基因組中的檢出率（83.10%）高于GC來源的EBV基因組（46.43%）。KIMURA 等[14]研究發現，在部分結外NK/T細胞淋巴瘤、慢性活動性EBV感染和彌漫性大B細胞淋巴瘤中存在BART區域不同程度的缺失。CORREIA等[13]比較了不同地域的EBV基因組中BART miRNA cluster 2序列，發現3種主要變異型，而且NPC高發區NPC來源的EBV毒株M81 BART miRNA cluster 2的突變可影響某些成熟miRNA的表達水平，推測BART miRNA cluster 2區域的變異可能通過影響miRNA的表達水平，進而影響miRNA的功能。M81毒株在BART miRNA cluster 1區域亦為BART-D2亞型，BART-D2對其編碼miRNA表達及功能的影響有待進一步研究。

綜上所述， BART miRNA cluster 1基因變異

既與地理位置相關，又存在疾病相關性，BART-D2變異型可能主要在我國NPC高發區流行，并且與NPC的發生相關。進行多地區和多疾病來源的大樣本流行病學研究以及功能學研究將有助于明確BART-D2基因變異在NPC發生中的作用。

［參考文獻］

[1]CHANG E， YE W， ZENG Y， et al. The evolving epidemiology of nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Epidemiology， Biomarkers & Prevention， 2021，30：1035-1047.

[2]SHAFIEE A， SHAMSI S， KOHANDEL GARGARI O， et al. EBV associated T- and NK-cell lymphoproliferative diseases： a comprehensive overview of clinical manifestations and novel therapeutic insights[J]. Reviews in Medical Virology， 2022，32（4）：e2328.

[3]SHANNON-LOWE C， RICKINSON A. The global landscape of EBV-associated tumors[J]. Frontiers in Oncology， 2019，9：713.

[4]FARRELL P J. Epstein-Barr virus strain variation[M]//MNZ C. Epstein Barr Virus Volume 1. Cham： Springer， 2015：45-69.

[5]NEVES M， MARINHO-DIAS J， RIBEIRO J， et al. Epstein-Barr virus strains and variations： geographic or disease-specific variants[J]？ Journal of Medical Virology， 2017，89（3）：373-387.

[6]BANKO A， MILJANOVIC D， LAZAREVIC I， et al. A systematic review of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） gene variants in nasopharyngeal carcinoma[J]. Pathogens （Basel， Switzerland）， 2021，10（8）：1057.

[7]XUE W Q， WANG T M， HUANG J W， et al. A comprehensive analysis of genetic diversity of EBV reveals potential high-risk subtypes associated with nasopharyngeal carcinoma in China[J]. Virus Evolution， 2021，7（1）： veab010.

[8]PFEFFER S， ZAVOLAN M， GRSSER F A， et al. Iden-

tification of virus-encoded microRNAs[J]. Science （New York， N Y）， 2004，304（5671）：734-736.

[9]IDOVEC LEPEJ S， MATULI M， GRKOVI P， et al. miRNAs：eBV mechanism for escaping hosts immune response and supporting tumorigenesis[J]. Pathogens （Basel， Switzerland）， 2020，9（5）：353.

[10]CAETANO B F R， JORGE B A S， MLLER-COAN B G， et al. Epstein-Barr virus microRNAs in the pathogenesis of human cancers[J]. Cancer Letters， 2021，499：14-23.

[11]WANG H Q， LIU W， LUO B. The roles of miRNAs and lncRNAs in Epstein-Barr virus associated epithelial cell tumors[J]. Virus Research， 2021， 291：198217.

[12]KIM H， BURASSAKARN A， KANG Y T， et al. A single nucleotide polymorphism in the BART promoter region of Epstein-Barr virus isolated from nasopharyngeal cancer cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2019，520（2）：373-378.

[13]CORREIA S， PALSER A， ELGUETA KARSTEGL C， et al. Natural variation of Epstein-Barr virus genes， proteins， and primary microRNA[J]. Journal of Virology， 2017，91（15）：e00375-e00317.

[14]KIMURA H， OKUNO Y， SATO Y， et al. Deletion of viral microRNAs in the oncogenesis of Epstein-Barr virus-associated lymphoma[J]. Frontiers in Microbiology， 2021，12：667968.

[15]王云. EB病毒相關腫瘤中病毒基因多態性研究[D]. 青島：青島大學， 2010：7-12.

[16]BURLAND T G. DNASTARs lasergene sequence analysis software[M]//Bioinformatics Methods and Protocols. New Jersey： Humana Press， 2003：71-91.

[17]KUMAR S， STECHER G， TAMURA K. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution， 2016，33（7）：1870-1874.

[18]NIE Y H， SUN Y J， WANG Y， et al. Epstein-Barr virus gene polymorphism in different parts of the same nasopharyngeal carcinoma patient[J]. Archives of Virology， 2013，158（5）：1031-1037.

[19]CHEN H L， LUNG M L， CHAN K H， et al. Tissue distribution of Epstein-Barr virus genotypes[J]. Journal of Virology， 1996，70（10）：7301-7305.

[20]KLEMENC P， MARIN J， SOBA E， et al. Distribution of Epstein-Barr virus genotypes in throat washings， sera， peripheral blood lymphocytes and in EBV positive tumor biopsies from Slovenian patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. Journal of Medical Virology， 2006，78（8）：1083-1090.

[21]SHEN Z C， LUO B， CHEN J N， et al. High prevalence of the EBER variant EB-8m in endemic nasopharyngeal carcinomas[J]. PLoS One， 2015，10（3）：e0121420.

[22]HUI K F， CHAN T F， YANG W L， et al. High risk Epstein-Barr virus variants characterized by distinct polymorphisms in the EBER locus are strongly associated with nasopharyngeal carcinoma[J]. International Journal of Cancer， 2019，144（12）：3031-3042.

[23]XU M， YAO Y Y， CHEN H， et al. Genome sequencing ana-

lysis identifies Epstein-Barr virus subtypes associated with high risk of nasopharyngeal carcinoma[J]. Nature Genetics， 2019，51（7）：1131-1136.

[24]LI Z， BACCIANTI F， DELECLUSE S， et al. The Epstein-Barr virus noncoding RNA EBER2 transactivates the UCHL1 deubiquitinase to accelerate cell growth[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2021，118（43）：e2115508118.

（本文編輯? 黃建鄉）