METTL5對肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制

彭修法 王蕊紅 王曄 劉鳳娟 張春玲

［收稿日期］2023-02-03;? ［修訂日期］2023-05-25

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82072927）

［第一作者］彭修法（1995-），男，碩士研究生。

［通信作者］張春玲（1966-），女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：qdzcl2011@163.com。

［摘要］? 目的

探討甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白5（METTL5）基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞遷移和侵襲功能的影響及潛在機(jī)制。

方法? 使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GEO）數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌及癌旁組織中METTL5的表達(dá)差異，采用Western blot方法檢測正常肺上皮BEAS-2B與肺腺癌A549、H1975細(xì)胞系中METTL5蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用LV3-METTL5-shRNA慢病毒感染肺腺癌A549和H1975細(xì)胞系以敲低其METTL5基因表達(dá)，Western blot法驗(yàn)證沉默效果。成功敲低METTL5基因后，通過TranswellTM實(shí)驗(yàn)檢測兩種細(xì)胞系遷移、侵襲能力，用Western blot法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)記物E-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。

結(jié)果? GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織METTL5的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且高表達(dá)的病人預(yù)后更差。METTL5在肺腺癌A549和H1975細(xì)胞中表達(dá)顯著高于正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞系。敲低METTL5后A549和H1975細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著降低，且間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)顯著下調(diào)，上皮標(biāo)記物E-Cadherin表達(dá)顯著上調(diào)。

結(jié)論? METTL5可能通過促進(jìn)EMT過程促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

［關(guān)鍵詞］? 肺腺癌；蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶類；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞運(yùn)動

［中圖分類號］? R734.2;R329.28

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2023）05-0645-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.163

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231128.1537.003;2023-11-30? 09：44：17

ROLE OF METTL5 IN MIGRATION AND INVASION OF LUNG ADENOCARCINOMA CELLS AND MECHANISMS

＼ PENG Xiufa， WANG Ruihong， WANG Ye， LIU Fengjuan， ZHANG Chunling

＼ （Department of Respiratory and Critical Care Medicine， The Affiliated Central Hospital of Qingdao University， Qingdao 266042， China）

＼; ［ABSTRACT］＼ Objective＼ To investigate the role of the methyltransferase-like protein 5 （METTL5） gene in the migration and invasion of lung adenocarcinoma cells and the potential mechanisms.

＼ Methods＼ METTL5 expression levels in lung adenocarcinoma and paracancerous tissues were compared through the Gene Expression Omnibus （GEO） database. METTL5 protein expression levels in normal lung epithelial cells （BEAS-2B） and lung adenocarcinoma cell lines （A549 and H1975） were determined by Western blot. A549 and H1975 cell lines were infected with the LV3-METTL5-shRNA lentivirus to knockdown the expression of the METTL5 gene， which was verified by Western blot for the silencing effects. After successfully knocking down the METTL5 gene， transwell assay was used to determine the migration and invasion abilities of the two cell lines. The expression of epithelial-mesenchymal transition markers （E-Cadherin and Vimentin proteins） was measured by Western blot.

＼ Results＼ The GEO analysis showed that the expression of METTL5 was significantly higher in lung adenocarcinoma tissues than in paracancerous tissues， and patients with high METTL5 expression had a significantly poorer prognosis. Lung adenocarcinoma A549 and H1975 cell lines had significantly higher METTL5 levels than the normal lung epithelial cell line BEAS-2B. After knocking down METTL5， A549 and H1975 cells showed significantly reduced migration and invasion abilities， significantly down-regulated expression of the mesenchymal marker Vimentin， and significantly up-regulated expression of the epithelial marker E-Cadherin.

＼ Conclusion＼ METTL5 can increase the migration and invasion of lung adenocarcinoma cells by promoting the process of epithelial-mesenchymal transition.

［KEY WORDS］＼ adenocarcinoma of lung; protein methyltransferases; epithelial-mesenchymal transition; cell movement

2021年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌位居全球癌癥相關(guān)死因之首，每年因肺癌死亡的人數(shù)達(dá)180萬，我國每年肺癌新發(fā)及死亡病人分別占全球的37.0%和39.8%[1-2]。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌兩種類型，其中NSCLC占總數(shù)的85%左右，NSCLC中又以肺腺癌最常見[3]。除常規(guī)的放療、化療以及手術(shù)治療等手段外，近年來靶向及免疫治療獲得長足發(fā)展，使肺腺癌病人生存有了明顯改善，但晚期病人5年總生存率仍不足20%[4]。因此，仍需繼續(xù)探究肺腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，近來作為研究熱點(diǎn)的m6A轉(zhuǎn)錄后修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-7]。我們前期生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，m6A相關(guān)修飾酶甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白5（METTL5）在肺腺癌組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與病人總生存率呈負(fù)相關(guān)。本研究旨在進(jìn)一步研究METTL5在肺腺癌中的可能作用，探討METTL5對肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制，從而為肺腺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

肺腺癌A549和H1975細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。無血清1640培養(yǎng)液（RPMI-1640）購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自Excell公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自索萊寶公司；青鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶溶液購自Hyclone公司；一步凍存液購自海星公司；2×蛋白上樣緩沖液（2×loading buffer）、電泳轉(zhuǎn)移緩沖液（即轉(zhuǎn)膜液）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）緩沖液、TBST緩沖液購自Solarbio公司；40 g/L多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液購自碧云天公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；Anti-human METTL5多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自武漢愛博泰克公司；兔抗人E-Cadherin、Vimentin、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；METTL5的干擾慢病毒購自上海吉瑪公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 生物信息學(xué)分析? 首先在基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GEO）數(shù)據(jù)庫中搜索肺腺癌數(shù)據(jù)，下載數(shù)據(jù)集，分析METTL5的表達(dá)情況。利用GEPIA軟件根據(jù)METTL5的表達(dá)差異對肺腺癌病人進(jìn)行生存分析，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.2.2? 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選? A549及H1975細(xì)胞系使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液（內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01的青鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右并處于對數(shù)生長期時，消化并重懸兩種細(xì)胞后接種于6孔板中，分別使用Control及LV3-METTL5-shRNA干擾慢病毒按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為Control組及shMETTL5組，72 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光。重新鋪板，加入嘌呤霉素使終質(zhì)量濃度為5 mg/L，篩選METTL5敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.3? Western blot法檢測? 取經(jīng)嘌呤霉素篩選后、鏡下可見熒光的兩組細(xì)胞，使用蛋白裂解液2×loading buffer裂解細(xì)胞提取蛋白樣品，并在95 ℃條件下金屬浴10 min使蛋白變性。吸取8 μL的樣品加入上樣孔中，140 V電泳60 min，200 mA轉(zhuǎn)膜90 min，用50 g/L脫脂牛奶進(jìn)行封閉。1 h后以TBST清洗PVDF膜3次，分別與一抗Anti-human METTL5多克隆抗體（1∶1 000）和Anti-human GAPDH單克隆抗體（1∶2 000）室溫孵育2 h。用TBST清洗3次后將PVDF膜放于HRP標(biāo)記的Anti-rabbit IgG二抗（1∶2 000）中孵育1 h。以TBST清洗后使用超敏發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.2.4? TranswellTM實(shí)驗(yàn)檢測? 在檢測遷移能力時，將處于對數(shù)生長期的Control組、shMETTL5組A549和H1975細(xì)胞消化并離心重懸，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞密度調(diào)至1×108/L，向上室中每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，并在下室中加入800 μL的RPMI-1640（含體積分?jǐn)?shù)0.20 FBS），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄上層液體，以PBS清洗2次，用棉簽拭去上室內(nèi)的細(xì)胞，將小室置于多聚甲醛固定液中固定20 min，棄去固定液。清洗后將小室置于1 g/L結(jié)晶紫染液中染色15 min，再次清洗并晾干，放于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。檢測侵襲能力時，先將Matrigel基質(zhì)膠與RPMI-1640培養(yǎng)液以1∶20均勻混合后，向上室內(nèi)每孔加入100 μL混合液，置于培養(yǎng)箱中過夜。其他條件同遷移能力檢測。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Western blot檢測所得的平均灰度值比值及TranswellTM實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞數(shù)均以x±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 生物信息學(xué)分析

對提取的GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中METTL5的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1A）。使用GEPIA繪制Kaplan-Meier曲線，分析結(jié)果顯示，METTL5表達(dá)水平高的病人具有更短的生存期（P<0.05）（圖1B）。

2.2? METTL5在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果表明，BEAS-2B、A549及H1975細(xì)胞中METTL5蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.53，P<0.05）。與BEAS-2B細(xì)胞相比，A549及H1975細(xì)胞中METTL5蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞中METTL5蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

A：METTL5在肺腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；B：METTL5表達(dá)與肺腺癌病人生存之間的關(guān)系。

A：3種細(xì)胞系中METTL5蛋白表達(dá)的Western blot檢測；B：3種細(xì)胞系METTL5蛋白相對表達(dá)量比較。

2.3? 敲低METTL5表達(dá)對肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

為研究METTL5在肺腺癌細(xì)胞中的作用，使用慢病毒敲低A549及H1975細(xì)胞中METTL5基因（圖3A）。Western blot檢測顯示，METTL5敲低后shMETTL5組兩種細(xì)胞METTL5蛋白表達(dá)水平較Control組顯著下調(diào)（t=8.403、4.222，P<0.05）（圖3B、C）。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，METTL5敲低后shMETTL5組兩種細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均較Control組明顯減少（t=7.803～14.430，P<0.05），表明METTL5顯著促進(jìn)A549、H1975細(xì)胞的遷移、侵襲（圖3D～G）。

2.4 ?敲低METTL5對肺腺癌細(xì)胞Vimentin和E-Cadherin表達(dá)的影響

本文Western blot檢測結(jié)果顯示，Control組和shMETTL5組兩種肺腺癌細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)差異具有顯著性（F=155.40，P<0.05）；與Control組相比，shMETTL5組兩種肺腺癌細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。Control組和shMETTL5組兩種肺腺癌細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)差異具有顯著性（F=73.75，P<0.05）；與Control組相比較，shMETTL5組兩種肺腺癌細(xì)胞的E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見圖4。

3? 討? 論

近年來隨著肺癌篩查手段、靶向及免疫治療的不斷進(jìn)步，肺癌病人的生存不斷改善，但肺癌病人死亡數(shù)仍高居惡性腫瘤死亡數(shù)之首，且轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的肺癌病人預(yù)后更差[8-9]。到目前為止，手術(shù)仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]。隨著分子生物學(xué)及靶向治療的發(fā)展，針對kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因（Kras）、表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROS1）等靶點(diǎn)突變及程序性死亡受體1（PD-1）/程A：慢病毒轉(zhuǎn)染后熒光效果圖；B：A549和H1975細(xì)胞的METTL5蛋白表達(dá)；C：慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞METTL5蛋白相對表達(dá)量；D：TranswellTM遷移實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證兩種肺腺癌細(xì)胞（A549、H1975）的遷移能力（結(jié)晶紫染色）；E：A549和H1975細(xì)胞遷移能力的半定量分析；F：TranswellTM侵襲實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證兩種肺腺癌細(xì)胞（A549和H1975）的侵襲能力（結(jié)晶紫染色）；G：A549和H1975細(xì)胞侵襲能力的半定量分析。

A：各組兩種細(xì)胞Vimentin和E-Cadherin蛋白表達(dá)的Western blot檢測；B：各組兩種細(xì)胞Vimentin和E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量比較。

序性死亡受體-配體1（PD-L1）通路的新型靶向藥物層出不窮，肺癌的治療取得了長足進(jìn)步[11-14]。但肺腺癌的靶向治療仍處于發(fā)展階段，因此尋找肺腺癌治療的新靶點(diǎn)具有重要意義。

m6A RNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾方式，是真核生物中最豐富的RNA修飾[15]。該修飾早在20世紀(jì)70年代就被發(fā)現(xiàn)，但其確切功能和調(diào)控機(jī)制在很大程度上仍然不清楚[6]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾在各種RNA中均豐富而保守，表明它能夠廣泛調(diào)控基因表達(dá)[16-17]。隨著研究的深入，m6A修飾在肺腺癌進(jìn)展中的作用及機(jī)制也逐漸被揭示。YIN等[18]發(fā)現(xiàn)，線粒體RNA核糖核酸內(nèi)切RNA組分（RMRP）在NSCLC中高表達(dá)，METTL3通過提高RMRP RNA的m6A水平增強(qiáng)其穩(wěn)定性，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（TGFBR1）/SMAD蛋白2（SMAD2）/SMAD蛋白3（SMAD3）途徑促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。因此，識別m6A相關(guān)基因、闡明它們在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制對于肺腺癌治療至關(guān)重要。

METTL5是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶家族中新發(fā)現(xiàn)的一個成員，與其他家族成員參與mRNA甲基化修飾不同，METTL5可以與tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶112（TRMT112）結(jié)合形成異二聚體以獲得代謝穩(wěn)定性，負(fù)責(zé)18S rRNA 1832位腺苷甲基化[19]。RONG等[20]應(yīng)用公開數(shù)據(jù)庫及乳癌樣本分析METTL5表達(dá)與乳癌病人生存之間的關(guān)系，結(jié)果顯示乳癌病人METTL5高表達(dá)與較差的生存之間存在顯著相關(guān)性。METTL5基因敲除的乳癌細(xì)胞中多聚核糖體形成減少，細(xì)胞整體翻譯能力減弱，細(xì)胞周期發(fā)生停滯，細(xì)胞凋亡增加，表明METTL5可促進(jìn)乳癌細(xì)胞生長。HUANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，METTL5可通過調(diào)節(jié)c-Myc水平提高胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力從而促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展。PENG等[22]的研究表明，METTL5通過靶向酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌（HCC）細(xì)胞從頭脂肪生成并導(dǎo)致游離脂肪酸水平增加，使HCC細(xì)胞發(fā)生代謝重編程而促進(jìn)HCC進(jìn)展。然而，METTL5在肺腺癌中發(fā)揮的作用仍不清楚。我們在前期生物信息學(xué)分析中，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌的差異表達(dá)mRNA進(jìn)行分析，篩選出與腫瘤分期相關(guān)樞紐基因METTL5，首次發(fā)現(xiàn)METTL5在肺腺癌組織中高表達(dá)并與肺腺癌病人的不良預(yù)后顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，METTL5在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞系，提示METTL5在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。為進(jìn)一步探究METTL5在肺腺癌中的作用，本研究使用shMETTL5慢病毒轉(zhuǎn)染肺腺癌A549和H1975細(xì)胞系，檢測肺腺癌細(xì)胞的行為。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shMETTL5的肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著降低，表明敲低METTL5基因能明顯抑制肺腺癌的進(jìn)展。

EMT過程與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，EMT發(fā)生時上皮細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂修D(zhuǎn)移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)并使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的治療抗性[23-24]。EMT過程中細(xì)胞發(fā)生了特征性的分子變化，具體表現(xiàn)為上皮標(biāo)記物E-Cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)上調(diào)[25-26]。本文研究結(jié)果顯示，敲低METTL5基因表達(dá)能夠顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的EMT，表明METTL5通過促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展。在后續(xù)研究中我們將探討METTL5促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的具體分子機(jī)制。

綜上所述，METTL5在肺腺癌中高表達(dá)，其表達(dá)水平與病人預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)；敲低METTL5基因表達(dá)可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲，其機(jī)制可能是METTL5促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，METTL5可能在肺腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，METTL5有望成為肺腺癌治療的潛在靶點(diǎn)及評估肺腺癌發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志物。

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（本文編輯? 馬偉平）

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