口蹄疫PCR檢測技術的建立

摘要：口蹄疫是我國比較多發的一類動物疫病，口蹄疫的檢測診斷是做好口蹄疫防控工作的關鍵。為了更好更快地檢測和診斷口蹄疫，本研究在口蹄疫血清3ABC檢測陽性的基礎上嘗試建立一種快速靈敏的PCR檢測技術。通過查詢基因序列、引物設計、引物合成、PCR反應條件摸索和優化、PCR擴增、凝膠電泳成像，最終在待測樣品中成功地擴增出A型口蹄疫病毒預期大小的條帶，可以快速檢測出A型口蹄疫病毒。O型和Asia I型因沒有陽性病原學樣品或標準毒株，未能擴增出相應的目的條帶。

關鍵詞：口蹄疫；檢測技術；聚合酶鏈式反應（PCR）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）引起的一種急性、烈性、水泡性病毒傳染病，主要感染牛、羊、豬等70多種偶蹄科動物，典型的臨床特征主要表現為機體發熱，口腔黏膜、唇部、蹄部及乳房皮膚出現爛斑或水皰性病理變化[1-3]。FMD被世界動物衛生組織（WOAH）和聯合國糧農組織（FAO）列為A類傳染病的首位。我國亦將FMD排在動物疫病病種名錄的第一位[4]。FMD的診斷技術從大的方面分為臨床診斷和實驗室診斷。單純的臨床診斷不能作為FMD確診的依據[5]。目前，檢測技術方法雖然層出不窮，但是，由于FMD血清型種類繁多和FMDV很容易發生變異，給本病診斷帶來一定困難。目前國內外有不少實驗室應用PCR技術進行FMD的診斷和檢測。PCR技術因其高度的敏感性、特異性，已得到越來越多的重視和應用。本研究借助現代分子生物學技術，嘗試建立一種快速靈敏的FMDV PCR檢測技術，通過引物設計、PCR反應條件摸索、產物分析等，成功建立了A型FMD的PCR快速診斷技術，為榆林市FMD的防控提供了有力的技術支撐。

1 試驗材料

1.1 試劑（表1）

1.2 儀器（表2）

1.3 病毒樣本

從榆林市12個縣市區的疫病監測樣品中隨機選取了FMD血清學陽性樣品8份，其中，牛血清3份，標號分別為B1、B6、B39；羊血清5份，標號分別為C34、C40、C42、C43、C74。

2 研究方法

2.1 引物設計與合成

在NCBI上下載11條A型FMDV基因全序列、6條O型FMDV基因全序列、6條Asia I型FMDV基因全序列，分別用MegAlign軟件進行基因序列同源性比對，選擇保守區域分型設計引物，引物合成由專業公司支持完成。引物信息見表3。

2.2 口蹄疫病毒RNA提取

將水浴鍋水溫調至56 ℃保溫，槍頭、EP管滅菌備用，使用制冰機制冰備用。嚴格按照 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0 試劑盒說明書進行操作。

2.3 反轉錄

1）在Microtube管中加入1 μL Random primers與模板RNA 5 μL 在70 ℃恒溫金屬浴中保溫10 min后迅速轉入冰上冷卻兩分鐘以上，再離心數秒使模板 RNA/引物的變性溶液聚集于 Microtube 管底部。

2）在上述的Microtube 管中配制下列反轉錄反應液。

上述模板 RNA/引物變性溶液 " " "6 μL

5×M-MLV Buffer " " " " " " " " " " " 2 μL

dNTP Mixture " " " " " " " " " " " " "0.5 μL

RNase Inhibitor " " " " " " " " " " " "0.5 μL

RTase "M-MLV " " " " " " " " " " " "0.5 μL

RNase free dH2O " " " " " " 補充至 10 μL

3）42 ℃ 保溫 1 h

4）70 ℃ 保溫 15 min后冰上冷卻，得到的 cDNA 溶液可直接用于PCR 擴增。

2.4 PCR擴增

反應體系為20 μL（無菌水6 μL、Taq酶10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板DNA 2 μL）。根據合成引物的參考退火溫度進行梯度PCR反應條件摸索和優化后，擴增反應程序如下：預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火37.5 ℃，30 s；延伸72 ℃ 45 s；重復“變性、退火、延伸”步驟達32個循環；最后72 ℃，5 min；4 ℃ 保存。

2.5 產物檢測

PCR反應結束，瓊脂糖凝膠電泳-EB替代物染色制膠塊，取 10 μL 擴增產物加樣于 1% 瓊脂糖凝膠孔內，以分子量為2000 bp 的 Maker（含6條參考條帶，大小分別為100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp）作為參照物，在 120 V 的電壓下電泳30 min，用凝膠成像儀觀察 PCR 產物在凝膠中的位置。

3 研究結果

3.1 A型、O型、Asia I 型反應結果

第一列為 DNA Maker，從第二列開始從左往右依次編號為 1～6，其中 1、2、3三個孔所加樣品為 C34；4、5、6 三個孔所加樣品為 C43；1、4 孔所加引物為 Asia I 型 FMDV 引物；2、6 孔所加引物為 O 型 FMDV 引物；3、5 孔所加引物為 A 型 FMDV 引物。結果如圖 1 所示。

由建立的反應體系檢測可以看出，3 和 5 泳道可以看到很明顯的 A 型 FMDV PCR 條帶，與預期大小相同，為553 bp。而 1 和 4 泳道以及 2 和 6 泳道看不到明顯的PCR反應條帶。

3.2 "A 型反應結果

加樣孔樣品編號從左往右依次為 C34、C43、B1、B6、C74、C40、C42、B39，各孔所加樣品均為已知FMD檢測的血清樣品。PCR 產物電泳結果顯示有 A 型 FMDV 對應的條帶出現，條帶大小為 553 bp，而 O 型和 Asia I 型沒有出現相應的條帶。結果如圖2 所示。

4 分析討論

FMD發病快、傳染性極強，及時準確的診斷才能有效防制FMD[6]。目前常規檢測口蹄疫的技術主要有動物接種、病毒分離和血清學試驗等方法，這些方法要求比較高，例如有的試驗需要的樣品是發病動物的新鮮水泡液或者水泡皮，采集樣品不方便[7]。這些方法中動物接種試驗需要幾天到幾周的時間周期太長、血清中和試驗需細胞培養耗時較長、熒光抗體試驗存在著非特異性反應和敏感性低等缺點。這些方法難于滿足實際的檢測需求。

FMDV除常見的7個血清型外，還有80多個亞型，亞型基因組差異較大，A、O、Asia I三種血清型的RNA序列同源性較高，經過檢測可以達到60%～70%。編碼結構蛋白的Pl區比編碼非結構蛋白的其它區域差異更大[8]。設計分型引物需要在VP1序列內，但是VP1片段在同一血清型的FMDV中差異也比較大，這就增加引物設計的難度，引物設計時考慮特異性的同時還要考慮到檢出率。本研究在充分比較同源性的基礎上，在血清型之間同源性低，血清型內同源性高的基因區段設計引物。經過篩選和調整，選取VP1基因區段設計引物，使引物具有更高的特異性和檢出率。

在我國境內曾發現和流行的FMDV基因型主要有A型、O型、Asia I型三種，其他基因型至今尚未被檢測出[9]。國內有些研究者建立的多重PCR檢測技術，可以將7種基因型的FMDV一次性分型檢測出[10]。但是存在不足之處，一方面引物設計很復雜難度較大，避免7個血清型的病毒之間的交叉免疫，另一方面經過多年來FMD病原學監測發現，目前國內主要感染A型、O型兩種基因型FMDV，Asia I型FMD經過多年來的綜合防控，已成功退出了動物強制免疫，實現了從免疫無疫到非免疫無疫的轉變，實施以監測撲殺為主的綜合防控措施，因此，7型多重PCR檢測技術已經不符合國內的實際需求。不論從當前我國依然存在的A型、O型FMD的實驗室診斷角度出發，還是從Asia I型的非免疫無疫狀態的監測角度出發，FMD的分子生物學快速檢測技術都具有明顯的實踐應用意義。本實驗建立的PCR快速檢測技術是針對國內實際情況和實際需求而建立的，相對比較簡單容易實施。

利用優化的反應條件進行PCR反應，出現A型引物擴增產物并且符合引物設計預期片段大小，而O型和Asia I型FMDV引物并沒有擴增出相應的片段。針對上述情況綜合分析，可能是由于一方面采集樣品的患病動物僅感染了A型FMDV；另一方面由于我們沒有O型和Asia I型的標準毒株樣品，不能確定本次試驗建立的O型和Asia I型FMDV PCR檢測方法是否切實可行，對于該試驗所建立的O型和Asia I型FMDV PCR檢測方法還有待下一步的研究中引入已知的陽性樣品或標準毒株進行進一步的試驗驗證。

5 結論

本研究在待測樣品中成功地擴增出A型FMDV預期大小條帶，而O型和Asia I型未擴增出相應的目的條帶。本研究所建立的FMDV PCR檢測方法具有特異性和敏感性，可以快速檢測出A型FMDV。

參考文獻：

[1] Esteban Domingo，Eric Baranowski，Cristina Escarmís，et al. Foot-and-mouth

disease virus[J]. Comparative Immunology， Microbiology and Infectious Diseases，2002，25（5）：297-308.

[2] Jamal M，Belsham Graham J. Foot-and-mouth disease： past， present and future [J]. Veterinary Research， 2013（44）：116.

[3] Yoon H， Yoon S S，Wee S H， et al. Clinical manifestations of foot-and-mouth disease during the 2010/2011 epidemic in the Republic of Korea [J]. Transboundary and Emerging Diseases， 2012， 59（6）：517-525.

[4] 王鑫.陜西省渭南地區豬口蹄疫流行病學調查[D].西北農林科技大學，2010.

[5] 林密.口蹄疫等動物疫病診斷技術研究進展[J].獸醫導刊，2018 （15）： 8-11.

[6] 薛先明.豬口蹄疫的診斷及其綜合防控[J].當代畜牧，2015 （17）： 67-68.

[7] 周卓燦.?？谔阋呙庖咝Чu估[D].湖南農業大學，2016.

[8] 劉亞麗.南非型口蹄疫病毒常規RT-PCR檢測方法的建立[D].中國農業科學院，2016.

[9] 陳冬冬.口蹄疫病毒VP3定點突變體的構建及其生物學特性和免疫血清學研究[D].中國農業科學院，2018.

[10] 邱楊，肖性龍，趙麗，等.多重熒光RT-PCR同時檢測口蹄疫O A Asia Ⅰ三種血清型[J].中國獸醫雜志，2010，46（06）： 9-11.