電針對重癥肌無力大鼠癥狀及CD4＋/CD8＋、AChR-Ab水平的影響

摘要 目的：探討電針對重癥肌無力（MG）大鼠癥狀及CD4＋/CD8＋、乙酰膽堿受體抗體（AChR-Ab）水平的影響。方法：隨機選擇10只無特定病原體（SPF）級雌性Lewis大鼠作為對照組，剩余大鼠均通過免疫接種法構(gòu)建實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）模型，成模大鼠隨機分為模型組、電針組及潑尼松組，每組10只，其中電針組大鼠每日于陽陵泉、足三里、脾俞穴位處行電針刺激，潑尼松組大鼠灌服潑尼松5.4 mg/（kg·d），對照組、模型組及潑尼松組大鼠每日于非穴位處行電針刺激，連續(xù)15 d。記錄治療前后各組大鼠體質(zhì)量；采用Lennon評分評估大鼠肌力情況；采用肌電圖檢測重復(fù)電刺激（RNS）衰減率；測定胸腺指數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測大鼠血清AChR-Ab、γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）水平；采用流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD4＋/CD8＋比值變化情況。結(jié)果：治療前，模型組、電針組及潑尼松組體質(zhì)量低于對照組，臨床Lennon評分、RNS衰減率及血清AChR-Ab水平高于對照組（P＜0.05），模型組、電針組及潑尼松組體質(zhì)量、臨床Lennon評分、RNS衰減率及血清AChR-Ab水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，與對照組比較，模型組、電針組及潑尼松組大鼠體質(zhì)量降低，臨床Lennon評分、RNS衰減率及血清AChR-Ab水平升高，胸腺指數(shù)、血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平、CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值升高，血清TGF-β1水平及CD8＋T細胞占比降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及潑尼松組體質(zhì)量、血清TGF-β1水平及外周血CD8＋T細胞占比升高，臨床Lennon評分、RNS衰減率及胸腺指數(shù)、血清AChR-Ab、IFN-γ、IL-4、IL-6水平、外周血CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值降低（P＜0.05）；電針組作用效果弱于潑尼松組（P＜0.05）。結(jié)論：電針刺激可改善EAMG大鼠臨床癥狀，其作用機制可能與促進免疫平衡恢復(fù)，降低AChR-Ab水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞" 重癥肌無力；電針；CD4＋/CD8＋；乙酰膽堿受體抗體；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.014

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種典型神經(jīng)免疫性疾病，由靶向在神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ）的突觸后膜表達的蛋白質(zhì)抗體引起，臨床以易疲勞和肢體無力為特征［1-2］。目前，重癥肌無力主要治療方法包括膽堿酯酶抑制劑、胸腺切除術(shù)、免疫抑制劑和通過血漿交換和靜脈注射免疫球蛋白用于短期免疫調(diào)節(jié)，然而，這些治療方法只會產(chǎn)生暫時的效果，耗時且費用高昂，免疫抑制治療也會產(chǎn)生嚴重副作用［3］。針灸是我國廣泛使用的傳統(tǒng)療法之一，電針為現(xiàn)代版針灸，免疫反應(yīng)及細胞因子調(diào)節(jié)為其重要作用機制［4］。研究發(fā)現(xiàn)，電針可通過維持不同免疫細胞平衡來改善神經(jīng)免疫性相關(guān)疾病［5］。故本研究擬通過構(gòu)建實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）大鼠模型，探討電針對重癥肌無力癥狀的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級6周齡雌性Lewis大鼠45只，體質(zhì)量為（130±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0011。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 大鼠乙酰膽堿受體-α亞基97-116肽段序列（R97-116）購自上海吉爾生化有限公司；潑尼松（國藥準字H33021207）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；H37Ra干粉購自上海康朗生物科技有限公司；大鼠白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海樊克生物科技有限公司；大鼠乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記CD4單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標記CD8單克隆抗體、別藻藍蛋白（APC）標記CD3單克隆抗體均購自美國eBiscience公司；低頻脈沖電針治療儀購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；全自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 大鼠于室溫為（22±2）℃，在相對濕度為50%～70%的環(huán)境下普通飼養(yǎng)，12 h光照/12 h黑暗交替，適應(yīng)1周后，稱重，隨機選取10只作為對照組，剩余35只用于構(gòu)建EAMG模型并進行成模評估［6］，造模第1天，將與弗氏完全佐劑充分混勻的200 μL乳劑（含50 μg的Rα97-116、1 mg的H37Ra干粉）多點皮下注射于大鼠肩背部、尾基部、足墊部，對照組注射等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）與弗氏完全佐劑的混乳劑；第30天和第45天，將與弗氏不完全佐劑充分混勻的乳劑200 μL（含50 μg 的Rα97-116）于相同部位注射加強免疫，對照組注射等量PBS與弗氏不完全佐劑的混乳劑。3次免疫后2周，采用Lennon評分、血清AChR-Ab含量和肌電圖對造模組大鼠進行模型評估。Lennon評分＞1分，血清AChR-Ab檢測為陽性，重復(fù)電刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）衰減率＞10%視為成功造模。成功造模32只大鼠，隨機剔除2只，剩余30只大鼠隨機分為模型組、電針組及潑尼松組，每組10只。

1.2.2 電針刺激及給藥 電針組電針干預(yù)：將大鼠固定在木板上，剃除穴位處被毛，將不銹鋼針（直徑0.30 mm，長13 mm）插入雙側(cè)陽陵泉穴（腓頭小骨下方外側(cè)5 mm處）4～6 mm深度、足三里穴（脛骨前結(jié)節(jié)點外側(cè)4 mm處）6～7 mm深度、脾俞穴（第12胸椎下旁開5 mm處）4～6 mm深度，連接脈沖電針儀，頻率設(shè)為5 Hz，電流強度為1 mA，持續(xù)30 min。對照組、模型組及潑尼松組均給予非穴位點電針干預(yù)，其中潑尼松組灌服潑尼松5.4 mg/（kg·d），電針組、對照組及模型組均灌服等量生理鹽水，連續(xù)15 d。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 體質(zhì)量 記錄治療前、后大鼠體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 肌力評估 治療前后采用臨床Lennon評分標準［7］評估大鼠肌力，Lennon評分標準：0分為無明顯無力表現(xiàn)；1分為爬動無力或叫聲減少；2分為明顯無力，前肢屈曲，躬背低頭，被捉時掙扎；3分為嚴重全身無力，沒有叫聲或爬動，呈瀕死狀態(tài)；4分為死亡；介于癥狀之間計為0.5分。

1.3.3 RNS衰減率 肌電圖檢測治療前后低頻RNS衰減率，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠并固定在BL-420S生物機能系統(tǒng)上，將刺激電極插入坐骨神經(jīng)附近的腓腸肌，參考電極插入腹部皮下組織，另將2個記錄電極插入同側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、跟腱附著處。所有電極均接受10次5 Hz電刺激。RNS衰減率（%）＝（第1個動作電位－第5個動作電位）/第1動作電位×100%。

1.3.4 血清AChR-Ab水平 給藥前，各組大鼠尾靜脈取血，靜置30 min，4 ℃條件下以3 000 r/min速率離心20 min，收集血清并保存于－20 ℃冰箱；治療后，尾靜脈采血并同治療前操作收集血清，ELISA法檢測治療前后血清AChR-Ab水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行測定。

1.3.5 血清IFN-γ、IL-4、IL-6和TGF-β1水平 收集治療后各組大鼠尾靜脈血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟測定血清IFN-γ、IL-4、IL-6和TGF-β1水平。

1.3.6 免疫器官指數(shù) 收集胸腺組織，稱重，胸腺指數(shù)（mg/g）＝胸腺重量/體質(zhì)量。

1.3.7 外周血T淋巴細胞亞群CD4＋/CD8＋比值 治療結(jié)束后，于大鼠麻醉狀態(tài)下采集腹主動脈外周血并抗凝。取100 μL血液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，100 μL的PBS重懸細胞，分別加入熒光標記的一抗（CD3、CD4、CD8單克隆抗大鼠抗體）1 μL，室溫避光孵育40 min，加入2 mL溶血素，室溫避光孵育10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次；后利用PBS重懸細胞后上BD FACSCalibur流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組治療前后大鼠體質(zhì)量變化 治療前，模型組、電針組及潑尼松組大鼠體質(zhì)量較對照組降低（P＜0.05），且模型組、電針組及潑尼松組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，各組治療后體質(zhì)量均升高（P＜0.05）。治療后，模型組、電針組及潑尼松組大鼠體質(zhì)量均較對照組降低（P＜0.05）；電針組及潑尼松組大鼠體質(zhì)量均較模型組升高（P＜0.05），且潑尼松組體質(zhì)量較電針組升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組治療前后臨床Lennon評分比較 治療前，模型組、電針組及潑尼松組大鼠臨床Lennon評分高于對照組（P＜0.05），模型組、電針組及潑尼松組大鼠臨床Lennon評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，模型組治療后臨床Lennon評分升高（P＜0.05），電針組及潑尼松組治療后臨床Lennon評分降低（P＜0.05）。治療后，模型組、電針組及潑尼松組臨床Lennon評分均高于對照組（P＜0.05）；電針組及潑尼松組臨床Lennon評分均低于模型組（P＜0.05），且潑尼松組臨床Lennon評分低于電針組（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組治療前后低頻RNS衰減率比較 治療前，模型組、電針組及潑尼松組低頻RNS衰減率高于對照組（P＜0.05），模型組、電針組及潑尼松組低頻RNS衰減率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，電針組及潑尼松組治療后低頻RNS衰減率均降低（P＜0.05）。治療后，模型組、電針組及潑尼松組低頻RNS衰減率均高于對照組（P＜0.05）；電針組及潑尼松組低頻RNS衰減率均低于模型組（P＜0.05），且潑尼松組低頻RNS衰減率低于電針組（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 各組治療前后血清AChR-Ab水平比較 治療前，模型組、電針組及潑尼松組血清AChR-Ab水平高于對照組（P＜0.05），模型組、電針組及潑尼松組血清AChR-Ab水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，電針組及潑尼松組治療后血清AChR-Ab水平均降低（P＜0.05）。治療后，模型組、電針組及潑尼松組血清AChR-Ab水平均高于對照組（P＜0.05）；電針組及潑尼松組血清AChR-Ab水平均低于模型組（P＜0.05），且潑尼松組血清AChR-Ab水平低于電針組（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 各組血清IFN-γ、IL-4、IL-6和TGF-β1水平比較 與對照組比較，模型組、電針組及潑尼松組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平升高，TGF-β1水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及潑尼松組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平降低，TGF-β1水平升高（P＜0.05）；與電針組比較，潑尼松組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6水平降低，TGF-β1水平升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 各組大鼠胸腺指數(shù)比較 與對照組比較，模型組、電針組及潑尼松組大鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及潑尼松組大鼠胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）；與電針組比較，潑尼松組大鼠胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）。詳見表6。

2.7 各組大鼠CD4＋T細胞、CD8＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值比較 與對照組比較，模型組、電針組及潑尼松組大鼠CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值升高，CD8＋T細胞占比降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組及潑尼松組大鼠CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值降低（P＜0.05），CD8＋T細胞占比升高（P＜0.05）；與電針組比較，潑尼松組大鼠CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值降低（P＜0.05），CD8＋T細胞占比升高（P＜0.05）。詳見圖1、表7。

3 討 論

重癥肌無力是一種主要由AChR-Ab介導(dǎo)、依賴于T細胞的自身免疫性疾病［8］，AChR-Ab可通過與AChR結(jié)合并使AChR內(nèi)吞或降解，阻斷AChR與乙酰膽堿結(jié)合，激活補體形成膜攻擊復(fù)合物破壞神經(jīng)肌肉連接（NMJ）突觸后膜，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)傳遞障礙［9］。EAMG大鼠為廣泛使用的人類重癥肌無力動物模型，該模型與重癥肌無力具有相似的臨床和病理生理學(xué)相關(guān)性，可通過明顯體重下降提示疾病進程［1］，以肌力減少、血清AChR-Ab含量升高、RNS衰減率升高為成功建模標準，其中RNS衰減10%或更多提示神經(jīng)肌肉傳遞功能障礙［6］。本研究經(jīng)皮下接種合成的大鼠R97-116肽并加強免疫后發(fā)現(xiàn)模型大鼠體重減輕、肌力減弱、血清AChR-Ab含量及RNS衰減率升高（＞10%），提示成功構(gòu)建EAMG大鼠模型。

與西藥相比，中藥和針灸治療重癥肌無力具有不良反應(yīng)少、療效顯著的優(yōu)勢，與中藥治療相比，針灸更為方便，療效更好［10］。研究發(fā)現(xiàn)，針灸在一定程度上可通過增加乙酰膽堿電位和小終板電位幅度改善眼部重癥肌無力癥狀，或通過改變神經(jīng)肌肉連接突觸后膜上乙酰膽堿受體（AchR）和乙酰膽堿（Ach）或AchR-Ab之間的親和力來達到治療效果［11-12］。脾腎虛損是貫穿重癥肌無力病程始終的基本病機［13］，本研究中電針組以補益脾腎為治則選穴陽陵泉、足三里及脾俞，結(jié)果顯示，經(jīng)電針刺激穴位可有效增強EAMG大鼠肌力、降低血清AChR-Ab含量及RNS衰減率，提示電針治療可能通過抗AChR-Ab而改善神經(jīng)肌肉傳遞障礙，進而減輕EAMG大鼠疾病嚴重程度。大多數(shù)AChR-重癥肌無力病人可觀察到胸腺病理改變，胸腺是重癥肌無力發(fā)病機制中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器官，揭示了重癥肌無力亞型的異常，在早發(fā)病人中，胸腺通常會增大，具有濾泡結(jié)構(gòu)的胸腺增生經(jīng)常伴隨AChR-重癥肌無力［14］，另研究發(fā)現(xiàn)，與其相關(guān)的胸腺瘤可產(chǎn)生和輸出大量CD4＋/CD8＋T細胞，刺激自身抗體產(chǎn)生，并與重癥肌無力進展有關(guān)［15］，本研究中模型大鼠胸腺指數(shù)升高，治療后明顯胸腺指數(shù)及血清AChR-Ab降低，提示電針可能通過作用胸腺調(diào)節(jié)免疫T細胞平衡，減少與EAMG相關(guān)的AChR-Ab含量進而減輕EAMG癥狀。

重癥肌無力發(fā)病機制由體液免疫及細胞免疫介導(dǎo)［16］，CD4＋和CD8＋T細胞在其中協(xié)同維持細胞免疫功能，CD4＋可以增強B細胞分化產(chǎn)生抗體，而CD8＋可以減少T細胞分化和抗體產(chǎn)生［17］，CD4＋/CD8＋比值可作為免疫調(diào)節(jié)的重要指標，對于AChR-Ab的產(chǎn)生具有重要調(diào)節(jié)作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，CD4＋輔助T淋巴細胞在重癥肌無力中升高，且與更高的AChR-Ab滴度相關(guān)［19］，據(jù)報道，CD4＋輔助T細胞包括Th1、Th2和Th17亞群，Th1細胞分泌的IFN-γ可增加并增強重癥肌無力的嚴重程度，Th2細胞分泌的IL-4和IL-6可誘導(dǎo)B細胞分化，TGF-β為重癥肌無力的負性調(diào)節(jié)因素，可抑制ACh特異性T細胞和B細胞的增殖，抑制IFN-γ生成［20］。Huan等［21］研究發(fā)現(xiàn)，重癥肌無力危及病人表現(xiàn)出促炎性CD4＋T反應(yīng)，細胞因子級聯(lián)反應(yīng)中IFN-γ、IL-4、IL-6水平升高，在促進自身抗體產(chǎn)生的同時，促使機體呈炎性狀態(tài)發(fā)展，TGF-β可通過下調(diào)過度的免疫和炎癥反應(yīng)減輕神經(jīng)免疫性疾病進展［22］。本研究結(jié)果顯示，電針治療可顯著降低EAMG大鼠外周血CD4＋T細胞占比及CD4＋/CD8＋比值，提高CD8＋T細胞占比，且降低血清中IFN-γ、IL-4、IL-6水平，升高TGF-β水平，提示電針可能通過平衡CD4＋與CD8＋比值，改善免疫功能紊亂及機體異常炎性狀態(tài)，恢復(fù)機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定進而降低自身抗體AChR-Ab生成，減輕肌肉傳遞障礙進而發(fā)揮促EAMG大鼠癥狀改善作用。

綜上所述，電針刺激治療可有效改善EAMG大鼠癥狀，其作用機制可能與促進免疫失衡恢復(fù)，降低自身抗體生成有關(guān)，為重癥肌無力治療選擇提供一定參考。

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（收稿日期：2022-03-29）

（本文編輯郭懷印）