綠茶提取物介導Rho/ROCK通路緩解腦梗死大鼠腦組織損傷的實驗研究

摘要 目的：探討綠茶提取物對Ras同源基因（Rho）/Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶（ROCK）通路的調控作用及對腦梗死大鼠腦損傷的影響，初步探討其作用機制。方法：用線栓法復制大鼠腦梗死模型，并隨機分為假手術組、模型組、綠茶提取物組（200 mg/kg）、Rho抑制劑組（給予鹽酸法舒地爾15 mg/kg）、Rho激動劑組（給予溶血性磷脂酸50 mmol/kg）、聯合組（綠茶提取物＋Rho激動劑），每組18只。給藥結束后，觀察大鼠行為變化；氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察腦梗死狀況；尼氏及脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的黏性末端標記（TUNEL）染色法觀察神經元損傷及凋亡情況；鬼筆環肽染色觀察神經元細胞骨架變化；透射電鏡下觀察神經突觸結構變化；免疫組化法觀察Rho陽性表達水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測Rho/ROCK通路蛋白、促神經生長因子［神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、神經營養因子3（NT3）］、神經生長抑制因子［軸突生長抑制因子（NogoA）、髓鞘相關蛋白（MAG）、切絲蛋白（cofilin）］、突觸再生重塑相關蛋白［突觸后致密物質（PSD-95）、突觸素（SYP）等］蛋白表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積均增加，腦皮層神經元損傷和凋亡、突觸小泡破裂融合等結構損傷及細胞骨架破壞嚴重，Rho/ROCK通路活化，及其介導的促神經生長因子表達降低，而神經抑制因子表達升高（P＜0.05）。綠茶提取物及Rho抑制劑均可減輕腦皮層神經元損傷和凋亡、突觸小泡破裂融合等結構損傷及細胞骨架破壞等病理損傷，降低神經功能缺損評分及腦梗死體積，抑制Rho/ROCK通路活化和神經抑制因子表達，促進促神經生長因子表達（P＜0.05）。Rho激動劑可逆轉綠茶提取物的上述作用（P＜0.05）。結論：綠茶提取物可抑制Rho/ROCK活化，促進腦梗死后神經元及突觸的再生及重塑，改善神經功能損傷，發揮腦保護作用。

關鍵詞 腦梗死；綠茶提取物；肉瘤同源基因A；Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶通路；腦損傷；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.016

Abstract Objective：To investigate the regulatory effect of green tea extract on Ras homologous gene（Rho）/Rho-related coiled protein kinase（ROCK） pathway，and its effect on brain injury in rats with cerebral infarction，and to preliminarily explore its mechanism.Methods：The rats were taken to establish the rat cerebral infarction model by suture method，and randomly divided into sham operation group，model group，green tea extract group（200 mg/kg）， Rho inhibitor group（fasudil hydrochloride，15 mg/kg），Rho agonist group（lysophosphatidic acid， 50 mmol/kg），combined group （green tea extract＋Rho agonist）， with 18 rats in each group.After the administration，the behavioral changes of the rats were observed.Triphenyl tetrazolium chloride（TTC） staining was used to observe the status of cerebral infarction.Nissl and terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling（TUNEL） staining methods were used to observe neuronal injury and apoptosis.Phalloidin staining was used to observe changes in neuron cytoskeleton.Transmission electron microscope was used to observe the changes of nerve synapse structure.Immunohistochemistry was used to observe the positive expression level of Rho.Western Blot method was used to detect the expression of Rho/ROCK pathway proteins，nerve growth promoting factor［nerve growth factor（NGF），brain-derived neurotrophic factor（BDNF），neurotrophic factor 3（NT3）］，nerve growth inhibitor［neurite growth inhibitory factor（NogoA），myelin-associated protein（MAG），cofilin］，synaptic regeneration remodeling-associated protein［post-synaptic dense substance（PSD-95） and synaptophysin（SYP）］ and other proteins.Results：Compared with sham operation group，the neurological deficit score and cerebral infarction volume of model group increased，the structural damage such as neuronal damage， apoptosis，synaptic vesicle rupture，and fusion in the cerebral cortex，and the destruction of the cytoskeleton were serious，the Rho/ROCK pathway was activated，and the expression of NGF mediated by it decreased，while the expression of nerve inhibitory factor increased（P＜0.05）.Both green tea extract and Rho inhibitor could alleviate structural damage such as neuronal damage，apoptosis，synaptic vesicle rupture and fusion，and pathological damage such as cytoskeleton destruction，reduce neurological deficit score and cerebral infarction volume，inhibit the Rho/ROCK pathway activation and neuro suppressive factor expression，and promote the expression of NGF（P＜0.05）.Rho agonists could reverse the above effects of green tea extract（P＜0.05）.Conclusion：Green tea extract can inhibit the activation of Rho/ROCK to promote the regeneration and remodeling of neurons and synapses after cerebral infarction，improve nerve function damage，and play a protective effect on the brain.

Keywords" cerebral infarction; green tea extract; sarcoma homologous gene A; Rho-associated helical coiled protein kinase pathway; brain injury; experimental research

腦梗死即缺血性腦卒中，多發生于老人［1］。腦缺血損傷及梗死后，腦神經元細胞凋亡及損傷是導致腦梗死病人腦功能減退、偏癱甚至死亡的重要原因［2］。大量研究發現，腦損傷后多種細胞因子及炎癥遞質均可激活Ras同源基因（Ras homologous gene，Rho）發生膜轉位，并激活效應分子Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶（Rho-associated helical coiled protein kinase，ROCK）磷酸化激活，阻斷神經細胞損傷后再生［3］。故調控Rho/ROCK通路活化，可能對緩解腦梗死后神經損傷及凋亡有重要意義。

綠茶提取物中含茶氨酸、茶多酚、生物堿等多種生物活性成分［4］，近年來的研究發現，綠茶提取物中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等兒茶素類單體活性成分，可改善神經元細胞應激性損傷［5］，預示綠茶提取物可能為緩解腦梗死后腦神經元損傷的潛在藥物。本研究建立大鼠腦梗死模型，探討綠茶提取物對Rho/Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶（ROCK）通路的調控作用及對腦梗死大鼠腦損傷的影響，初步探討其作用機制，以期為腦梗死的治療及綠茶提取物的開發與應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD雄性7周齡大鼠，健康、清潔級，體質量200～220 g，購自溫州醫科大學，生產許可證號為SCXK（浙）2020-0001。試驗動物按照《實驗動物管理條例要求》進行處理且符合3R原則，經本院動物倫理委員會批準同意（批號：2020-09-0025）。

綠茶提取物（貨號：Z0151，上海遠慕生物科技有限公司生產，含兒茶素90%，純度98%）；Rho抑制劑鹽酸法舒地爾（貨號：30002844，深圳海思安生物技術有限公司生產）；Rho激動劑溶血性磷脂酸（貨號：SYT-3302，美國Sigma公司生產）；氯化三苯基四氮唑（TTC）及尼氏染液（貨號：FT-PZ15258、FT20624yy，上海梵態生物科技有限公司生產）；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的黏性末端標記（TUNEL）染色液（貨號：FK-MB793J，上海延慕實業有限公司生產）；鬼筆環肽染色液（貨號：CA1610，上海吉至生化科技有限公司生產）；Rho、ROCK、神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、神經營養因子3（NT3）、軸突生長抑制因子（NogoA）、髓鞘相關蛋白（MAG）、突觸后致密物質（PSD-95）、突觸素（SYP）、切絲蛋白（cofilin）、磷酸化cofilin（p-cofilin）等抗體均購自美國Abcam公司；LSM9共聚焦顯微鏡購自卡爾蔡司上海公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 參照文獻［6］用線栓法（結扎右側頸外動脈，尼龍漁線從頸外動脈開口處插入頸內動脈20 mm，阻塞大腦血流）制備腦梗死模型。術后1周，若大鼠出現行走轉圈及行走困難現象，隨機取2只，用TTC染色法檢測腦組織，若出現染色為白色的梗死組織，視為造模成功（共90只），隨機分為模型組、綠茶提取物組、Rho激動劑組（給予溶血性磷脂酸50 mmol/kg）、聯合組（綠茶提取物＋Rho激動劑）、Rho抑制劑組（給予鹽酸法舒地爾15 mg/kg），每組18只。另取18只大鼠，只暴露右側頸外動脈及頸內動脈，不進行結扎及穿線，作為假手術組。

綠茶提取物組參照文獻［7］設置劑量為200 mg/kg，用生理鹽水稀釋成20 mg/mL濃度，以10 mL/kg劑量灌胃給藥，每日1次；Rho激動劑及抑制劑組分別參照文獻［8-9］設置劑量為50 mmol/kg及15 mg/kg，用生理鹽水稀釋成濃度為5 mmol/mL及1.5 mg/mL的混懸液，以10 mL/kg劑量經尾靜脈注射，每周2次；聯合組灌胃給予綠茶提取物的同時，經尾靜脈注射給予Rho激動劑；模型組及假手術組灌胃并經尾靜脈注射生理鹽水，各組連續給藥4周。末次給藥結束后，觀察大鼠行為變化，并進行后續處理。

1.2.2 神經功能缺損情況 末次給藥結束后，參照文獻［10］采用改良神經功能評分（modified neurological severity score，mNSS）評定大鼠神經缺損情況，總分為18分，評分越高提示神經損傷越嚴重。

1.2.3 TTC染色觀察腦梗死狀況 每組隨機取6只大鼠，處死，取完整腦組織，－20 ℃冰凍20 min后，進行冠狀切片（厚度為2 mm），取切片按TTC染色液說明書方法染色后，用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。

1.2.4 透射電鏡觀察腦皮層組織神經突觸結構變化 再隨機取6只大鼠，麻醉處死，取梗死側腦組織，冰上剝離完整腦皮層組織，剪取1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，送電鏡室處理后，于5 000倍電鏡下觀察神經元突觸結構變化。剩余組織制成厚度為20 μm的冰凍切片，備用。

1.2.5 尼氏及TUNEL染色法觀察腦皮層神經元損傷及凋亡 取相同部位腦皮層組織冰凍切片，按尼氏及TUNEL染色液說明書方法染色后，于光鏡下觀察神經元形態變化，TUNEL染色切片用Image Pro Plus 6.0 軟件計算神經元凋亡率，神經元凋亡率＝凋亡神經元（染成棕黃色神經元）/總神經元×100%。

1.2.6 鬼筆環肽染色觀察神經元細胞骨架變化 取相同部位腦皮層組織冰凍切片，復溫、抗原修復及曲拉通透化后，按細胞骨架纖維狀肌動蛋白（F-actin）特異性的染料（鬼筆環肽）染色液說明書染色后，用激光共聚焦顯微鏡及Image Pro Plus 6.0 軟件觀察并計算F-actin陽性染色的細胞數目。

1.2.7 免疫組化法測Rho陽性表達情況 取相同部位腦皮層組織冰凍切片，經復溫、透化及抗原滅活后，加入1∶200的Rho一抗，4 ℃孵育過夜，滴加1∶500的羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）顯色、蘇木精復染、封片，光鏡下拍照，Image Pro Plus 6.0系統分析陽性表達的平均光密度值。

1.2.8 免疫蛋白印跡法（Western Blot）檢測Rho/ROCK通路及相關蛋白表達 剩余大鼠麻醉后處死，取梗死側腦皮層組織，勻漿器機械勻漿及蛋白裂解液裂解后，提取蛋白及二喹啉甲酸（BCA）法測濃度后，取100 μg蛋白行電泳和轉膜反應，滴加1∶900稀釋濃度的Rho、ROCK、NGF、BDNF、NT3、NogoA、MAG、p-cofilin、cofilin、PSD-95、SYP等兔抗抗體及1∶3 000稀釋濃度的內參β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，室溫孵育辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔二抗（1∶3 000）3 h，發光底物法顯影曝光后拍照，以Image-J軟件分析蛋白條帶的相對灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較及組間多重比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 綠茶提取物對大鼠行為變化及mNSS評分的影響 假手術組大鼠飲食活動正常，活動靈敏。與假手術組比較，模型組大鼠活動量減少，行走時向一側轉圈、跛行、行動困難等行為增多，mNSS評分升高（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠跛行、行走向一側轉圈等行為減少，mNSS評分降低（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠跛行及行走向一側轉圈等行為增多，部分出現癱瘓現象，mNSS評分進一步升高（P＜0.05）。聯合組大鼠mNSS評分高于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 綠茶提取物對大鼠腦梗死體積的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死體積增加（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠腦梗死體積縮小（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠腦梗死體積進一步增加（P＜0.05）。聯合組大鼠腦梗死體積高于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖1及表2。

2.3 綠茶提取物對大鼠腦皮層組織神經突觸結構損傷及神經重塑相關蛋白表達的影響 透射電鏡觀察可見突觸區突觸前膜及后膜結構清晰，突觸前小泡呈圓形，囊泡致密且大小均勻。模型組可見突觸區突觸前膜及后膜，輪廓不清、不連續，突觸前小泡大小各異，且變形、破裂或融合明顯，突觸后膜腫脹、表面致密物質變厚，突觸間隙模糊，突觸結構相關蛋白PSD-95、SYP表達少于假手術組（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠突觸前小泡變形、破裂或融合等上述突觸結構損傷減輕，可見部分完整突觸小泡，突觸結構相關蛋白PSD-95、SYP表達升高（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠上述突觸結構損傷進一步加重，突觸結構相關蛋白PSD-95、SYP表達進一步降低（P＜0.05）。聯合組大鼠突觸結構相關蛋白PSD-95、SYP表達低于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖2、圖3及表3。

2.4 綠茶提取物對大鼠腦皮層組織神經元損傷及凋亡的影響 尼氏染色顯示，假手術組大鼠腦皮層神經元結構清晰，染色均勻無明顯損傷；模型組大鼠可見神經元核染嚴重，神經元水腫，胞漿染色較淺，呈空泡化，且排列疏松。TUNEL染色顯示，假手術組大鼠腦皮層組織幾乎未見染成黃棕色的凋亡細胞，模型組可見黃棕色凋亡細胞染色較多。與假手術組比較，模型組大鼠腦皮層神經元水腫及空泡化損傷加重，神經元細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠神經元水腫及空泡化損傷減輕，神經元細胞凋亡率降低（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠神經元水腫及空泡化損傷加重，神經元細胞凋亡率進一步升高（P＜0.05）。聯合組大鼠神經元細胞凋亡率高于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖4、圖5及表4。

2.5 綠茶提取物對大鼠腦皮層神經元細胞骨架損傷的影響 鬼筆環肽染色顯示，假手術組F-actin呈均勻、點狀分布于腦皮層組織中，模型組大鼠F-actin熒光強度減弱，部分點狀結構消失，促細胞骨架解聚蛋白cofilin活性增加，表現為p-cofilin/cofilin蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠F-actin熒光強度升高，點狀結構增多，促細胞骨架解聚蛋白cofilin活性降低，表現為p-cofilin/cofilin蛋白表達升高（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠F-actin熒光強度降低，p-cofilin/cofilin蛋白表達進一步降低（P＜0.05）。聯合組F-actin熒光強度、p-cofilin/cofilin蛋白表達低于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖6、圖7及表5。

2.6 綠茶提取物對大鼠腦皮層組織神經抑制因子及促神經生長因子表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠促神經生長因子NGF、BDNF、NT3蛋白表達降低（P＜0.05），神經抑制因子NogoA、MAG蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠促神經生長因子NGF、BDNF、NT3蛋白表達升高（P＜0.05），神經抑制因子NogoA、MAG蛋白表達降低（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠促神經生長因子NGF、BDNF、NT3蛋白表達進一步降低（P＜0.05），神經抑制因子NogoA、MAG蛋白表達進一步升高（P＜0.05）。聯合組大鼠促神經生長因子NGF、BDNF、NT3蛋白表達低于綠茶提取物組（P＜0.05），神經抑制因子NogoA、MAG蛋白表達高于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖8及表6。

2.7 綠茶提取物對大鼠腦皮層組織Rho/ROCK通路蛋白表達的影響 免疫組化染色顯示，假手術組大鼠腦皮層組織Rho呈弱陽性表達，模型組Rho在腦皮層組織中染色加深，Rho陽性染色細胞數目增多。與假手術組比較，模型組大鼠Rho陽性染色細胞數目增加，Rho、ROCK蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，綠茶提取物組及Rho抑制劑組大鼠Rho陽性染色細胞數目減少（P＜0.05），Rho、ROCK蛋白表達升高（P＜0.05）；Rho激動劑組大鼠Rho陽性染色細胞數目進一步增加（P＜0.05），Rho、ROCK蛋白表達進一步降低（P＜0.05）。聯合組大鼠Rho陽性染色細胞數目多于綠茶提取物組（P＜0.05），Rho、ROCK蛋白表達低于綠茶提取物組（P＜0.05）。詳見圖9、圖10及表7。

3 討 論

腦血管阻塞、外力撞擊等因素均可引起腦缺血性損傷及梗死的發生［2］。腦組織對缺血缺氧損傷極為敏感，一旦缺血后，腦神經元可在短時間內損傷及死亡，造成腦神經功能損傷，如語言、認知、感覺、運動等功能的丟失［11］。本研究阻斷腦中動脈后，發現大鼠出現行走時向一側轉圈及跛行等運動功能障礙癥狀，神經功能缺損評分明顯升高，TTC染色發現腦梗死面積增加，光鏡下可見神經元損傷及凋亡等病理損傷明顯，提示造模成功。腦梗死后中樞神經損傷后修復再生十分困難［12］。目前臨床上仍缺乏特異有效的神經保護劑來促進腦梗死后神經再生及突觸重塑［13］。綠茶提取物中的EGCG單體成分可抑制多種原因導致的神經元凋亡［14］。楊海玉等［15-16］體內外試驗發現，綠茶提取物可抑制乙醇刺激誘導的神經元凋亡，對改善大鼠學習記憶功能有重要作用，預示綠茶提取物可能為潛在的神經保護物質，對改善腦梗死后神經元凋亡也可能有一定的作用。本研究給予腦梗死大鼠綠茶提取物干預治療后，發現大鼠神經功能缺損評分降低，神經元損傷及凋亡明顯減少，證實綠茶提取物可能為治療腦梗死后神經元損傷的潛在藥物。但其神經元保護機制不甚明確，本研究對此進行繼續探究。

中樞神經損傷后修復及再生較為困難。Jena等［17］研究發現，腦損傷后，周圍組織中的神經營養因子NGF、BDNF、NT3等缺乏，不能為神經元及神經胞體生長提供必要的生存環境，是阻礙腦損傷后神經元修復、突觸再生的重要原因。唐小慧等［18］研究發現，神經元損傷后釋放的大量神經抑制因子NogoA、MAG等是導致軸突發芽再生抑制、生長錐崩塌、神經元存活降低、突觸重塑障礙及神經功能恢復困難的重要原因。本研究也在腦梗死模型大鼠腦損傷周圍組織中檢測到神經營養因子NGF、BDNF、NT3等表達減少，神經抑制因子NogoA、MAG等表達升高，與上述研究結果一致，進一步表明造模成功。

NogoA、MAG等抑制因子發揮抑制神經元存活、突觸重塑作用，均需要通過Rho/ROCK通路來介導完成［19］。大量文獻研究證實，神經抑制因子NogoA、MAG等可通過NgR形成受體復合物后，可通過信使環磷酸腺苷（cAMP）激活鳥氨酸交換蛋白，來促使Rho釋放二磷酸鳥苷（GDP）并活化形成小鳥苷三磷酸酶（Rho-GTP），Rho-GTP可與ROCK蛋白質氨基端的結構域結合而活化ROCK，活化的ROCK可磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）并使其失活而引起cofilin活化，活化的cofilin可切割細胞F-actin并破壞細胞肌動蛋白骨架，引起肌絲收縮，肌球蛋白聚合困難，導致細胞骨架改變、神經生長錐塌陷及軸突再生困難［20］。姜文文等［9］發現，抑制Rho-ROCK信號通路，可下調Nogo-A、MAG等神經抑制因子表達，發揮促神經生長作用。本研究發現，模型組大鼠梗死周圍組織Rho陽性表達細胞數目增多，Rho/ROCK通路蛋白表達減少及細胞骨架的破壞，電鏡下可見突觸小泡變形、破裂及融合等突觸結構的破壞，可反映突觸再生及重塑水平的PSD-95及SYP等水平明顯降低［21］，用法舒地爾抑制Rho/ROCK信號通路表達后，隨著周圍組織細胞中Rho及ROCK表達數目的減少，神經元損傷及凋亡、突觸結構及神經元細胞骨架破壞等病理損傷緩解，神經營養因子水平升高，而神經抑制因子表達降低，可反映突觸再生及重塑水平的PSD-95及SYP表達升高，大鼠mNSS評分也顯著降低，提示Rho/ROCK活化參與腦梗死后神經元及神經突觸結構損傷過程，抑制Rho/ROCK活化可促進腦梗死后神經突觸及神經元的再生及重塑，來改善神經功能損傷。反之進一步激活Rho/ROCK活化，可抑制腦梗死后神經元及神經突觸的再生及重塑，加重神經功能缺損癥狀。本研究發現，綠茶提取物組大鼠Rho/ROCK通路處于抑制狀態，神經營養因子表達升高，而神經抑制因子表達降低，神經元凋亡及神經突觸結構損傷減少，神經突觸重塑性增強，提示綠茶提取物可抑制Rho/ROCK活化，來促進腦梗死后神經元及突觸的再生及重塑，改善神經功能損傷。Rho/ROCK通路激動劑LPA可逆轉綠茶提取物的上述作用。

綜上所述，綠茶提取物可抑制Rho/ROCK活化，來促進腦梗死后神經元及突觸的再生及重塑，改善神經功能損傷。但腦梗死后神經元及突觸再生及重塑機制，涉及多條途徑、多條通路共同調節，綠茶提取物的作用機制，還有待繼續深入探究。

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（收稿日期：2021-12-05）

（本文編輯郭懷印）