柚皮苷調節JAK2/STAT3信號通路對急性缺血性腦梗死大鼠神經損傷的影響

摘要 目的：觀察柚皮苷通過調節蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）/信號轉導子與激活子3（STAT3）信號通路對急性缺血性腦梗死大鼠神經損傷的影響。方法：將60只大鼠分為對照組、假手術組、模型組、模型＋生理鹽水組、模型＋柚皮苷組和模型＋柚皮苷＋白細胞介素（IL）-6組，每組10只大鼠。采用大腦中動脈閉塞（MCAO）法建立急性缺血性腦梗死模型。術后24 h對神經功能進行評分，測定腦梗死面積，觀察腦組織病理形態；干/濕法檢測腦水腫；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測JAK2/STAT3信號通路蛋白及Bax、Bcl-2蛋白表達；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）檢測腦細胞凋亡；采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測氧化應激因子［過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）］和炎性因子［腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6］。結果：與對照組和假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分、水腫指數升高，腦梗死面積增加，細胞排列紊亂，細胞間隙變寬，細胞空泡增多，細胞變性，細胞染色不均勻，變性細胞指數（DCI）、Bax、凋亡指數（AI）表達、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）表達升高，凋亡細胞呈深褐色，Bcl-2表達、CAT、SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）；與模型組和模型＋生理鹽水組比較，模型＋柚皮苷組大鼠神經功能缺損評分、水腫指數降低，腦梗死面積減小，細胞排列有序，細胞間隙少，細胞空泡少，細胞變性和細胞染色不均有所緩解，DCI、Bax、AI表達、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2、p-STAT3表達減少，深褐色凋亡細胞較少，Bcl-2表達、CAT、SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05）；與模型＋柚皮苷組比較，模型＋柚皮苷＋IL-6組大鼠神經功能缺損評分、水腫指數升高，腦梗死面積增加，細胞排列紊亂，細胞間隙和空泡增多，細胞變性且染色不均，DCI、Bax、AI表達、Bax/Bcl-2比值、MDA含量、血清TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2、p-STAT3表達升高，深褐色凋亡細胞增多，Bcl-2表達、CAT、SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）。結論：柚皮苷對急性缺血性腦梗死大鼠神經損傷有保護作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路及氧化應激、炎癥和細胞凋亡有關。

關鍵詞 急性缺血性腦梗死；柚皮苷；蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子與激活子3信號通路；神經損傷；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.012

Effect of Naringin on Neurological Injury in Rats with Acute Ischemic Cerebral Infarction by Regulating JAK2/STAT3 Signaling Pathway

ZHENG Guiming， LU Junyan， SHI Libin

Shijiazhuang Ping′an Hospital， Shijiazhuang 050000， Hebei， China， E-mail： 623611399@qq.com

Abstract Objective：To observe the effects of naringenin on neurological injury in rats with acute ischemic cerebral infarction by regulating the protein tyrosine kinase 2（JAK2）/signal transducer and activator 3（STAT3） signaling pathway.Methods：Sixty rats were divided into the control group，sham group，model group，model＋normal saline group，model＋naringenin group，and model＋naringenin＋interleukin（IL）-6 group，with 10 rats in each group.A acute ischemic cerebral infarction model was established using the middle cerebral artery occlusion（MCAO） method.Neurological function was scored at 24 h postoperatively.The area of cerebral infarction and brain histopathological morphology were determined.The cerebral edema was detected by dry/wet assay.JAK2/STAT3 signaling pathway proteins and the expression of Bax and Bcl-2 proteins were detected by Western Blot.The apoptosis of brain cell was detected by terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling assay（TUNEL）.The levels of esoxidative stress factors［catalase（CAT），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA）］ and inflammatory factors［tumor necrosis factor-α（TNF-α），IL-1β，and IL-6］ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Compared with the control group and sham group，neurological deficit scores，edema index，and area of cerebral infarction in the model group" increased，cellular arrangement" disorganized，cellular gaps" widened，cellular vacuoles，cellular degeneration，uneven cellular staining ，degenerative cell index（DCI），Bax，AI expression，Bax/Bcl-2 ratio，MDA content，serum TNF-α，IL-1β，IL-6，phosphorylated JAK2（p-JAK2），and phosphorylated STAT3（p-STAT3） expression" increased，apoptotic cells were dark brown in color，and Bcl-2 expression，CAT，SOD，and GSH-Px activities decreased（P＜0.05）.Compared with the model group and the model＋normal saline group，neurological deficit scores，edema index，and cerebral infarct area in the model＋naringenin group decreased，orderly cellular arrangement，cellular gaps，and cellular vacuoles decreased，mitigated cellular degeneration and cellular staining irregularities，and DCI，Bax，and AI expression，Bax/Bcl-2 ratio，MDA content，serum TNF-α，IL-1β，IL-6，p-JAK2，and p-STAT3 expression decreased，dark brown apoptotic cells were fewer，and Bcl-2 expression，CAT，SOD，and GSH-Px activities increased（P＜0.05）.Compared with the model＋naringenin group，neurological deficit scores，edema index，and cerebral infarct area in the model＋naringenin＋IL-6 group increased，cellular arrangement disorganized，cellular gaps and vacuoles" increased，cellular degeneration and uneven staining，and expressions of DCI，Bax，AI，Bax/Bcl-2 ratio，MDA content，serum TNF-α，IL-1β，IL-6，p-JAK2，p-STAT3 expression increased，dark brown apoptotic cells，Bcl-2 expression，CAT，SOD，and GSH-Px activities" decreased（P＜0.05）.Conclusion：Naringin showed a protective effect of neurological injury in rats with acute ischemic cerebral infarction，and the mechanism might be related to the inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway，oxidative stress，inflammation，and apoptosis.

Keywords acute ischemic cerebral infarction; naringin; protein tyrosine kinase 2/signal transducer and activator 3 signaling pathway; neurological injury; rats; experimental study

急性缺血性腦梗死是一種發病率高、死亡率高的腦血管疾病［1］。目前急性缺血性腦梗死的治療手段有限、醫療費用昂貴且藥物副作用明顯，治療效果不確定［2］，因此，尋找一種新型急性缺血性腦梗死治療策略具有重要的臨床價值，闡明急性缺血性腦梗死的病理生理機制至關重要。急性缺血性腦梗死的病理過程及相關機制尚未明確，多項研究表明，急性缺血性腦梗死的機制可能與自由基、炎癥刺激、神經元凋亡、氧化應激、興奮性氨基酸神經毒性、腦組織代謝異常等有關；炎癥、氧化應激和細胞凋亡可能在急性缺血性腦梗死中發揮著重要的作用［3-5］。因此，抑制炎癥、氧化應激和細胞凋亡可能是治療急性缺血性腦梗死的一種有效策略。柚皮苷是一種生物類黃酮，廣泛存在于柚子和柑橘類植物中，是一種無毒的保健品［6］。柚皮苷已發現存在于許多治療各種炎癥的中草藥中，相關研究表明，柚皮苷具有抗氧化、抗纖維化、抗炎、降脂等多種生物學作用［7-9］；柚皮苷在蛛網膜下腔出血［10］、創傷性腦損傷［11］等不同實驗動物模型中均顯示出神經保護作用；多項研究顯示，柚皮苷對腦梗死有一定的保護作用，但其潛在的調控機制尚未明確［12-13］；在骨質疏松癥中，柚皮苷可抑制蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）/信號轉導子與激活子3（STAT3）信號通路的激活［14］。然而，JAK2/STAT3信號通路是否參與柚皮苷在急性缺血性腦梗死后的神經保護作用尚未明確。本研究觀察柚皮苷通過調節JAK2/STAT3信號通路對急性缺血性腦梗死大鼠神經損傷的影響，進一步證實柚皮苷對急性缺血性腦梗死的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物和試劑

無特定病原體（SPF）級SD大鼠60只，6～8周齡，體質量250～280 g，購自華中科技大學動物實驗中心，生產許可證號為SCXK（鄂）2021-0009。操作前將大鼠置于SPF級（24±2）℃環境中，濕度50%～60%，暗/光循環12 h，適應性喂養1周。大鼠均自由飲食和飲水。本研究方案經醫院倫理委員會授權批準。

柚皮苷（成都普思生物科技股份有限公司），JAK2/STAT3信號通路激活劑、白細胞介素-6（IL-6）（美國Peprotech），戊巴比妥鈉（默克），氯化三苯基四氮唑（TTC）（南京建成生物工程研究所），Bax、Bcl-2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3、IgG抗體及末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）檢測試劑盒（美國Abcam），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物公司）。

1.2 實驗分組

將大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、模型＋生理鹽水組、模型＋柚皮苷組和模型＋柚皮苷＋IL-6組，每組10只大鼠。模型＋柚皮苷組大鼠術前給予柚皮苷（10 mg/kg）預灌胃3 d，模型＋柚皮苷＋IL-6組大鼠術前給予柚皮苷（10 mg/kg）和IL-6（0.1 μg/μL）預灌胃3 d，模型＋生理鹽水組大鼠術前給予生理鹽水（10 mg/kg）預灌胃3 d。柚皮苷劑量根據《藥理實驗方法學》中人與動物給藥劑量換算系數，經計算10 mg/kg為大鼠的給藥劑量［13］。IL-6劑量參照相關文獻［15］。模型組、模型＋生理鹽水組、模型＋柚皮苷組和模型＋柚皮苷＋IL-6組大鼠經大腦中動脈閉塞（MCAO）誘導急性缺血性腦梗死。假手術組除不阻斷大腦中動脈外，其余操作與模型組相同。對照組為正常飼養的大鼠。

1.3 MCAO造模

參考相關文獻［16］進行MCAO造模：手術過程中，大鼠先用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，取仰臥位固定，核心體溫維持在37 ℃。切開大鼠右頸，充分暴露右側頸總動脈，分離并結扎頸外動脈及其分支。將3-0尼龍縫線鈍端插入頸內動脈，并延伸至大腦前動脈阻斷大腦中動脈，導致大腦中動脈起始段及其側支供血區發生缺血壞死。MCAO 2 h后，拆除尼龍縫線恢復血流，之后縫合皮膚消毒，依次單籠飼養。24 h后，對大鼠神經系統功能進行評分并處死進一步實驗。

1.4 神經功能測定和腦組織病理形態觀察

采用雙盲法評價各組大鼠神經功能。評分標準：0分為無神經損傷癥狀；1分為患側前爪不能完全伸展；2分為患側行走時前爪向內旋轉；3分為大鼠行走時患側前爪向內傾斜；4分為患側腳爪不能自主活動且失去意識；5分為患側肢體完全不能活動。若得分＞3分，認為急性缺血性腦梗死造模成功。

腦組織制作石蠟切片，HE染色，觀察腦組織病理形態。在光鏡下隨機觀察5個缺血區，視野不重疊。神經元細胞核呈嗜酸性藍色，細胞質和間質呈嗜酸性紅色。采用變性細胞指數法測定缺血區細胞損傷程度。變性細胞指數（DCI）＝變性細胞數/總細胞數×100%。

1.5 腦梗死區及腦組織水腫評估

再灌注24 h后，各組大鼠均斷頭處死，快速清除血塊和軟腦膜，收集腦組織。采用TTC染色法測定梗死面積，具體步驟參照相關文獻［17］，梗死面積/腦總面積的百分比為統計參數。采用干/濕重量法計算腦水腫指數，腦組織水腫指數＝（濕重－干重）/濕重×100%。

1.6 TUNEL檢測腦細胞凋亡

采用TUNEL試劑盒檢測腦細胞凋亡。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。組織切片厚度為4～6 μm。將腦切片為與末端脫氧核苷酸轉移酶在37 ℃孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次，之后室溫下與IgG孵育30 min。以0.02%過氧化氫（H2O2）為酶底物，四氯化鎳二氨基聯苯胺（DAB）為顯色劑。凋亡細胞的細胞核呈深褐色，陰性細胞的細胞核無染色。凋亡細胞定義為TUNEL陽性，核碎裂，核固縮或核裂。凋亡指數（AI，%）＝陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.7 氧化應激指標測定

采用ELISA檢測腦組織氧化應激水平及血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量，參照ELISA試劑盒說明書進行檢測。在450 nm波長的紫外分光光度計上測定MDA、SOD、CAT和GSH-Px，并計算表達量。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

收集腦組織，使用蛋白酶抑制劑溶解于RIPA緩沖液中。總蛋白提取的具體步驟以說明書為依據。二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度，十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。之后蛋白質被轉移到硝基纖維素膜上，用牛奶封閉。β-actin作為內參。將膜與Bax、Bcl-2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和β-actin抗體在4 ℃條件下孵育過夜。之后用洗滌緩沖液（TBST）沖洗膜3次，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG二抗在37 ℃條件下孵育1 h。使用電化學發光（ECL）試劑觀察條帶。使用Image J軟件計算灰度值。

1.9 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經功能缺損評分、腦組織水腫及腦梗死面積比較

與對照組和假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分、水腫指數升高（P＜0.05），腦梗死面積增加（P＜0.05）；與模型組和模型＋生理鹽水組比較，模型＋柚皮苷組大鼠神經功能缺損評分、水腫指數降低，腦梗死面積減小（P＜0.05）；與模型＋柚皮苷組比較，模型＋柚皮苷＋IL-6組大鼠神經功能缺損得分、水腫指數升高，腦梗死面積增加（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組大鼠腦組織病理損傷改變

對照組和假手術組細胞排列整齊清晰，染色均勻，未見變性細胞。與對照組和假手術組比較，模型組細胞排列紊亂，細胞間隙變寬，細胞空泡增多，細胞變性，細胞染色不均勻；與模型組、模型＋生理鹽水組比較，模型＋柚皮苷組細胞排列有序，細胞間隙減小，細胞空泡少，細胞變性和細胞染色不均有所緩解；與模型＋柚皮苷組比較，模型＋柚皮苷＋IL-6組細胞排列紊亂，細胞間隙和空泡增多，細胞變性且染色不均。詳見圖1。模型組DCI高于對照組和假手術組，模型＋柚皮苷組DCI低于模型組和模型＋生理鹽水組，模型＋柚皮苷＋IL-6組DCI高于模型＋柚皮苷組（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組大鼠腦細胞凋亡、Bax、Bcl-2表達及Bax/Bcl-2比值比較

與對照組和假手術組比較，模型組凋亡細胞呈深褐色，AI升高，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.05）；與模型組和模型＋生理鹽水組比較，模型＋柚皮苷組深褐色凋亡細胞較少，AI降低，Bax表達降低，Bcl-2表達增加，Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05）；與模型＋柚皮苷組比較，模型＋柚皮苷＋IL-6組深褐色凋亡細胞增多，AI升高，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.05）。詳見圖2、圖3和表3。

2.4 各組氧化應激因子比較

與對照組和假手術組比較，模型組CAT、SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）；與模型組和模型＋生理鹽水組比較，模型＋柚皮苷組CAT、SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量降低（P＜0.05）；與模型＋柚皮苷組比較，模型＋柚皮苷＋IL-6組CAT、SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6比較

模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6表達高于對照組和假手術組（P＜0.05）；模型＋柚皮苷組血清TNF-α、IL-1β、IL-6表達低于模型組和模型＋生理鹽水組（P＜0.05）；模型＋柚皮苷＋IL-6組血清TNF-α、IL-1β、IL-6表達高于模型＋柚皮苷組（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 各組JAK2/STAT3信號通路蛋白表達比較

模型組p-JAK2、p-STAT3表達高于對照組和假手術組（P＜0.05）；模型＋柚皮苷組p-JAK2、p-STAT3表達低于模型組和模型＋生理鹽水組（P＜0.05）；模型＋柚皮苷＋IL-6組p-JAK2、p-STAT3表達高于模型＋柚皮苷組（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

3 討 論

腦缺血缺氧是造成腦梗死后神經功能損害的重要因素。一方面，神經細胞對缺氧環境的耐受性差，缺血缺氧可直接損傷神經細胞；另一方面，炎癥反應和氧化應激反應的二次激活可加重細胞凋亡，進而引起神經功能損傷［18］。神經功能缺損評分、腦梗死面積、病理損傷和腦組織水腫是評價腦損傷的常用指標。MCAO引起神經功能缺損和腦水腫［16］。本研究采用線栓法建立急性缺血性腦梗死模型后，MCAO大鼠神經功能缺損評分和凋亡率均高于假手術組和對照組，說明急性缺血性腦梗死模型大鼠的梗死腦組織中存在明顯凋亡。柚皮苷預處理可改善神經功能缺損，減小腦組織梗死面積，減輕病理損傷和水腫，減少腦細胞凋亡。進一步提示柚皮苷對急性缺血性腦梗死具有神經保護作用，其作用機制與抑制細胞凋亡有關。

Bcl-2家族蛋白由促凋亡蛋白（Bax）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）組成，可調控線粒體凋亡信號通路的激活，其機制與調節線粒體外膜（MEM）通透性有關［19］。Bax/Bcl-2比值是觸發MEM滲透的閾值［20］。本研究結果顯示，急性缺血性腦梗死可上調Bax/Bcl-2比值，降低Bcl-2表達，增加Bax表達，提示急性缺血性腦梗死誘導的細胞凋亡是通過激活線粒體凋亡信號通路介導的。柚皮苷預處理可增加Bcl-2表達，降低Bax表達，下調Bax/Bcl-2比值，提示柚皮苷通過調節MEM的通透性，抑制急性缺血性腦梗死線粒體凋亡信號通路的激活。

炎癥和氧化應激的二次激活是腦梗死過程中神經元凋亡的重要因素［21-23］。TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子在炎癥反應的激活中發揮著重要作用。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，可激活炎癥級聯，介導各種炎癥介質級聯釋放；IL-1β和IL-6是由淋巴細胞、中性粒細胞等分泌，其作用主要是加重炎癥，介導多種炎癥細胞向炎癥灶遷移和浸潤［21］。CAT是保護細胞免受氧自由基損傷的主要細胞酶之一，可抑制過氧化氫損傷。SOD是線粒體基質中對抗超氧陰離子的主要防御機制。GSH-Px是細胞中的一種抗氧化酶，在保護細胞免受氧化損傷方面發揮著重要作用。MDA是脂質過氧化的關鍵產物，可間接反映細胞氧化應激水平［23］。本研究中，模型組抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性降低，MDA含量和炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達升高；柚皮苷預處理可提高SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提示柚皮苷通過抑制氧化應激和炎癥反應，減輕急性缺血性腦梗死后腦損傷。

JAK2是蛋白-酪氨酸激酶家族的成員，是許多生理和病理過程的重要調節器，包括炎癥反應和細胞增殖、分化，其他信號分子，如STAT1、STAT3和STAT5，也受JAK2調控，JAK2可誘導p-STAT3。多項研究顯示，JAK2/STAT3通路在炎癥反應和氧化應激中發揮著重要作用［24-25］。有研究顯示，抑制JAK2/STAT3通路可抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體的激活，從而減輕缺血性腦卒中后的神經炎癥反應［26］；抑制JAK2/STAT3可抑制小膠質細胞線粒體改善腦缺血損傷和神經炎癥［27］；柚皮苷可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活［14］；相關研究表明，JAK2/STAT3信號通路可調控細胞凋亡和氧化應激［24］。本研究結果顯示，與模型組比較，柚皮苷預處理降低了JAK2、STAT3的磷酸化水平，提示柚皮苷可進一步抑制急性缺血性腦梗死中JAK2/STAT3信號通路的激活。采用JAK2/STAT3信號通路激活劑IL-6處理后，p-JAK2、p-STAT3水平升高，大鼠神經損傷及腦細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激均加重，進一步提示柚皮苷通過抑制JAK2/STAT3信號通路在急性缺血性腦梗死中發揮著神經保護作用。

綜上所述，急性缺血性腦梗死引起大腦氧化應激，炎癥和細胞凋亡，損害神經功能，柚皮苷預處理通過抑制JAK2/STAT3信號通路，降低腦內氧化應激、炎癥和凋亡，從而改善急性缺血性腦梗死受損的神經功能。本研究揭示了柚皮苷對急性缺血性腦梗死的神經保護作用機制，提示柚皮苷可能是一種潛在的治療急性缺血性腦梗死的物質。

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（收稿日期：2022-07-01）

（本文編輯薛妮）

基金項目 河北省科學技術研究與發展計劃項目（No.11276174）

作者單位 石家莊平安醫院（石家莊" 050000），E-mail：623611399@qq.com

引用信息 鄭貴明，盧俊彥，史立彬.柚皮苷調節JAK2/STAT3信號通路對急性缺血性腦梗死大鼠神經損傷的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（16）：2977-2983.