2型糖尿病病人NOS3基因多態性與冠心病發病風險的傾向性評分匹配分析

摘要 目的：分析2型糖尿?。═2DM）病人內皮型一氧化氮合酶3（NOS3）基因多態性與冠心病發病風險的分析。方法：納入2019年12月—2021年12月于我院就診的302例T2DM病人為研究對象，根據是否合并冠心病分為單純T2DM組（224例）和合并冠心病組（78例）。收集病人臨床資料、實驗室指標、影像學資料，采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術檢測NOS3 G894T、NOS 3T786C多態性，對年齡、性別、吸煙史、體質指數、冠心病家族史、基礎疾病、降糖方案進行傾向性評分匹配后采用Logistic回歸分析T2DM病人NOS3基因多態性與冠心病發病風險的關系。結果：兩組經傾向性評分匹配后有56例配對成功，匹配后一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）、同型半胱氨酸（Hcy）、左室射血分數（LVEF）、NOS3 G894T、NOS3 T786C多態性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，ApoAⅠ（OR＝620.821）、Hcy（OR＝1.823）、NOS3 G894T中TT型（OR＝5.157）、NOS3 T786C中CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素（P＜0.05）。結論：T2DM病人NOS 3G894T、NOS3 T786C多態性與冠心病發病風險相關，臨床可針對性相關指標進一步干預。

關鍵詞 冠心??；2型糖尿病；內皮型一氧化氮合酶3；基因多態性；傾向性評分

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.020

心血管并發癥是導致2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）病人死亡的主要原因，與內皮功能密切相關［1-3］。一氧化氮（NO）可調節血管平滑肌細胞增殖和遷移、血管張力、內皮通透性及內皮-白細胞相互作用，是內皮抗動脈粥樣硬化的關鍵因素。內皮型一氧化氮合酶3（NOS3）位于染色體7q35-36上的基因編碼，可調節血管內皮功能，維持血管穩態，NOS3遺傳多態性已證實對NO水平、血脂有影響，且與高血壓［4］和糖尿病足潰瘍［5］相關，但與冠心病風險之間的關系尚未明確。有研究顯示，敲除小鼠中NOS3基因引起嚴重的血管內皮功能障礙，并導致典型的冠心病異常表型發展［6］。一氧化氮合酶（NOS）表達上調與冠心病的良好保護作用有關［7］。NOS3多態性可能是T2DM病人合并冠心病的遺傳標志物。本研究進行T2DM病人NOS3基因多態性與冠心病發病風險的傾向性評分匹配分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標準

納入標準：符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》［8］中T2DM的診斷標準，空腹血糖（FBG）≥7.0 mmol/L；或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2h血糖（2 hPG）≥11.1 mmol/L；符合《中國心血管病預防指南》中冠心病的診斷標準［9］，經冠狀動脈造影確診；年齡35～75歲。排除標準：1型糖尿病、妊娠糖尿??；合并糖尿病急性代謝紊亂并發癥；嚴重肝、腎功能異常；合并心臟結構瓣膜性病變。納入2019年12月—2021年12月我院T2DM病人302例為研究對象，收集病人一般資料、表型影響因素與基因型影響因素。本研究經醫院倫理委員會批準，病人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料

收集病人年齡、性別、基礎疾病、治療方案。

1.2.2 實驗室指標

1）FBG、2 hPG：入組時抽取空腹靜脈血，置于NaF抗凝管1管中，采用AU5800型全自動生化儀（美國貝克曼庫爾特公司）及配套試檢測FBG和2 hPG。2）糖化血紅蛋白（HbA1c）：采集病人指尖全血5 μL，置于凍存盒中，在2～6 ℃環境下保存，采用糖化血紅蛋白測定儀（VariantⅡ型）以離子交換高壓液體色譜法測量HbA1c水平。3）脂代謝水平：將抽取的靜脈血置于促凝管1管離心分離血清，標本保存至－40 ℃冰箱備用，測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）。4）同型半胱氨酸（Hcy）：抽取空腹靜脈血3 mL，采用熒光偏振免疫分析技術檢測Hcy水平。5）血尿酸（UA）：抽取靜脈血3 mL，分離提取血清，采用液相層析技術檢測UA水平。

1.3 影像學資料

采用PHILIPS HD 11型超聲心動圖測定左室射血分數（LVEF）、室間隔厚度（IVST）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、舒張早期最大峰值速度/舒張晚期最大峰值速率（E/A）。采用彩色多普勒超聲診斷儀（HP5500型）進行頸動脈超聲檢查，設置探頭頻率為4.0～10.0 MHz，病人取仰臥位，充分暴露頸部，確定頸總動脈位置，超聲探頭縱行逐漸由前至后移動尋找最佳顯影位置，橫截面掃描測定血管內徑、頸動脈內中膜厚度（IMT）及斑塊情況，連續測量3次，取平均值。踝臂指數（ABI）測定：采用電子血壓測定儀（U3l型）測定單側ABI（踝動脈或脛后動脈），即踝動脈的收縮壓和雙側肱動脈收縮壓最高值的比值，最后確定ABI。

1.4 NOS3基因多態性

1.4.1 NOS3 G894T多態性

抽取所有病人空腹靜脈血10 mL，采用德國QIAGEN公司生產的人外周血DNA提取試劑盒，以飽和酚-氯仿法提取細胞基因組DNA，采用NanoDrop檢測基因組DNA含量，置于－70 ℃環境下保存。采用上海生工生物工程技術服務有限公司合成的聚合酶鏈式反應（PCR）引物；PCR反應體系：總體積為25 μL，模板DNA 0.5 μL，5 μL緩沖劑，0.5 μL脫氧核苷三磷酸，正向、反向引物均為0.5 μL，17.25 μL H2O、0.25 μL Taq聚合酶，混勻并進行離心處理；反應條件：預變性5 min（94 ℃）、變性15 s（96 ℃）、退火30 s（60 ℃）、延伸90 s（72 ℃），35次循環后72 ℃再延伸5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳40min放置擴增產物，限制性內切酶BanⅡ1 μL，電泳、溴化乙啶（EB）染色后在7500熒光實時定量PCR判斷基因型。

1.4.2 NOS3 T786C多態性

以提取的DNA為模板，根據設計的引物，采用PCR方法進行特異性擴增；PCR反應體系：總體積為25 μL，模板0.5 μL，正向、反向引物均為0.5 μL，Buffer 5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U；反應條件：預變性5 min（95 ℃）、變性30 s（96 ℃）、退火30 s（60 ℃）、延伸60 s（72 ℃），35次循環后72 ℃再延伸7 min，PCR產物用3%的瓊脂糖電泳測定擴增結果。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；定性資料以例數、百分比（%）表示，采用χ2檢驗；等級資料采用Wilcoxon秩和檢驗。對年齡、性別、吸煙史、體質指數、冠心病家族史、基礎疾病、降糖方案進行傾向性評分匹配（PSM），利用PSM擴展程序進行：以是否合并冠心病為因變量，各協變量為自變量，通過Logistic回歸分析估計傾向性評分值，采用1∶1臨近匹配法進行匹配，通過卡鉗值為0.02保證匹配結果的優良性，按照合并冠心病組與單純T2DM組1∶1進行匹配，并繪制PS分布的抖點圖，之后比較組間協變量的標準差在匹配前后的改變，匹配后的標準差越接近于0，匹配結果越滿意，當標準差異絕對值小于0.1時，認為組間變量的均衡性較好。對匹配后資料進行Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組PSM前后臨床資料比較

PSM前，合并冠心病組年齡、體質指數、冠心病家族史比例、吸煙史比例高于單純T2DM組（P＜0.05）；經過PSM后共56例病人配對成功，兩組間協變量經匹配后均達到平衡，經PSM各協變量的均衡性得到了明顯提高（P＞0.05）。詳見表1、圖1。

2.2 PSM后兩組臨床資料比較

合并冠心病組和單純T2DM組ApoAⅠ、Hcy、LVEF、NOS3 G894T多態性、NOS3 T786C多態性比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 PSM后冠心病發病風險的多因素分析

以是否合并冠心病為因變量（是＝1，否＝0），Logistic回歸分析結果顯示：ApoAⅠ（OR＝620.821）、Hcy（OR＝1.823）、NOS3 G894T多態性TT型（OR＝5.157）、NOS3 T786C多態性CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素。詳見表3、表4。

3 討 論

以冠狀動脈狹窄甚至閉塞引起的心肌缺血或梗死為特征的冠狀動脈疾病是全球范圍內死亡和殘疾的主要原因，也是T2DM的常見并發癥。目前冠心病的確切原因尚未明確。遺傳因素可能在T2DM合并冠心病發病機制中發揮關鍵作用［10-11］。首先，廣泛觀察到冠心病的家族聚集性，冠心病的遺傳等級超過50%［12］。其次，先前的遺傳關聯研究已發現大量的遺傳變異和多態性與T2DM冠心病風險的增加有關，且篩選常見的因果變異已證實是預測T2DM患冠心病風險的有效方法［13］。遺傳易感性對T2DM合并冠心病發生和發展具有重要意義。

在T2DM合并冠心病對遺傳因素研究中，NOS3基因備受關注，其位于人類染色體7q35～q36區，長約22kB，包含外顯子26個和內含子25個，編碼含有4 052個核苷的mRNA，在單倍體人類基因組中為單一拷貝。NOS3表達的多少和活性的強弱是NO生成多少的決定因素，NO是已知重要的內源性血管舒張因子，可維持正常血管功能，也是引起冠狀動脈狹窄的重要原因，故從NOS3基因動態性方面評價T2DM并發冠心病發病風險，可能為T2DM并發冠心病發病提供依據。鑒于研究時限較短，故本研究中對納入的研究對象進行PSM后比較，排除了一般資料對T2DM合并冠心病風險的影響，從而分析NOS3基因多態性與冠心病風險發生之間的相關性。

本研究結果顯示，NOS3 T894G多態性中TT型（OR＝5.157）及NOS3 T786C多態性中CC型（OR＝5.342）是糖尿病合并冠心病的危險因素。NOS3 G894T在第8號外顯子上，894位堿基G向T突變，相應產物第298位上的谷氨酸被天冬氨酸（Glu298Asp）替換，修飾了NOS3的編碼序列，降低了NOS3活性，可調節血管擴張和平滑肌增殖功能受損。NOS3 T786C位于NOS3啟動子區域，-786C等位基因降低可影響NOS3 mRNA表達，進而增加冠心病發病風險。

目前， NOS3基因DNA串聯重復序列多態性和單核苷酸多態性已達16種以上，分別位于編碼區的774位、894位、5′端的側翼區-1474位、-924位、-786位、-691位和第2、4、8、11、12、13、15、18、22、23內含子上。其中位于第8號外顯子上，由于894位核苷酸G突變成T（894G/T，rsl799983），導致298位上相應的編碼蛋白產物由谷氨酸被替換成天冬氨酸（Glu298Asp）。一項研究調查了NOS3 4個單核苷酸多態性（rs891512、rs1799983、rs2070744和rs869109213）與糖尿病風險之間的關系，結果顯示，4個單核苷酸多態性可能為T2DM的遺傳生物標志物，而rs1799983、rs2070744和rs869109213多態性可能有助于T2DM血管并發癥發生［14］。rs1799983即G894T，有研究顯示，青年冠心病發生發展可能與NOS3 G894T基因多態性有關［15］；薈萃分析研究得到類似結果，即NOS3 G894T多態性是T2DM合并冠心病的危險因素，尤其在亞洲人群和早發性心肌梗死病人中［16］。Luo等［17］研究顯示，rs1799983多態性的T等位基因與NO水平降低和血脂水平異常顯著相關，rs1799983多態性與冠心病之間的聯系可能部分由低NO水平和變異的T等位基因引起的血脂異常介導。雖然G894T位點不位于酶的功能性序列，298位谷氨酸位于a-螺旋的中心，錯義突變導致NOS3的構象在此處由a-螺旋變為緊密折疊，因此對NOS3蛋白的功能造成影響，降低NOS3活性，導致血小板聚集性增強，進而促進動脈粥樣硬化的發生。

位于啟動子區域-786位存在一個單核苷酸突變（T786C，rs2070744），在高血壓、腎病等疾病中被關注。NOS3的rs2070744多態性與蘇丹人群中的原發性高血壓有關，病人組與對照組有較高的CC基因型頻率［18］；在腎病中，rs2070744是抗IgAN的保護因子［19］。我國漢族人中，rs2070744 C等位基因與冠心病風險增加相關；在糖尿病病人中，rs2070744 C等位基因與冠心病風險增加相關［20］。一項關于不穩定心絞痛病例對照研究發現，rs2070744基因型多態性分布在不穩定型心絞痛病人（246例）和健康對照人群（189名）中存在差異，且NOS3 rs2070744 TT基因型病人有較高的腰圍（TT與TC＋CC，P＝0.023；TT與CC，P＝0.005）［21］，與NOS3 T786C突變后，NOS3蛋白在Caveolae的定位改變，引起剪切依賴反應減少，NOS3調節周期的協調性遭受損，影響NO濃度有關，同時說明NOS3基因多態性在冠心病發病過程中的重要性。

綜上所述，T2DM病人NOS3 G894T、NOS3 T786C多態性與冠心病發病風險相關。本研究樣本量有限，今后需擴大樣本量，進一步闡明NOS多態性與微血管病變之間的關系。

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（收稿日期：2022-06-29）

（本文編輯薛妮）

基金項目 河北省秦皇島科學技術研究與發展計劃項目（No.202004A133，202301A204）；河北省衛健委2020年度醫學科學研究項目（No.20201512）

通訊作者 王銳，E-mail：psbywr@yeah.net

引用信息 王蕊，王翠娟，尹福在，等.2型糖尿病病人NOS3基因多態性與冠心病發病風險的傾向性評分匹配分析［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2023，21（16）：3012-3017.