環丙沙星對短程硝化-厭氧氨氧化工藝脫氮效能的影響

摘要：為了研究不同濃度的氟喹諾酮類抗生素環丙沙星對短程硝化-厭氧氨氧化工藝的脫氮效能的影響，采用連續流式反應器進行分階段長期實驗；采用紫外分光光度法、高效液相色譜法及三維熒光光譜法，對不同階段反應器的脫氮效能、環丙沙星去除率及可溶性微生物產物熒光特性進行表征。結果表明：當環丙沙星的質量濃度為0.1 mg/L時，反應器出水硝態氮的質量濃度由28.71 mg/L增至44.28 mg/L，一段時間后恢復穩定；反應器對環丙沙星的耐藥性逐漸增強，恢復穩定期不斷縮短；環丙沙星能夠改變微生物物種豐富度和多樣性以及各屬的相對豐度。

關鍵詞：生物脫氮；短程硝化-厭氧氨氧化工藝；環丙沙星；微生物群落結構；毒性評價

中圖分類號：X523

文獻標志碼：A

開放科學識別碼（OSID碼）：

Effects of Ciprofloxacin on Operation Efficiency of

Partial Nitritation-Anammox Process

XU Huixue¹， XUE Xiaodong²， SI Guangchao¹， ZHANG Xinwen¹， FENG Rui¹， WEI Dong¹

（1. School of Water Conservancy and Environment， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China;

2. Shandong Academy of Environmental Science Co.， Ltd.， Jinan 250013， Shandong， China）

Abstract： To investigate effects of fluoroquinolone antibiotic ciprofloxacin with different concentrations on nitrogen removal efficiency of partial nitrification-anammox process， a continuous flow reactor was used to carry out a long-term experiment in stages. Nitrogen removal efficiency， ciprofloxacin removal rate， and fluorescence characteristics of soluble microbial products in different stages of the reactor were characterized by using ultraviolet spectrophotometry， high performance liquid chromatography， and three-dimensional fluorescence spectrometry. The results show that when the mass concentration of ciprofloxacin is 0.1 mg/L， the mass concentration of nitrate nitrogen in effluent water of the reactor increases from 28.71 mg/L to 44.28 mg/L， and returns to stability after a period of time. Drug resistance of the reactor to ciprofloxacin increases gradually， and the period of recovery and stability is shortened continuously. Ciprofloxacin can change richness and diversity of microbial species as well as relative abundance of each genus.

Keywords： biological removal of nitrogen; partial nitrification-anammox process; ciprofloxacin; microbial community structure; toxicity assessment

目前，畜禽養殖行業污染是廣受關注的農業面源污染之一。飼料中通常會加入一定量的抗生素用于預防和治療畜禽疾病，而抗生素由于無法在動物體內完全代謝，會隨畜禽排泄物排放到養殖廢水中，

收稿日期：2022-06-14 網絡首發時間：2023-03-27T15∶03∶41

基金項目：國家自然科學基金項目（52270071）

第一作者簡介：許會學（1997—），女，山東濟南人。碩士研究生，研究方向為水污染監測與控制工程。E-mail：1030754576@qq.com。

通信作者簡介：魏東（1985—），男，山東濟南人。副教授，博士，碩士生導師，研究方向為水污染控制。E-mail：weidong506@163.com。

網絡首發地址：https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1378.N.20230327.1054.002.html

進而對污水廠的穩定運行帶來一定影響^［1］，因此開展抗生素對污水處理廠運行效能的影響評價具有重要的研究意義。

短程硝化-厭氧氨氧化（PN/A）工藝是一種新型生物脫氮技術，用于有效處理高含量氨氮廢水，與傳統生物脫氮工藝相比，具有大幅減少耗氧量和無需碳源消耗的優勢^［2］。通常，厭氧氨氧化菌（AnAOB）對抗生素十分敏感，例如四環素類、大環內酯類和氟喹諾酮類等。其中，環丙沙星（CIP）是一種通過抑制革蘭氏陰性菌的脫氧核糖核酸（DNA）轉錄和復制抑制微生物的活性的一種氟喹諾酮類抗生素^［3］，具有抗菌譜廣、抗菌性強、藥效好和易于吸收等優點，在養殖行業中應用廣泛^［4］。近年來，在污水處理廠中頻繁檢測到各類抗生素，對脫氮工藝造成一定的影響，因此，本文中考察CIP對PN/A工藝運行效能影響，對于推廣PN/A工藝具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置與運行方法

PN/A反應器采用上流式運行模式，頂部設有濾網進行泥水分離（見圖1）。反應器內徑和高度分別為12、30 cm，有效容積為3.4 L。實驗過程中，反應器填充體積分數為40%的K3型微生物填料，單個K3填料直徑、高度分別為25、12 mm。反應器采用黑色遮光布進行避光遮擋。反應器底部安裝磁力攪拌器，以保證廢水充分混合，攪拌速度控制為120 r/min。曝氣過程中，通過氣泵將空氣引入反應器底部，并控制系統溶解氧（DO）質量濃度穩定在0.5～0.8 mg/L。通過加熱棒將反應器溫度的穩定控制在30～32 ℃，PN/A工藝水力停留時間（HRT）設定為24 h。

1.2 模擬廢水和接種污泥

采用人工模擬廢水，進水氨氮質量濃度約為200 mg/L。進水通過碳酸氫鈉調節反應器內水體pH為7.2～7.8。模擬廢水中其他組分如下：磷酸二氫鉀，質量濃度為10.0 mg/L；氯化鈣，質量濃度為22.7 mg/L； 七水合硫酸鎂，質量濃度為12.3 mg/L；微量元素物質成分如表1所示。根據CIP投加量， 實驗分為4個運行階段，第Ⅰ階段（1～40 d）、第Ⅱ階段（41～102 d）、第Ⅲ階段（103～124 d）和第Ⅳ階段（125～160 d）。4個階段的CIP投加量分別為0、0.1、5、10 mg/L。接種污泥為實驗室處理高氨氮廢水的PN/A污泥，初始污泥質量濃度（MLSS）控制在4.0 g/L。

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 水質測試

采用紫外分光光度計（752N型，上海儀電分析有限公司），根據國家標準GB/T 7479—1987、GB/T 7493—1987和環境保護行業標準HJ/T 346—2007中的方法定期檢測出水氨氮（NH⁺₄-N）、亞硝態氮（NO^-₂-N）、硝態氮（NO^-₃-N）的含量。NO^-₃-N測試前利用離子吸附樹脂進行預處理，避免水樣中CIP測試干擾。采用高效液相色譜儀（Agilent 1260 Ⅱ型，美國安捷倫科技有限公司）測定CIP濃度^［5］，色譜柱為C18柱，柱溫為40 ℃，測試波長為278 mm，流動相中磷酸與乙腈的體積比為82∶18。

1.3.2 微生物產物分析

溶解性微生物產物（SMP）的三維熒光光譜圖使用熒光光度計儀（LS-55型，美國Perkin-Elmer公司）獲得。儀器參數設定如下：發射波長E_m為200～400 nm，增量為10 nm；激發波長E_x為280～550 nm，間隔5 nm，增量為0.5 nm；激發狹縫和發射狹縫均保持在10 nm，掃描速率設置為2 400 nm/min。

1.3.3 細胞活性檢測

采用活性氧試劑盒（S0033S型，碧云天生物技術有限公司）和乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒（C0016型，碧云天生物技術有限公司）^［6］檢測微生物樣品胞內活性氧水平和乳酸脫氫酶釋放。

1.3.4 微生物分析方法

收集4個不同階段的微生物樣品進行冷凍保存并送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S 核糖體核糖核酸（rRNA）檢測。通用引物對采用515F 806R（5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）和（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）對16S rRNA基因的高變區V4進行擴增^［7］，使用Silva（Release138）數據庫 （http：//www.arb-silva.de）統計4個微生物樣品的群落物種組成。

2 結果與討論

2.1 PN/A反應器的脫氮效能

PN/A反應器脫氮效能如圖2所示。通過控制溫度及曝氣量等條件， 使PN/A反應器的脫氮效能達到最優并維持穩定（第Ⅰ階段）。由圖2（a）可見，第Ⅰ階段的NH⁺₄-N去除率達到97.10%，出水NO^-₃-N、NO^-₂-N的平均質量濃度分別為28.71、1.49 mg/L，實現了短程硝化菌（AOB）和AnAOB菌同步生長，且PN/A系統中NO^-₃-N的積累量占NH⁺₄-N消耗量的15%，接近11%的理論值^［8］，因此PN/A反應器運行效果良好，在不改變現有調控條件的情況下可進行下一階段的CIP毒性試驗階段。

在反應40 d后，向PN/A反應器中投加CIP至質量濃度為0.1 mg/L（第Ⅱ階段）。由圖2（a）可知，在反應41～80 d，出水NH⁺₄-N、NO^-₂-N、NO^-₃-N的質量濃度分別為0.77、2.01、44.28 mg/L。NO^-₃-N濃度增加說明系統的脫氮性能受到輕微干擾，CIP的存在使AnAOB菌活性受到抑制，但未對AOB菌的活性造成明顯的抑制^［9］。此外，剛投加CIP的前5 d，CIP去除率在30%左右，主要是通過污泥吸附作用去除， 一段時間后CIP的去除率降低至10%以下，說明CIP在污泥中已經達到吸附飽和，且生物降解作用不大，由于CIP對微生物的脅迫作用影響了系統脫氮過程， 因此系統無法再去除CIP。圖2（b）還顯示，第Ⅱ階段CIP的去除率從30.14%逐漸降低到19.56%， 說明當污泥吸附達到飽和后，CIP將不再被去除。在反應92～102 d，出水NO^-₃-N質量濃度降低至23.60 mg/L，與對照階段相似，說明微生物對低濃度的CIP具有耐藥性^［10］，經過一段時間的適應期后，對微生物的抑制作用減弱，從而恢復了PN/A反應器的脫氮效能。

從反應103 d起，反應器中CIP的質量濃度增加至5 mg/L（第Ⅲ階段）。由圖2（a）可看出，在反應103～110 d，出水NO^-₃-N的質量濃度由28.30 mg/L增加至63.32 mg/L，在經過持續7 d的增加后，開始降低至24.77 mg/L，可認為PN/A工藝在質量濃度為5 mg/L的CIP刺激下，對AOB菌的活性未造成明顯影響，但抑制了反硝化菌（NOB）的活性，促進PN/A反應器脫氮效能的恢復。

在反應125 d后繼續增加CIP的質量濃度至10 mg/L（第Ⅳ階段）。由圖2（a）可知，出水NO^-₃-N的質量濃度開始出現波動并持續增加至40.05 mg/L，在反應145 d后降低至24.99 mg/L后逐漸平穩，CIP沒有被明顯去除，表明PN/A反應器可承受質

量濃度為10 mg/L的CIP沖擊負荷，并在短時間內可恢復至出水NH⁺₄-N、NO^-₃-N質量濃度分別為0、19.56 mg/L的脫氮性能。在經過120 d左右的由低濃度到高濃度的CIP刺激下，PN/A反應器對CIP的耐藥性逐漸增強，隨著時間的延長各階段的恢復期縮短，系統表現出了良好的脫氮性能。

2.2 溶解性微生物產物

SMP是一種水溶性的異構復合體，主要包含腐殖質、蛋白質、多糖等，廣泛的存在于污水處理系統中^［11］。圖3是PN/A工藝4個運行階段的SMP三維熒光光譜圖。其中，圖3（a）是第Ⅰ階段（未投加CIP）在不同E_x、E_m處有2個特征峰，分別是A峰（E_x=270～290 nm，E_m=350 nm）和B峰（E_x=210～230 nm，E_m=425 nm），分別屬于色氨酸類和芳香類蛋白質類物質。相較于圖3（a），圖3（b）是第Ⅱ階段（CIP 的質量濃度為0.1 mg/L），在E_x、E_m分別為250～290、350 nm和200～220、425 nm 處各有1個特征峰，屬于腐殖酸類物質，由于腐殖酸類物質與細胞外酶可以形成穩定的復合物，因此可以抵抗熱變性、脫水和蛋白水解。SMP中腐植酸類物質能夠對活性酶提供更好的保護，保證酶的活性^［12］。圖3（c）中C、D、E峰是第Ⅲ階段（CIP 的質量濃度為5 mg/L），相對強度分別為382.17、77.19和159.52，而在圖3（d）（CIP 的質量濃度為10 mg/L）中，3個峰的相對強度分別增大至979.84、149.86和431.56，可能是在高濃度抗生素的刺激下微生物的代謝作用逐漸增強所致。為了抵抗毒性物質的脅迫作用，PN/A反應器產生更多的微生物產物，以強化、恢復和穩定系統的性能。

2.3 微生物細胞活性及毒性響應

在不同濃度的CIP刺激下微生物細胞活性氧（ROS）水平和乳酸脫氫酶（LDH）釋放量的變化如圖4所示。從圖4（a）中可以看出，ROS水平與CIP濃度呈正相關，ROS水平增大會引起細胞的凋亡^［13］。由于一般好氧菌有內源性的抗氧化系統來處理活性氧的不良影響， 因此在質量濃度為5 mg/L的CIP刺激下不會產生過多的ROS，然而，更高濃度的CIP則刺激更多活性氧的產生。當CIP的質量濃度大于10 mg/L時，細胞分泌過多的ROS，破壞細胞抗氧化系統，消耗大量內源性抗氧化劑，導致細胞大量凋亡，ROS開始攻擊蛋白質、酶和DNA，使整個AOB菌和AnAOB菌的代謝相關酶失活，影響PN/A反應器的脫氮效能^［14］。

微生物細胞在受到抗生素的刺激后會向外界釋放LDH， 根據LDH的含量可以判斷細胞膜是否被破壞， 因此LDH含量也是細胞毒性評價的指標。如圖4（b）所示，LDH含量隨著CIP的濃度增加并沒有明顯的變化，系統中微生物細胞的完整性可以得到修復，說明PN/A反應器中的微生物隨著時間延長逐步對CIP具有耐藥性和恢復脫氮效率的能力。

2.4 微生物群落結構特征

采用16SrRNA擴增子測序技術對不同實驗階段的微生物樣品進行檢測，得到微生物群落結構及相對豐度如圖5所示。從圖中可以看出，在不同濃度的CIP刺激下，PN/A反應器中微生物的生長環境發生變化，從而引起4個階段的微生物群落結構發生變化。

如圖5（a）所示，在微生物門水平主要門分別為變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、綠彎菌門Chloroflexi和擬桿菌門Bacteroidetes。這4種優勢菌種的比例從第Ⅰ階段到Ⅳ階段呈上升趨勢。其中，綠彎菌門屬于兼性厭氧菌^［15］，其相對豐度從第Ⅱ階段的16.5%下降到第四階段的10.1%。變形菌綱的相對豐度由第Ⅱ階段的18.4%增加到第Ⅲ階段的38.3%，而發育期末期則下降到24.4%，通過利用細菌分泌的胞外聚合物增強生物膜結構，提高抵抗抗生素脅迫作用的能力。此外，浮霉菌門的相對豐度從11.8%（第Ⅱ階段）增加到23.9%（第Ⅳ階段）。浮霉菌門屬于革蘭氏陰性菌，是一種厭氧菌，多生長在淡水區域且大多數細菌具有脫氮功能，其中包含AnAOB菌^［16］。在CIP長期暴露下，PN/A反應器的優勢門綠彎菌門和浮霉菌門逐漸增加。另外，隨著實驗時間的增加和CIP濃度的增加，芽單胞菌Gemmatimonadota對CIP的敏感度提升，導致其相對豐度顯著降低^［17］。

在屬水平上，假絲酵母菌屬Candidatus Kuenenia作為典型的AnAOB菌，在PN/A反應器中為優勢菌（見圖5（b））， 其相對豐度在第Ⅱ階段為12.6%，在第Ⅲ階段下降至4.6%，在第Ⅳ階段略有上升至9.4%。典型的AOB菌屬Nitrospira也在反應器中被發現，相對豐度在第Ⅲ階段為3.4%，在第Ⅳ階段結束時降至1.3%。

3 結論

本文中選用CIP作為典型抗生素，對PN/A反應器處理含抗生素的高氨氮廢水時的脫氮性能進行研究，并評價了不同濃度的環丙沙星對PN/A反應器中微生物群落的毒性影響，得到以下主要結論：

1）在CIP的長期刺激下，PN/A反應器對CIP顯現出一定的耐藥性，各實驗階段的恢復期縮短，系統具有長期穩定的脫氮性能。

2）在CIP的抑制作用下，溶解性微生物產物的主要成分是腐殖酸類和蛋白質類物質，通過增強微生物的代謝作用來抵抗CIP的脅迫作用，強化、恢復并穩定PN/A反應器的脫氮性能。

3）高濃度的CIP會刺激細胞產生更多ROS，而LDH可以穩定釋放，保證了微生物具有恢復脫氮效率的能力。

4）CIP對PN/A反應器的微生物群落結構有明顯影響，優勢菌種的增多保證了系統脫氮性能的穩定性。

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（責任編輯：于海琴）