PI3K/Akt/mTOR信號通路在肝細胞癌中的作用機制研究進展

王帥，李濤，袁勝濤

中國藥科大學藥物科學研究院（江蘇省新藥篩選重點實驗室），江蘇南京 210009

原發性肝癌主要分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內膽管癌；其中，HCC 占發病總數的80%～90%，具有病死率高、發現時間晚、治療效果差等特點[1]。目前，HCC 是第6 大常見癌癥及第4 大癌癥相關死亡因素，主要誘因包括酒精濫用、糖尿病、肥胖、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黃曲霉毒素 B1、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）及非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），上述誘因可促進肝臟炎癥發展成為肝纖維化和肝硬化，誘導肝細胞發生凋亡和氧化應激，蛋白表達水平發生變化，DNA 出現損傷，最終導致癌變的發生[2]。近年來，研究發現磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路與HCC 的發生發展密切相關。本文綜述PI3K/Akt/mTOR信號通路在HCC 中的作用機制研究進展，以期為HCC 的藥物研發提供理論依據。

1 HCC 的誘因概述

截至1990年，全球肝癌發生率增加114%。其中，美國、澳大利亞、英國等社會人口指數高的國家，其肝癌的增長率尤為明顯。隨著HBV 疫苗和HCV 抗病毒藥物的不斷研發，發達國家由HBV、HCV 感染所致的HCC 發病率顯著下降[3]；但酒精濫用、NAFLD 及NASH 引起的HCC 發病率不斷升高。研究預測到2030年，美國的NAFLD 和NASH 發病率將分別增加21%和63%，成為HCC 的最主要誘因之一[4]。

2 PI3K/Akt/mTOR信號通路參與HCC 發生發展的分子機制

PI3K/Akt/mTOR信號通路作為細胞內主要的信號通路之一，廣泛參與調控細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡、代謝、血管生成過程。受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinasee，RTK）是單層高親和性細胞表面受體，其配體包括生長因子、細胞因子和激素。當其與配體結合后，RTK 被活化而發生自磷酸化，繼而發生受體二聚化，活化的RTK 通過招募PI3K，在內膜上磷酸化磷脂酰肌醇，進而活化下游的PI3K/Akt/mTOR信號通路。在HCC 中，RTK 的紊亂導致該信號通路過度活化，誘導脂代謝異常和細胞自噬過程，導致HCC 的發生進展[5]。

2.1 PI3K

根據結構、底物特異性的不同，PI3K 分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。其中，ⅠA 型PI3K 是與腫瘤的發生關系最為密切的亞型。PI3K 的活化包括直接和間接2 種類型。前者指被RTK 或結合鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）的RAS 直接活化，后者指由胰島素受體底物等適配體分子間接活化[6]。活化的PI3K 磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸，生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate，PIP3），PIP3 招募3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）1 和Akt 至質膜，PDK1可磷酸化Akt 活性環中的Thr308，從而部分活化Akt。

2.2 Akt

Akt 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可廣泛參與細胞生物過程的調控。Akt 包括Akt1、Akt2、Akt3三種亞型，在人體中的分布較為廣泛[7]。Akt1 在各組織中廣泛表達，Akt2 主要表達于胰島素敏感組織，Akt3 主要分布于大腦和睪丸。三種亞型分布的差異性主要由蛋白結構域的差異所決定[8]。PDK1 和PDK2 分別磷酸化Akt 調控區域的Thr308 和Ser473，以充分活化Akt。Akt 也可被腫瘤抑制因子PTEN 調控，后者參與PIP3 去磷酸化產生磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的催化過程。完全活化的Akt 可刺激mTOR、糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、cAMP 反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）、叉頭狀轉錄因子O（forkhead transcription factors of O class1，FoxO）等下游靶蛋白，并參與脂代謝、自噬等細胞生理過程。

2.3 mTOR

mTOR 也是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與營養相關的細胞生長和增殖過程。mTOR 包括mTORC1 和mTORC2 兩類。其中，mTORC1 由mTOR、Raptor 蛋白組成，主要參與細胞生長和能量代謝過程；mTORC2 則由mTOR、Rictor 蛋白組成，主要參與細胞骨架再構建和細胞生存的調控[9]。這些蛋白作為支架蛋白參與配合物聚集和底物結合過程。兩類mTOR 分子都可與一些抑制蛋白結合負調控其活性，如mTORC1 可與PRAS40、FKBP38 結合，而mTORC2 可與XPLN 結合。

作為一類PDK2，mTORC2 可使Akt 的Ser473磷酸化以充分活化Akt 分子，活化的Akt 可進一步活化mTORC1。除磷酸化的Akt，mTORC1 的活化還需要小分子GTP 酶Rheb 的參與。正常情況下，Rheb 受到GTP 酶活化蛋白抑制劑的抑制。Akt 可抑制結節性硬化綜合征基因，進而活化Rheb，共同激活mTORC1。mTORC1 的下游效應蛋白包括4EBP1和S6K1/2，主要參與線粒體生物合成過程和信使RNA 翻譯的調控。Singh 等[10]研究發現，在HCC 患者的腫瘤組織中，mTORC1 和mTORC2 的調控出現紊亂，mTOR 功能抑制與細胞自噬活化相關，mTOR的高度活化可導致與肥胖、糖尿病、脂肪肝等相關的脂合成增加。

2.4 下游效應蛋白

GSK-3 是Akt 的底物之一，是一類普遍表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括GSK-3α 和GSK-3β兩種亞型，二者具有85%的同源性，通過抑制糖原合成酶活性參與抑制糖原合成過程[11]。Fang 等[12]研究表明，HCC 中GSK-3β 的上調與患者預后差具有相關性，采用短發夾RNA 或特異性抑制劑抑制GSK-3β 活性可降低mTORC1 活性及糖酵解過程，繼而抑制HCC 的體內生長。

CREB 作為一類轉錄因子，其Ser133 可被活化的PI3K 和Akt 磷酸化，使其二聚化而激活。CREB與真核細胞基因啟動子區的CRE 結合，調控細胞增殖、細胞凋亡、血管生成、轉移和代謝相關基因的表達。Shneor 等[13]研究發現，CREB 的高度活化與HCC 侵襲性增加、預后不良有關，與癌旁組織相比，HCC 組織中CREB 的總蛋白含量及磷酸化水平均明顯增加。缺氧條件下，敲低CREB 會抑制HCC 的體內外增殖能力和血管生成能力，增加HCC 細胞對化療藥物的敏感性。此外，過表達CREB 可促進HCC細胞的增殖、血管生成能力，且對凋亡不敏感，同時過表達CREB 可升高YAP 蛋白的表達水平，促進增殖。Park 等[14]研究顯示，p38 絲裂原活化蛋白激酶的寡核苷酸或特異性抑制劑將促進CREB 的降解，增加HCC 細胞的放射敏感性，提示CREB 在HCC患者的放射治療中具有重要作用。

FoxO 是一類轉錄因子，由FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6 組成。FoxO1 和FoxO3 作為FoxO 蛋白的主要形式，主要參與HCC 發生發展過程。Dong等[15]研究表明，異常活化的Akt 信號會抑制FoxO1的轉錄活性，抑制細胞對氧化應激損傷的保護機制。生理條件下，FoxO1 對誘導上皮間質轉化的轉錄因子和轉化生長因子-β 具有抑制作用，Akt 的高度活化會解除這一抑制作用，促進HCC 的上皮間質轉化過程，導致腫瘤發生侵襲和轉移。FoxO3 的高表達與HCC 預后不良有關。Song 等[16]研究發現，與癌旁肝組織相比，大多數HCC 組織中FoxO3 表達過高，患者伴隨較差的無疾病生存期和預后。體內外研究發現，FoxO3 敲除聯合索拉非尼治療可顯著抑制HCC中索拉非尼誘導的自噬發生過程，增加索拉非尼的治療作用，提示靶向FoxO3 有助于增強索拉非尼的治療作用[17]。

3 HCC中PI3K/Akt/mTOR信號通路參與的主要代謝過程

3.1 脂質代謝

新生腫瘤細胞需促進脂質合成過程以產生新的生物膜。因此，腫瘤的顯著代謝差異之一是脂質攝取和合成過程的增加，支持細胞生長、增殖和癌變過程。PI3K/Akt/mTOR信號通路通過多種機制促進脂質合成過程，最常見的是固醇調節元件結合轉錄因子1（sterol regulatory element-binding transcription factor 1，SREBP1）。SREBP1 是脂質代謝穩態的關鍵調控基因，參與調控脂肪酸、三酰甘油、膽固醇合成過程的相關基因表達。SREBP1 作為前體蛋白在內質網中被合成，繼而經蛋白水解暴露其氨基端而獲得轉錄因子活性。PI3K/Akt/mTORC1 信號通路參與調控SREBP1 的成熟和活化過程，進而參與對脂代謝關鍵酶的調控過程[18]。Lee 等[19]研究顯示，HCC組織中SREBP1 的表達水平顯著升高，且其高表達常伴隨更大的腫瘤面積、更高的腫瘤分級且有淋巴結轉移過程。此外，抑制SREBP1 能夠抑制HepG2肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，損害HCC 體內生長能力。

Guri 等[20]研究顯示，Akt 可通過特定位點磷酸化GSK-3 以抑制其活化，從而穩定SREBP-1。此外，活化的Akt 可抑制胰島素誘導基因2 的表達。胰島素誘導基因 2 作為肝特異性基因可抑制SREBP-1 發揮功能。mTORC2 可通過調控Akt 和SREBP-1，調節肝臟脂肪的合成過程。抑制mTORC2 還可減少HCC 脂肪含量和腫瘤體積，提高治療效果。

3.2 細胞自噬

細胞自噬是細胞內營養物質分解的主要途徑之一，主要負責將細胞不需要的、功能紊亂的蛋白質及其他組分靶向運往溶酶體中降解。自噬體是一類與溶酶體相連的雙層膜囊泡狀結構，當這些物質被運往自噬體后，會分解產生游離的脂肪酸和氨基酸，以供細胞正常生理過程所需[21]。自噬由各種自噬相關蛋白ATG 介導，ATG 可組裝形成自噬體，與溶酶體融合最終被降解。PI3K/Akt/mTOR信號通路是自噬的主要調控通路之一。生理狀態下的mTORC1被激活后，可磷酸化UNC-51 樣激酶（unc51-like autophagy activating kinase）1 和2，以抑制自噬的發生。在缺氧或營養匱乏的條件下，細胞激活AMP活化蛋白激酶以磷酸化Raptor，Raptor 磷酸化可抑制mTORC1，導致ULK1/2 去磷酸化而活化，進而促進細胞自噬的發生。此外，當mTOR 途徑受到抑制時，GSK-3β 也可磷酸化激活ULK1，從而促進自噬的發生。

因活化ULK1 可誘導自噬的發生，而在大多數腫瘤內存在自噬抑制現象，因此ULK1 水平的升高可作為HCC 的指征之一，ULK1 的高表達與HCC 的腫瘤體積增大、患者預后生存期縮短有關。Ryu 等[22]研究發現，HepG2 細胞中敲除ULK1 可抑制腫瘤細胞的增殖，強化索拉非尼的體內外治療作用。此外，ULK1 特異性抑制劑XST-14 聯合索拉非尼可顯著抑制HepG2 體內腫瘤的生長。靶向ULK1 將為治療HCC 提供新的途徑。

4 Akt/mTOR 抑制劑治療HCC

4.1 Akt 抑制劑

Ipatasertib（GDC-0068）是一類腺苷三磷酸競爭性Akt 抑制劑，可抑制多種HCC 動物模型的腫瘤生長，對存在磷酸化-Akt 水平高、PTEN 缺失或PIK3CA基因激酶域突變的HCC 更敏感。Zhai 等[23]構建索拉非尼耐藥HCC 細胞株，發現GDC-0068 聯合索拉非尼可通過自噬途徑逆轉對索拉非尼的耐藥性，提示臨床治療HCC 可聯合應用GDC-0068、索拉非尼。然而，GDC-0068 在臨床主要用于前列腺癌和乳腺癌的治療，HCC 的臨床研究目前僅限于Doi 等[24]報道的Ⅰ期臨床研究。

Capivasertib（AZD 5363）是另一類Akt 抑制劑，與三個亞型都有一定的親和力。Davies 等[25]研究發現，AZD 5363 通過抑制Akt 磷酸化以降低FoxO3a磷酸化，導致FoxO3a 入核，促進p27 等基因的表達，從而誘導細胞周期阻滯和凋亡的發生。Zhang 等[26]研究發現，AZD 5363 以劑量和時間依賴性方式抑制Akt 下游蛋白的磷酸化，抑制HepG2 和Huh-7 細胞的增殖能力。Patra 等[27]將AZD 5363 與β-連環蛋白抑制劑FH535 聯用，發現可誘導肝細胞周期阻滯和自噬發生，明顯抑制細胞的增殖能力，為Akt 的藥物聯用提供新思路。Dean 等[28]開展AZD 5363 對進展性HCC 患者的Ⅰ期臨床試驗，結果顯示其具有良好的安全性和耐受性。

ARQ 092 和ARQ 751 是一類泛Akt 的強效變構抑制劑，通過抑制Akt、下游蛋白磷酸化及下調mTOR信號通路發揮抗腫瘤作用[29-30]。ARQ 751 已進入Ⅰb 期臨床試驗，用于包括HCC 在內的PIK3CA/Akt/PTEN 突變的實體瘤治療（NCT02761694）[30]。

MK-2206 同是一類變構性Akt 抑制劑，可抑制HCC 細胞增殖，誘導周期阻滯和凋亡[31]。MK-2206已進入多項臨床試驗，但由于安全性差而無法作為單藥使用（NCT01239355、NCT01425879）[32]。

4.2 mTOR 抑制劑

臨床mTOR 抑制劑治療HCC 多以單藥或聯合用藥的方式，常見的mTOR 抑制劑主要有第一代抗生素變構劑（Rapamycin）、第二代mTORC1/2 抑制劑（AZD 8055、MLN 0128）、第二代Akt/mTOR 雙抑制劑（MK-2206）。盡管已有臨床前研究表明雷帕霉素可抑制HCC 發展，但迄今為止，臨床試驗結果均顯示對HCC 患者無治療作用[33-34]。此外，針對第二代mTOR 抑制劑的臨床試驗也未通過。

5 小結與展望

大量已有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在HCC 的發生發展中發揮關鍵作用，超過半數的HCC 中發現PI3K/Akt/mTOR信號通路的蛋白表達水平升高，其異常活化會影響包括細胞增殖、代謝、腫瘤分化、脂代謝、自噬、上皮間質轉化等細胞生理過程。由于上述代謝活動具有相關性，當前一線的酪氨酸激酶抑制劑主要是PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑，然而其治療作用有限，眾多患者最終會因藥物耐受而無藥可用。因此，面對越來越多的HCC患者，當務之急是找到更加安全有效的治療藥物，以延長患者的生存期，提高患者的生存質量。深刻理解PI3K/Akt/mTOR信號通路與其他信號通路的交聯及反饋適應機制，對于有效的小分子抑制劑開發至關重要。此外，通過鑒定患者的基因型進行個體化精準治療、利用患者癌組織培養類器官以進行藥敏試驗或新型液體活檢技術的開發都將為攻克HCC提供新的思路。這些新技術的共同目標都是減少治療手段的毒副反應、提高患者的生存質量。