基于細胞膜損傷機制的抗菌肽結構優化研究進展

張良 潘瀅浩 袁瑜 黃波 孟廣鵬 李元波 周琳

摘要：抗菌肽相比傳統抗生素，具有廣譜殺菌、對多重耐藥菌有效、生物相容性好等優點。近年來，抗菌肽獨特的細胞膜靶向作用機制得到了深入研究，基于此機制上的結構優化策略也成為了近期研究熱點。本文主要針對抗菌肽的細胞膜損傷機制展開，就近期通過氨基酸替換、線性肽成環、化學修飾、多聚化、抗生素偶聯以及復合材料制備等手段對抗菌肽結構予以優化的研究進展進行了總結，期望對抗菌肽設計與改構研究提供思路。

關鍵詞：抗菌肽；臨床前研究；結構優化

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Research progress on structure modification of antimicrobial peptides targeting membrane disruption

Zhang Liang1， Pan Yinghao2， Yuan Yu2，3， Huang Bo2， Meng Guangpeng2， Li Yuanbo2， and Zhou Lin1

（1 Chengdu Institute For Drug Control， Chengdu 610045; 2 Chengdu Sintanovo Biotechnology Co.， Ltd.， Sichuan Province， Chengdu 610000; 3 College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000）

Abstract Comparing to traditional antibiotics， antimicrobial peptides （AMPs） have the advantages of broad spectrum antibacterial activity， active against multidrug resistant bacteria and good biocompatibility. The unique cell membrane targeting mechanism of AMPs has been studied in depth， and the structure optimization strategies based on this basis have become hotspots in recent years. In this paper， we focus on the research progress of optimization strategies based on the membrane damage mechanism of AMPs， including amino acid replacement， peptide cyclization， chemical modification， polymerization， antibiotic conjugation， combined materials， et al. We expect this review to provide ideas on design and modification in the development of AMPs.

Key words Antimicrobial peptides; Pre-clinical research; Structure optimization

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs），有時也被稱為宿主防御肽（host defense peptides， HDPs），是一種小分子多肽，通常由不到50個氨基酸殘基組成。抗菌肽具有廣譜的抗微生物活性，除了抗菌活性外，對真菌、寄生蟲與病毒也有活性[1-3]，此外，抗菌肽也被發現具有其他多種生理功能，如免疫調節、促血管形成、促傷口愈合和抗腫瘤活性等[4-7]。天然抗菌肽來源廣泛，除了人體外，在動物、植物、細菌、真菌乃至古生菌與原生動物中均發現了天然的抗菌肽[8]。目前已經報道了超過4000種抗菌肽[9]，其中大多數為帶有正電荷、具有一定疏水性基團的兩親性多肽，主要通過影響細菌細胞膜發揮抗菌作用。抗菌肽的構象多樣，可以是α-螺旋、β-折疊，線性延展或無規則卷曲，也可以是環肽或上述多種構象的混合，但大部分抗菌肽的構象為α-螺旋或β-折疊。由于當今微生物對傳統抗生素的耐藥性越來越強，臨床對新型抗菌藥物需求急切，而抗菌肽因為具有與傳統抗生素所不同的抗菌機制，成為了一種擁有巨大潛力的新型抗菌分子類別，在近年來受到了廣泛關注，并且在細菌感染、傷口愈合與炎癥治療等方面都具有臨床應用前景[10-11]。本文從傳統抗生素與抗菌肽的抗菌機制出發，分析了抗菌肽基于細胞膜損傷機制的抗菌構效關系，并對近年來基于細胞膜損傷機制的一些抗菌肽結構優化策略研究進展進行了介紹。

1 傳統抗生素與抗菌肽的抗菌機制

傳統抗生素通常是通過5種途徑實現對病原細菌的攻擊[12]：①抑制細菌細胞壁的合成（β-內酰胺類抗生素等）；②抑制細菌蛋白質合成（紅霉素等）；③直接或間接抑制核酸（DNA/RNA）的合成或復制（利福霉素、磺胺類抗生素等）；④靶向細胞膜（多黏菌素等）；⑤前4種機制與抗生素誘導的應激反應協同作用，如DNA修復的SOS應答氧化應激等（β-內酰胺類抗生素等）。而針對上述作用機制，具有抗藥性的細菌進化出了對應的抗生素抵抗機制[13-15]：①產生使抗菌藥物失活的酶（針對β-內酰胺抗生素等）；②通過外排泵將抗生素泵出菌體外（針對紅霉素等）；③改變原本對抗生素的作用靶位（針對β-內酰胺抗生素等）以及降低細菌細胞膜通透性、改變代謝通路等機制。面對具有多種耐藥機制的超級細菌，傳統抗生素的抗菌效果大大降低。

抗菌肽的抗菌機制主要通過細胞膜與細胞內兩種途徑實現[15-16]。抗菌肽的細胞內途徑與傳統的抗生素作用機制相似，主要通過與細菌細胞內的各種大分子相互作用而影響細胞功能來實現，如影響核酸復制、蛋白質合成、影響酶活性和細胞壁生成等[15-16]。

細胞膜途徑是抗菌肽的主要抗菌途徑，也是其與傳統抗生素不同的特有途徑。帶有正電荷的抗菌肽與細菌帶有負電荷的細胞膜通過靜電吸附相結合，聚集在細菌細胞膜表面；抗菌肽兩親性結構中的疏水部分與細胞膜磷脂相互作用，破壞細菌的細胞膜，導致細胞死亡，從而實現抗菌。對于抗菌肽與細菌細胞膜的相互作用機制，目前還無法完全闡明，有多種常見的模型假說[16]，如桶-板模型、環-孔模型、地毯模型和聚集模型。在桶-板模型中[17]，隨著抗菌肽在細胞膜表面聚集，其垂直插入脂質雙分子層中，疏水部分朝外，親水部分朝內形成通道，致使細胞內物質流出；環-孔模型與桶-板模型相似[17]，不同的是在環-孔模型中抗菌肽的疏水部分與細胞膜脂質層相結合，共同環繞著含有抗菌肽親水部分的孔洞；在地毯模型中[18]，抗菌肽完全平行覆蓋在細胞膜表面，隨著抗菌肽不斷聚集，細胞膜磷質層穩定性降低，最后完全被抗菌肽覆蓋并破裂；在聚集模型中[19]，抗菌肽與細胞膜相互結合，覆蓋細胞膜導致其破裂的同時也形成導致細胞內物質泄漏的孔道，這些孔道會進一步幫助抗菌肽進入細胞內，實現與傳統抗生素分子相似的對核酸、蛋白質、酶等合成進行抑制的功能。無論是哪種模型，抗菌肽都能夠使細胞膜穿透性大大增加，導致細胞溶解、胞內物質流出，引發細胞死亡。抗菌肽通過細胞膜途徑引發細菌細胞死亡的生物活性與其結構密切相關，對抗菌肽的結構特點上的研究已經有了一定成果。

2 抗菌肽的結構-生物活性關系

抗菌肽的抗菌活性與其結構聯系緊密，這種基于細胞膜損傷機制的抗菌活性為抗菌肽結構修飾優化提供了方向，其中在結構上對抗菌活性影響較大的幾個因素包括電荷數、疏水性、螺旋度與兩親性等。

適當增加抗菌肽的正電荷數能夠提高其抗菌活性[20]。絕大部分抗菌肽在中性pH下都為陽離子型，帶正電荷，以此通過靜電相互作用附著在細菌帶負電的細胞表面。此外，正電荷還能夠使抗菌肽與細胞膜脂多糖上的Ca2+、Mg2+結合位點結合，深入細胞膜內部，進一步破壞細胞膜結構[21]。細菌細胞的脂質膜作為抗菌肽作用的主要靶點，抗菌肽的疏水性對其與脂質膜的相互作用有著重要影響。通過引入疏水性殘基，提高抗菌肽的疏水性，可以提高其抗菌活性。但過強的疏水性也會引發抗菌肽的自我聚集，降低其溶解度與抗菌活性[22]。大多數的抗菌肽有著α-螺旋的二級結構，抗菌肽在α-螺旋下能夠更好地與細胞膜相結合，因此抗菌肽的螺旋度被認為與其抗菌活性有較強的相關性[22]。最后，兩親性是絕大多數抗菌肽具有的特性，其本身也是抗菌肽在電荷數與疏水性上取得平衡的結果，意味著抗菌肽既能夠通過親水域的靜電作用吸附在細胞膜，也可以通過疏水域與細胞膜的相互作用滲入膜結構中，呈現抗菌活性。

3 抗菌肽的近期臨床前結構優化研究進展

針對上述幾個方面，通過優化抗菌肽的氨基酸序列能夠改善其抗菌活性。此外，其他的化學修飾手段，如C端酰胺化、N端乙酰化、訂合成環（利用小分子連接子，共價交聯不同位置氨基酸的側鏈，提高多肽穩定性等屬性）、烷基鏈引入等方法[23-24]也被廣泛應用于抗菌肽結構改造，以此達到高抗菌活性、提高多肽穩定性和降低溶血毒性等目的。下文將會介紹近年來通過疏水性、正電荷調整和其他化學修飾手段對抗菌肽進行優化的臨床前研究進展。

3.1 氨基酸替換

對抗菌肽序列中的氨基酸進行替換、優化，以此調控多肽電荷、疏水性和二級結構等屬性，從而實現更好的抗菌效果、更低的毒性或更高的穩定性，一直是抗菌肽臨床前研究中的主要內容。Nibbering等[25]通過對人源抗菌肽LL37上C端的24個氨基酸序列進行隨機替換和計算機活性預測，再將序列中的谷氨酰胺替換為陽離子的賴氨酸或精氨酸，提高其正電荷數和螺旋度，篩選合成了25個多肽衍生物，其中的抗菌肽SAAP148對多種多重耐藥菌都具有良好的抗菌效果，其在50%血漿中對金黃色葡萄球菌的99.9%殺菌濃度LC99.9可達1.6～12.8 μmol/L，而改構原型LL-37的相應LC99.9則要大于204.8 μmol/L。SAAP148在血漿中的殺菌效果優于多種臨床前和臨床研究階段的抗菌肽抑菌水平。

Deber等[26]從稀有的含連續多個陽離子氨基酸序列的天然抗菌肽出發，設計合成了含有“陽離子簇”的抗菌肽6K-F17，通過改換賴氨酸位置改變該多肽電荷分布，調整其兩親性，以探究兩親性對生物活性的影響。研究發現，雖然電荷分布更平均、兩親性更好的結構具有更高的抗菌活性，但對人體正常細胞的毒性也會隨之增加，且抗酶解穩定性也會下降。N端含有連續6個賴氨酸，正電荷集中的6K-F17破壞細菌細胞膜能力強，對人細胞毒性低，有著更好的抗菌選擇性。6K-F17對銅綠假單胞菌的MIC為3.1～25 μmol/L，而6個賴氨酸分散在多肽序列中的1K-5K抗菌肽的相應MIC則為25～>50 μmol/L。6K-F17也擁有更低的毒性和更好的多肽穩定性，在其40 μmol/L濃度下未觀察到細胞溶血，且在血漿中保留24 h后抗菌肽含量依然無減少。

倪京滿等[27]基于蜂毒抗菌肽anoplin設計合成了一系列疏水或親水氨基酸替換的短鏈衍生物，對衍生物的生物活性與其正電荷、疏水性、兩親性和二級結構間的關系進行分析，發現這些衍生物的陽離子氨基酸與疏水氨基酸各自分布在α-螺旋二級結構的疏水面與親水面上。作者總結了抗菌肽衍生物疏水性分別對革蘭陰性和陽性菌抗菌活性的影響，篩選出了具有最高抗菌活性和低毒性的抗菌肽A-21，其對金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的MIC95可達4～8 μmol/L，優于anoplin的256～512 μmol/L；同時A-21的最低溶血濃度MHC（抗菌肽引發10%人血紅細胞溶血所需濃度）為134.38 μmol/L，溶血毒性較低。

單安山等[28]利用組氨酸側鏈上亞胺pH敏感的質子化性質，以北非蝎子毒素中的抗菌肽AaeAP2a為模板，使用組氨酸替代賴氨酸設計并篩選出了具有酸性pH響應能力的抗菌肽F5。抗菌肽F5在pH 7.4的生理pH下對革蘭陰性菌的殺菌能力微弱，MIC>64 μmol/L，而在pH 6.5的微酸性pH下相應抗菌活性明顯增強，MIC可達2～16 μmol/L。此外，模板AaeAP2a在pH 7.4或6.5時MHC為16或2 μmol/L，而F5的MHC要大于128 μmol/L。 在膿腫環境下，F5可以有效殺傷處于酸性pH中的有害細菌，同時避免了對正常生理pH中有益共生菌的傷害。

3.2 線性肽成環

除了常規的氨基酸替換優化方法，將線性肽通過二硫鍵、訂合等方法成環的手段在提高抗菌肽活性、穩定性等方面也有著廣泛應用。賴仞等[29]以金環蛇毒中的抗菌肽衍生物cathelicidin-BF15為基礎，使用色氨酸與賴氨酸替換原多肽中的所有苯丙氨酸、絲氨酸和亮氨酸，再插入半胱氨酸（Cys）成環，得到了具有保留強效抗菌活性、低溶血性的同時具有更高穩定性的抗菌肽ZY4，其對具有多重耐藥性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌引起的MIC可達0.8～4.0 μmol/L；而ZY4的MHC大于320 μg/mL，溶血毒性較低。此外，在血漿中保存10 h后，ZY4依然有91%保持結構穩定。

Walensky等[30]對天然抗菌肽蛙皮素II進行訂合修飾，篩選了不同位點的i+4與i+7（將i與i+4或i與i+7位兩個氨基酸的側鏈連接）訂合肽，對比其抗菌活性與紅細胞溶血度，并對不同位點訂合的抗菌肽疏水面進行分析，結合計算機輔助設計了抗菌肽篩選算法。通過算法確定在15位氨基酸訂合后，再根據算法使用賴氨酸掃描在9位將丙氨酸替換為賴氨酸（A9K），使其在25 μg/mL濃度時的細胞溶血由13%降低到3%。之后作者再對已有訂合肽在細胞膜上形成環-孔的具體機制進行了分析，以完善算法。作者進一步在Mag（i+4）15（A9K）的基礎上，在1位氨基酸上增加一處訂合以提高穩定性，最后對剩余位點氨基酸進行替換調整，通過算法幫助篩選出了具有最優的抗多重耐藥菌活性、低溶血性、低毒性和高穩定性的雙訂合抗菌肽Mag（i +4）1，15 （A9K， B21A， N22K， S23K），其對銅綠假單胞菌的MIC可達1.56 μg/mL，而篩選前Mag2抗菌肽的相應MIC則大于50 μg/mL。

3.3 非氨基酸結構引入的化學修飾

向多肽中引入非氨基酸結構（如脂肪鏈等）來實現對抗菌肽性能的調控也是常用的方法之一。Kamysz等[31]將C2-C14烷基鏈或芳香環引入人源抗菌肽LL37的片段肽KR12-NH2的N端，以研究這種親脂性修飾對抗菌活性和溶血性的影響。研究發現，在適當長度范圍（C6-C12）內，N端烷基鏈修飾能夠增加KR12-NH2的抗菌活性；但過長烷基鏈修飾（C14）的多肽會自組裝為更大的聚集結構，反而會導致抗菌活性下降。經過對比，抗菌活性與溶血性取得平衡的最優結構為C8烷基鏈N端修飾的抗菌肽C8-KR12-NH2，其對于金黃色葡萄球菌的MIC可達2～4 μg/mL，而無烷基鏈修飾的Ac-KR12-NH2相應MIC大于256 μg/mL。同時，C8-KR12-NH2的MHC為64 μg/mL，而更長烷基鏈（C10-C14）修飾的KR12-NH2在相同濃度下則會引發85%～100%的細胞溶血。

3.4 單體多聚化

將單體抗菌肽二聚化或多聚化對擴展廣譜性、提高抗菌活性和穩定性都有一定幫助，是一種有效的修飾手段。Wade等[32]通過二硫鍵、二甲苯或全氟苯連接Cys的方法，對先期研究中通過各種化學修飾手段得到的富脯氨酸抗菌肽Chex1-Arg20進行了二聚化。研究發現，使用四氟苯和八氟聯苯連接的抗菌肽二聚體對多重耐藥的鮑曼不動桿菌ATCC19606和FADDI-AB156的抗菌活性分別可達5 μg/mL和13.5 μg/mL，而Chex1-Arg20單體的相應抗菌活性為200 μg/mL和大于250 μg/mL。此外，Chex1-Arg20二聚體還被發現能夠緩解細菌感染引發的炎癥和提高宿主先天免疫。

3.5 抗菌肽與小分子抗生素偶聯

將抗菌肽與小分子抗生素通過連接子進行共價偶聯，利用抗菌肽靶向細菌細胞膜，再切斷抗菌肽與抗生素間的共價連接釋放活性小分子抗生素，能夠同時結合小分子的細胞內殺菌功能與抗菌肽的廣譜殺菌和針對多重耐藥菌的高活性特點，獲得比以上兩者單純聯用更好的抗菌效果。Matsuzaki等[33]在爪蟾抗菌肽類似肽9P2-2和富脯氨酸抗菌肽oncocin兩種多肽的C端與N端分別引入Cys，再通過二硫鍵或硫醚鍵與氨芐西林衍生分子共價連接，得到了可切斷或不可切斷的抗菌肽-小分子抗生素偶聯分子。通過篩選發現，9P2-2在N端引入Cys后再通過二硫鍵連接氨芐西林衍生分子的偶聯分子Amp-SS-9P2-2在抗革蘭陰性菌的活性上有著顯著提高。針對具有耐藥性的鮑曼不動桿菌，Amp-SS-9P2-2的MIC可達2.5 μmol/L，低于單獨使用氨芐西林時的320 μmol/L或單獨使用9P2-2的10 μmol/L，而同劑量的氨芐西林與9P2-2單純聯用時MIC也只能達到10 μmol/L。

3.6 與其他材料聚合

將抗菌肽與其他材料相聚合，形成復合材料，可以突出抗菌肽的廣譜抗菌優勢，彌補其價格較昂貴、具有潛在毒性等缺陷，并同時實現其他材料的功能。程飚等[34]將抗菌肽cecropin通過端基與側鏈的氨基與透明質酸（HA）的羧基通過縮合反應結合，再與氧化葡萄糖（ODEX）和富血小板血漿簇（PRP）通過席夫堿交聯制成水凝膠ODEX/HA-AMP/PRP，用以幫助慢性感染的傷口愈合。這種包含抗菌肽在內的多組分水凝膠將各組分功能整合，在包裹傷口后可以緩慢釋放抗菌肽和PRP，通過抗菌肽消殺細菌緩解炎癥，通過PRP促進膠原增殖收縮和血管生成。在糖尿病傷口感染的小鼠模型中，ODEX/HA-AMP/PRP明顯抑制了傷口處的細菌生長，處理3d時傷口處的銅綠假單胞菌和金黃葡萄球菌數量為106數量級，明顯優于單純紗布包扎處理情況下的108數量級；ODEX/HA-AMP/PRP也加快了傷口愈合速度，處理14 d的傷口面積減小為開始的10%左右，明顯優于單純紗布包扎處理情況下的50%。

3.7 引入納米載體

最后，使用納米載體加載抗菌肽用于體內遞送，能夠克服抗菌肽的酶解不穩定性和脫靶毒性等缺點，從而提高抗菌肽的藥代動力學與藥效數據[35]。Lee等[36]使用DSPE-PEG修飾HnMc抗菌肽中Cys的側鏈巰基，再將修飾后的DSPE-PEG-HnMc與PLGA-PEG以質量比2： 8共同自組裝，形成了平均粒徑為60 nm的HnMc納米膠束。該納米膠束中，疏水的PLGA與DSPE被包裹在膠束中心，親水的PEG和HnMc抗菌肽分布在表面，因而可以主動靶向并破壞細菌的細胞膜；而同在膠束表面的PEG鏈則可以保護HnMc抗菌肽免受非特異性蛋白的吸附和降解。HnMc納米膠束在0.1 mg/mL的濃度下也能夠對耐藥的銅綠假單胞菌和金黃葡萄球菌實現80%的生長抑制效果；HnMc納米膠束的MHC為1 mg/mL，毒性較低；在耐藥銅綠假單胞菌肺部感染的小鼠模型中，HnMc納米膠束成功延長了小鼠的生存時間，在2.5 mg/kg劑量下生存時間由不經處理的6 d延長到16 d以上。

上述研究中所涉及的氨基酸序列及修飾手段總結可見表1。除了以上提及的氨基酸替換或化學修飾手段外，使用D構型或其他非天然氨基酸替換、聚乙二醇或糖基化修飾等方法均為抗菌肽結構優化常見思路[12，37]。

4 結論與展望

本文主要綜述了抗菌肽作用機理、結構優化思路和近年來的臨床前研究進展。相較于傳統抗生素，抗菌肽主要針對細胞膜的作用機制在抗菌廣譜性與抗多重耐藥性上具有明顯優勢。通過多種修飾手段對抗菌肽進行結構優化的思路，如化學修飾和計算機輔助篩選等方法，在抗菌肽研究中已經得到了廣泛應用。盡管上述結構優化手段在臨床和產業化階段應用還未全面推廣，但隨著針對耐藥菌的新型抗菌藥物需求的不斷增大，具有廣譜性、對耐藥菌高活性和高生物相容性優點的抗菌肽將來必然會成為臨床研究熱點。

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