耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌的藥敏及分子特征分析

王燕 王云英 蔣敏 張雨虹 任艷麗 孫濱

摘要：目的 分析鼠傷寒沙門菌的耐藥情況及分子特征，為臨床治療和感染防控提供依據。方法 對我院分離的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001，采用VITEK2-Compact全自動微生物分析系統和K-B紙片法對藥敏結果進行檢測。通過全基因組測序分析其基因和分子特征，并進行質粒接合試驗，研究質粒的可轉移性。利用碳青霉烯酶表型試驗檢測其實所含的碳青霉烯酶類型，PCR確認其攜帶的耐藥基因，質粒復制子分型確定質粒類型。結果 該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001對除氨曲南之外的青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，全基因組測序分析表明其為ST34型鼠傷寒沙門菌，含有blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多種耐藥基因。攜帶的質粒類型為IncHI2，blaNDM-5位于該質粒上，可通過水平轉移，結合子獲得了與鼠傷寒沙門菌完全一致的耐藥結果。3種碳青霉烯酶表型試驗均正確識別出了其攜帶碳青霉烯酶的類型為金屬β-內酰胺酶。結論 碳青霉烯耐藥鼠傷寒沙門菌對感染治療和預防控制帶來了新的挑戰。新發現的IncHI2-blaNDM-5質粒存在向其他細菌物種橫向傳播的風險。

關鍵詞：鼠傷寒沙門菌；碳青霉烯耐藥；表型檢測；質粒復制子分型；IncHI2-blaNDM-5

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

The resistance pattern and molecular characteristics

of carbapenem resistant Salmonella typhimurium

Wang Yan， Wang Yunying， Jiang Min， Zhang Yuhong， Ren Yan-li， and Sun Bin

（Department of Laboratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400010）

Abstract ? ?Objective To analyze the resistance pattern and molecular characteristics of carbapenem resistant Salmonella typhimurium， and provide evidence for clinical treatment and infection prevention and control. Methods ? The antibiotic susceptibility testing of carbapenem resistant Salmonella typhimurium CYEY-S001 isolated from our hospital was performed by VITEK2-Compact automatic bacterial analysis system and the K-B disk method. The gene and molecular characteristics were analyzed by whole genome sequencing （WGS）， and the conjugation test was carried out to study the transferability of the plasmid. Carbapenemase phenotypic assays were used to detect the carbapenemase type. PCR was used to confirm the resistance genes， and plasmid replicon typing was used to determine the plasmid type. Results The Salmonella typhimurium CYEY-S001 was resistant to penicillins， cephalosporins and carbapenems except for aztreonam. The WGS analysis showed that the Salmonella typhimurium CYEY-S001 belonged to the ST34 type， which contained blaNDM-5， aac（6）-Iaa， floR， cmlA1， sul3 and tet（A） resistance genes. The Salmonella typhimurium CYEY-S001 contained IncHI2 plasmid， on which blaNDM-5 was located. The antibiotic susceptibility results of the transconjugant were completely consistent with the Salmonella typhimurium CYEY-S001. The three phenotypic tests correctly identified the type of carbapenemase as metal β-lactamase. Conclusion ?Carbapenem resistant Salmonella typhimurium presents new challenges for infection treatment， prevention and control. The newly IncHI2-blaNDM-5 plasmid has the risk of horizontal transmission to other bacterial species.

Key words Salmonella typhimurium; Carbapenem-resistant; Phenotypic assay; Plasmid replicon typing; IncHI2-blaNDM-5

沙門菌是全球食源性疾病的主要原因之一，沙門菌感染已成為一個重大的公共衛生問題，對衛生系統造成了越來越大的經濟負擔[1]。據估計，全球每年約有9380萬胃腸炎病例和15.5萬例死亡歸因于非傷寒沙門菌，它是引起人類細菌性腸炎的常見原因。在眾多非傷寒沙門菌血清型中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是引起人類沙門菌病的兩種最常見的血清型[2]。近年來，鼠傷寒沙門菌的耐藥率一直在增加，多重耐藥的鼠傷寒沙門菌給臨床治療帶來了困難，導致發病率和死亡率增長[3]。碳青霉烯類抗生素通常被認為是治療多重耐藥細菌感染的最有效抗菌藥物，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用和碳青霉烯酶的水平傳播，耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌也偶有檢出[4-5]，對有效治療和感染控制帶來了新的挑戰。本研究結合表型和基因組數據，對分離到的耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌的藥敏譜和分子特征進行了分析，并驗證了攜帶碳青霉烯耐藥基因的質粒可通過水平轉移，為評估其傳播風險和開展疾病監測防控提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

在一個白血病患者的腹瀉大便樣本中，分離出一株碳青霉烯耐藥的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001。該菌通過毅新博創飛行時間質譜系統進行鑒定，進一步的沙門菌血清型測定按照Kauffmann-White方案進行[6]。利福平耐藥的大腸埃希菌EC600作為接合試驗的受體菌。利用VITEK2-Compact全自動微生物分析系統進行細菌藥敏試驗，并通過K-B紙片法對藥敏結果進行復核，結果按照2020版美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）規則和標準判定[7]。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要儀器和試劑

哥倫比亞血平板和MH平板（美國賽默飛公司）；沙門菌屬診斷血清（寧波天潤生物藥業有限公司）、抗菌藥物紙片、MH瓊脂和TSB肉湯（英國Oxoid公司）；Ezup柱式細菌DNA提取試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）；碳青霉烯酶表型檢測試劑盒（上海原科公司）；碳青霉烯酶檢測卡（北京金山川公司）；Clin-TOF II飛行時間質譜系統（北京毅新博創生物科技有限公司）；VITEK2-Compact自動化鑒定和藥敏系統（法國生物梅里埃公司）；PCR相關試劑（大連TAKARA公司）；PCR儀和凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細菌的全基因組測序與生信分析

全基因組測序在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。在Illumina Hiseq?平臺上進行二代測序，使用SPAdes對二代測序數據進行拼裝，然后采用GapFiller對拼接得到的contig補GAP，最后采用PrInSeS-G進行序列矯正。采用NCBI Blast+將基因蛋白序列與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多個數據庫進行比對，得到其功能注釋信息。根據基因與Swissprot、TrEMBL的注釋結果得到GO功能注釋信息。利用KAAS得到基因KEGG注釋信息。通過ResFinder 4.1分析菌株攜帶的所有耐藥基因。通過MLST 2.0檢測菌株所屬的多位點序列分型。

1.4 質粒接合試驗

挑取供體菌（鼠傷寒沙門菌CYEY-S001）和受體菌（EC600）單個菌落接種至5 mL LB培養基中，37 ℃ 200 r/min培養14 h。而后分別吸取500 ?L受體菌和供體菌，加入到4 mL LB培養基中，37 ℃ 200 r/min培養4 h后，靜置4 h。吸取混合培養菌液100 ?L，均勻涂布在含利福平（200 ?g/mL）-美羅培南（1 ?g/mL）混合抗生素的篩選MH平板上，培養18 h。挑取在篩選平板上生長疑似接合子菌落進行質譜鑒定及藥敏試驗，并進行后續基因測定。

1.5 碳青霉烯酶表型檢測試驗

采用改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）聯合EDTA-改良碳青霉烯酶滅活試驗（eCIM）檢測碳青霉烯酶表型，具體操作參照CLSI M100[8]。并根據“CHINET中國細菌耐藥監測網技術方案（2020年更新版）”，采用3-氨基苯硼酸（APB）和EDTA聯合酶抑制劑增強試驗法再次確認碳青霉烯酶類型（http：//www.chinets.com/Document）。并使用碳青霉烯酶檢測卡初步確認菌株攜帶的碳青霉烯酶。

1.6 耐藥基因檢測

在Center for Genomin Epidemioligy（http：//www.genomicepidemiology.org/）利用ResFinder 4.1對獲得的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001全基因組數據進行耐藥基因分析。并提取CYEY-S001、EC600和接合子的DNA，采用PCR方法檢測各種類型的耐藥基因，包括超廣譜β-內酰胺酶類（blaCTX-M、blaSHV、blaTEM）、頭孢菌素酶類（blaACC、blaACT、blaMOX、blaEBC、blaDHA）、碳青霉烯酶類（blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48）、氨基糖苷類（armA、rmtB、aac（6）-Iaa）和喹諾酮類（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6）-Ib-cr）。blaNDM引物序列為：F-5'- ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCC-3'，R-5'-TCAGCGCAGCTTGTCGGC-3'，PCR反應條件：95℃預變性5 min，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min。其余耐藥基因引物及擴增條件見文獻[9]。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統觀察結果。陽性擴增產物測序后經BLAST比對確認（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.7 質粒復制子分型

在Center for Genomin Epidemioligy利用PlasmidFinder 2.1對獲得的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001全基因組數據進行質粒分析。并采用基于主要質粒不相容群復制子的PCR分型（PBRT）方法，檢測FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18種Inc質粒，來確認鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和結合子攜帶的質粒類型。使用引物及PCR擴增條件參照文獻[10]。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統觀察結果。陽性擴增產物測序后經BLAST比對確認。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果及MLST分型

毅新博創飛行時間質譜系統鑒定該菌株結果為沙門菌屬，沙門血清凝集試驗結果顯示，該菌株血清型為4， [5]， 12：i：-，最終鑒定為鼠傷寒沙門菌。MLST分型比對結果顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001等位基因類型為aroC-10、dnaN-19、hemD-12、hisD-9、purE-5、sucA-9和thrA-2，屬于ST34型。

2.2 鼠傷寒沙門菌基因組信息

全基因組數據顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001的總堿基數目為5096737 bp，G+C的含量為51.9%，蛋白編碼基因數目為5088個，轉運RNA數目為75，核糖體RNA數目為7，重復區域數目為198，各數據庫對基因功能注釋結果見圖1。

2.3 接合試驗結果

在篩選平板上生長的接合子菌落經質譜鑒定為大腸埃希氏菌，該接合子對碳青霉烯類和頭孢菌素類抗菌藥物耐藥，對氨基糖苷類藥物的敏感性降低，而對氟喹諾酮類藥物保持敏感。能夠擴增出和供體菌相同的碳青霉烯酶耐藥基因，質粒分型結果與供體菌一致，提示接合試驗成功，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的含blaNDM質粒能夠進行水平傳播。

2.4 抗生素藥敏試驗結果

鼠傷寒沙門菌CYEY-S001對氨芐西林、氨芐西林舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、四環素等16種抗生素耐藥，對環丙沙星和左氧氟沙星中介，對氨曲南和阿米卡星及復方磺胺敏感。所獲得的接合子青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素藥敏結果與鼠傷寒沙門菌CYEY-S001完全一致，EC600對各種抗生素均敏感。具體藥敏結果見表1。

2.5 碳青霉烯酶表型試驗檢測結果

mCIM聯合eCIM結果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001的mCIM和eCIM均為陽性，產金屬酶（圖2）；酶抑制劑增強試驗表明，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001所產的碳青霉烯酶能夠被EDTA抑制，不能夠被3-氨基苯硼酸抑制，為金屬酶（圖3）。碳青霉烯酶檢測卡檢測結果進一步證實，該金屬酶為NDM型碳青霉烯酶（圖4）。接合試驗獲得的接合子，酶型檢測結果與鼠傷寒沙門菌CYEY-S001一致。EC600的表型試驗均為陰性。

2.6 耐藥基因檢測結果

ResFinder 4.1分析結果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多種耐藥基因。PCR檢測結果顯示，在擴增的各類耐藥基因中，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和結合子的blaNDM和aac（6）-Iaa陽性，blaNDM經測序比對分析為NDM-5（圖5）。blaNDM-5和aac（6）-Iaa兩個耐藥基因位于同一質粒上，可以從鼠傷寒沙門菌CYEY-S001轉移到受體菌上。

2.7 質粒分型結果

PlasmidFinder 2.1分析結果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的質粒類型為IncHI2。質粒復制子分型結果表明，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和接合子均能夠擴增出IncHI2質粒片段（圖6），提示IncHI2為攜帶各種耐藥基因的質粒，可通過水平傳播。

3 討論

鼠傷寒沙門菌的宿主眾多，分布廣泛，不僅可以感染動物，也可以通過受污染的食物傳播給人類，且鼠傷寒沙門菌引起的死亡率比沙門菌引起的平均死亡率高3倍[11]。不同ST型的鼠傷寒沙門菌表現出不同的生物學特性，如毒力和耐藥性。近年來，ST34型鼠傷寒沙門菌的比例逐年增加，已取代ST19成為主要流行的ST型[11]。我們分離到的這株鼠傷寒沙門菌CYEY-S001即為ST34型。藥敏結果顯示，其對除氨曲南之外的青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，基因檢測結果證實，引起耐藥的主要原因為攜帶blaNDM-5碳青霉烯酶耐藥基因。blaNDM基因編碼的NDM碳青霉烯酶屬于B類金屬β-內酰胺酶，需依賴金屬離子發揮其催化活性，能夠水解除氨曲南以外的大多數β-內酰胺類抗生素。自2009年blaNDM-1在印度發現以來，目前已經出現了近40種blaNDM基因亞型。與NDM-1碳青霉烯酶相比，NDM-5的88（纈氨酸Val→亮氨酸Leu）和154（蛋氨酸Met→亮氨酸Leu）氨基酸發生改變，導致攜帶blaNDM-5基因的菌株對碳青霉烯類抗生素、頭孢菌素的水解活性增強[12]。blaNDM基因大多數位于耐藥菌的質粒上，攜帶blaNDM基因的質粒為其進入宿主提供了有利條件，也為blaNDM基因在不同菌屬之間的傳播提供了基礎。

質粒是細菌染色體外的閉合環狀DNA片段，能夠自主復制，具有不相容性。腸桿菌目細菌攜帶耐藥基因的質粒不相容群主要有FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18種[10]。本研究顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的質粒類型為IncHI2。IncHI2質粒具有很高的柔韌性和遺傳可塑性，在抗性決定因素的獲得和傳播中起著重要作用[13]。Wang等[14]從1名餐飲工作者中分離到了1株多重耐藥的鼠傷寒沙門菌，其IncHI2質粒攜帶mcr-1、fosA3、blaCTX-M-14耐藥基因，有可能成為耐多藥食源性病原體的傳播媒介。Chen等[15]報道了某醫院呼吸護理病房一起由攜帶blaOXA-48的泛耐藥沙門菌的引起的醫院沙門菌病暴發的事件，該沙門菌同樣含有的IncHI2質粒，上面攜帶了高達15種耐藥基因。攜帶blaNDM-5的沙門菌感染也有報道，但是其blaNDM-5基因并不是位于IncHI2質粒上[8，16-17]。本課題組分離到這株多重耐藥鼠傷寒沙門菌CYEY-S001含有攜帶blaNDM-5的IncHI2質粒，為首次報道。接合試驗證實，該IncHI2-blaNDM-5質粒為自主轉移質粒，能夠攜帶耐藥基因進行水平傳播，IncHI2-blaNDM-5有可能作為耐藥沙門菌傳播的新途徑。因此進一步研究其基因環境，闡明其遺傳特征，深入探討IncHI2-blaNDM-5質粒在鼠傷寒沙門菌中傳播機制極其重要。

雖然沙門菌引起的腸炎具有自限性，但是感染碳青霉烯耐藥沙門菌后不采取有效的治療措施將會引起嚴重的后果。由于不同的酶抑制劑對不同類型碳青霉烯酶的抑制作用不同，盡早確定細菌攜帶的碳青霉烯酶種類對選擇有效抗生素進行治療具有重要的意義。基因檢測是檢測碳青霉烯酶的金標準，但是分子方法需要專業的技術人員、特殊的檢測設備、成本昂貴和眾多的潛在靶基因，限制了其在常規微生物實驗室的應用。目前，基于碳青霉烯酶特性的各種表型測定方法已被開發，包括改良Hodge試驗、Carba NP試驗、mCIM和eCIM、酶抑制劑增強試驗及商品化酶型檢測試劑盒等等，非常適合在在微生物實驗室開展。本研究選擇了mCIM聯合eCIM、酶抑制劑增強試驗及酶型檢測卡 3種表型檢測方法對鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的碳青霉烯酶進行了測定。結果顯示，3種表型檢測均正確識別出了其攜帶碳青霉烯酶的類型為金屬β-內酰胺酶，為后續臨床治療提供了有價值的信息。綜合成本、操作繁簡及其優缺點，我們推薦酶抑制劑增強試驗作為碳青霉烯酶篩查的常規方法。

由于沙門菌屬的性質，在醫療保健和社區環境中都有很大的傳播潛力。碳青霉烯耐藥鼠傷寒沙門菌的出現，對感染治療和預防控制帶來了新的挑戰。新發現的IncHI2質粒介導的blaNDM-5也存在向其他細菌物種橫向傳播的風險。深入研究IncHI2-blaNDM-5的傳播機制，早期監測碳青霉烯酶的類型，為臨床醫生合理選擇抗生素治療，控制其進一步傳播具有重要的意義。

參 考 文 獻

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