SSR分子標記兩種電泳方法在水稻品種上應用的比較

摘 要：為了研究聚丙烯酰胺電泳和毛細管電泳在水稻分子檢測中的應用，以水稻品種為材料，分別使用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測和毛細管電泳檢測，并對2種電泳進行比較分析。結果表明，聚丙烯酰胺凝膠電泳對少量樣本檢測和引物篩選時更經濟適用，毛細管電泳檢測結果適用于指紋圖譜和高通量材料的檢測分析，試驗中可以根據不同要求選擇不同的電泳方法。

關鍵詞：水稻；SSR分子標記；聚丙烯酰胺凝膠電泳；毛細管電泳

中圖分類號：S511 文獻標志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）05–00-03

水稻是人類重要的糧食作物之一，也是中國農業史上的重要里程碑之一，它不僅解決了中國糧食安全問題，還為農業現代化的發展提供了堅實的基礎。我國是世界上水稻產量最高的國家，也是稻作歷史最悠久、水稻遺傳資源最豐富的國家之一。

當下，世界上可能有超過14萬個水稻品種，科學家仍在不停地選育新稻種，水稻品種數量逐年增多，品種之間的差異性也越來越小，傳統的檢測方法難以區分眾多品種，使種子檢測工作受到一定限制。近年來，分子標記不斷發展，基因水平檢測已經廣泛用于種子領域。SSR分子標記是從DNA水平上檢測生物個體差異，具有多態性高、穩定性強、重復性好、操作簡單、技術成熟、不受環境影響等特點，可以快速區分品種，在水稻種子鑒定研究中得到了廣泛應用。

毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。通過軟件分析數據，比較其峰值差異，可以實現多樣品、多位點同時檢測，是一種高效、快速、準確的SSR標記檢測方法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術，用于分離蛋白質和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳為網狀結構，具有分子篩效應。它有非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）2種形式。

聚丙烯酰胺凝膠電泳經染色、顯影后，可以分析膠帶，是一種適用范圍比較廣的檢測方法。本實驗對毛細管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳進行了比較[1-5]。

1 材料與方法

1.1 種子發芽

隨機選取超過200粒水稻種子，放入發芽盒中，放在30 ℃光照8 h、黑暗16 h的發芽箱放置6 d左右。

1.2 DNA提取

準備96孔深孔板并在每個深孔板中放入磁珠，再隨機選取水稻幼苗單株3 cm左右，用鑷子夾住幼苗中間放入96孔深孔板中，蓋上蓋子，并寫上每個樣品登記號，放入低于-20 ℃冰箱冷凍1 h。冷凍結束放在研磨儀研磨1.5 min，用冷凍離心機離心2 min。每個孔中加入300 μL 65 ℃的提取液和150 μL的乙酸銨溶液，蓋上蓋子，再用研磨儀研磨1 min，放入4 ℃冷凍離心機離心10 min。用300 μL的移液器吸上清液200 μL至另一深孔板，并做好標記。加入400 μL的冰無水乙醇，換干凈的蓋子蓋上并充分搖勻。放入4 ℃冷凍離心機離心15 min，去掉上清，晾干，加入80～200 μL的雙蒸水，放置4 ℃冰箱保存備用。

1.3 引物篩選

選用《水稻品種鑒定技術規程SSR標記法》（NY/T 1433—014）標準中推薦的SSR引物。

1.4 PCR擴增檢測

PCR反應體系為：11 μL的反應體系包括DNA提取液2.0 μL、Buffer 1.0 μL、dNTP 0.8 μL、MgCl2 0.6 μL、正反引物各1 μL、雙蒸水4.35 μL、Taq聚合酶（0.25 μL）。

PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，31個循環；72 ℃延伸5 min。反應結束后，放入4 ℃冰箱中保存備用。經過30多個循環后，單個SSR位點特定片段可得到幾百萬倍的擴增，從而可在凝膠上顯現出來。

1.5 PCR產物檢測

1.5.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

將擴增好的產物加入2 μl溴酚藍指示劑，在3%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，用2把1.0 mm 52孔密型點樣梳點樣96個樣品；在400 V、400 mA的條件下，電泳35 min，電泳結束后，將凝膠從板子上放入盆中，加入固定液和銀染液（雙蒸水800 mL+乙酸4 mL+乙醇80 mL+1.6 g硝酸銀）染色10 min左右，顯影加入800 mL雙蒸水和12 g NaOH和4 mL的甲醛溶液搖動至顯示出清晰的條帶，最后加入水漂洗8次，沖洗凝膠上的殘留液，人工判讀。

1.5.2 毛細管電泳檢測

PCR反應程序結束后，在做好標記的PCR中加入60 μL雙蒸水，再加PCR擴增產物2～4 μL，混合離心，在96孔板中分別加入分子量內標、HIDI、稀釋混合的PCR產物2 μL，用3730XL毛細管分析儀進行電泳。得出數據用軟件分析并生成分型信息和峰圖。

2 結果與分析

2.1 2種電泳方法檢測結果的比較

毛細管電泳檢測比聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測更為精準，毛細管電泳檢測可以將相差1 bp的DNA片段分離開，各樣品中含有分子量內標可以直接與DNA片段大小相比，再通過不同的峰值圖清晰、準確地展示出來（圖1）。聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA片段是通過與已知分子量Marker進行比較，估計DNA片段的大小。水稻品種在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度譜帶如圖2所示。

2.2 2種檢測方法成本和效率的比較

第一，儀器成本比較。毛細管儀器3730XL、ZAG等儀器成本要高于聚丙烯酰胺凝膠電泳成本，毛細管電泳的試劑盒、熒光引物、耗材、儀器維護成本也略高，對實驗室的溫度、電源、潔凈度、實驗人員都有一定的要求。

第二，效率比較。毛細管電泳采用多個PCR產物混點多重電泳（圖3），提高了工作效率，縮短了電泳時間，且毛細管電泳是全自動化操作，省去了人力，也避免了人為操作的誤差，從而提高了實驗結果的可靠性。建議在實驗中可以將這2種方法有效地結合起來，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法篩選SSR標記，對少量材料進行檢測，對大量材料的檢測分析和指紋圖譜建立時用毛細管電泳檢測法完成。

3 討論

3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳變性與非變性電泳的比較

聚丙烯酰胺凝膠電泳有變性與非變性電泳，2種電泳均能檢測出目的片段，但方法不一樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳需要加變性劑，操作過程也較為復雜，制膠時要用剝離硅烷擦拭凹板，用親和硅烷擦拭平板，凹板和平板固定之后再灌膠，電泳時對PCR擴增產物要進行變性處理，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠非常薄，染色時需要黏附在膠板上進行染色，所以染色需要一塊膠一塊膠地進行，并且凝膠從玻璃板上脫離需要用NaOH浸泡，不安全也不衛生。因此，整個電泳過程時間長、效率低、不環保。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作過程相對簡單，在制膠時無需對膠板進行處理，直接組裝玻璃板灌膠，電泳時不需要對PCR擴增產物進行變性處理，染色時可以直接對凝膠進行染色，因此，檢測通量高，整個電泳檢測過程時間短、工作效率高。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法操作過程煩瑣、成本高、耗時耗力、效率低。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作簡單、污染小、成本低、經濟快速，非常適合分子標記檢測，例如，品種的純度鑒定、真實性鑒定、DNA比對、分子遺傳多樣性研究[6-7]。

3.2 不同DNA提取方法的比較

SSR分子標記DNA提取方法一般采用快提法[8]、SDS法、CTAB法、磁珠法。快提法比較簡單快速，但保存時間短，一般不超過一個星期，擴增產物在毛細管電泳檢測效果也不好，電泳受限制。SDS法和CTAB法雖然提取的DNA質量較高，但在提取過程中需要加氯仿和異戊醇，這2種試劑有刺鼻性氣味，對人體有害且不安全。磁珠法提取種優化的SDS提取方法，DNA質量高，用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度在200 ng/μL左右，DNA質量在OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，適合任何電泳，在提取的過程也不需要加氯仿和異戊醇，只需要加裂解液BUFFER1、提取液BUFFER2和無水乙醇，因此，較為安全，DNA保存時間也很長，成本較低，經濟適用，還可以用96深孔板高通量進行提取，尤其是水稻品種需要大批量提取DNA時優勢明顯。

3.3 PCR產物混點組合建立

建立一套理想的PCR產物混點組合是保證實驗成功及獲得準確數據的關鍵。PCR產物混點毛細管電泳是根據熒光標記引物的顏色、產物大小、引物特點、峰圖對PCR產物進行組合選擇，每組引物數量為5～11對，相同顏色的引物選擇1～3個。

參考文獻

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[8] 李婧婧，付求來，戴繼俠，等.一種快速鑒定雜交水稻種子純度的方法[J].種子，2018，37（4）：125-126，131.

基金項目：國家重點研發計劃項目（2023YFD1201204）。

作者簡介：劉奇燕（1982—），女，安徽岳西人，中級農藝師，主要從事種子質量分子檢測和常規檢測工作。