不同黃化茶樹種質中咖啡堿合成部位的研究

摘要：咖啡堿作為茶樹中的主要特征代謝物，是茶葉品質風味形成的重要組分和天然功能性成分。目前，茶樹中咖啡堿的功能作用、分布規律、合成途徑及關鍵基因已基本探明，但在亞細胞水平上，咖啡堿的合成部位有待進一步明確。以白雞冠茶樹及其自然雜交后代的不同黃化單株為材料，通過透射電鏡對葉片細胞超微結構的觀察，發現黃化葉片中葉綠體結構均有不同程度的受損，且與葉片SPAD值及葉色表型緊密相關；通過高效液相色譜法測定咖啡堿含量，發現黃化葉片中仍有大量咖啡堿積累，甚至超過正常綠色葉片。通過咖啡堿合成關鍵基因CsTCS1表達量測定、原位雜交及亞細胞定位發現，CsTCS1在不同黃化茶樹種質葉片中的表達信號強度存在差異，但表達部位基本相同，主要分布在柵欄組織的細胞核和細胞質中；在亞細胞水平上，茶樹葉片中咖啡堿的合成部位主要是細胞核和細胞質。

關鍵詞：茶樹；黃化葉片；咖啡堿；合成部位；亞細胞水平

中圖分類號：S571.1；Q52 """"""""""""文獻標識碼：A """"""""""""""文章編號：1000-369X（2024）04-575-10

Study on the Synthetic Site of Caffeine in Different Etiolated Tea Germplasms

ZHANG"Yazhen¹， ZHONG Sitong¹， CHEN Zhihui¹， KONG Xiangrui¹， SHAN Ruiyang¹，

ZHENG Shiqin¹， YU Wenquan^2*， CHEN Changsong^1*

1. Tea Research Institute， Fujian"Academy of Agricultural Sciences/Fujian Branch， National Center for Tea Improvement， Fuzhou 350012， China; 2. Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350003， China

Abstract："As the main characteristic metabolite in tea plants， caffeine contributes to tea quality and flavor formation and is a"natural functional component. Its function， distribution， biosynthetic pathway and related key genes in tea plants have been"basically identified， but its synthetic site at subcellular level needs to be further clarified. In this study， ‘Baijiguan’"and its half-sib offsprings with different etiolated leaves were used as materials. The results of transmission electron microscopy show that the chloroplast structures in etiolated leaves were damaged or destroyed， which was closely related to"the"SPAD value and leaf phenotype. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the caffeine content. It was found that there was still a large amount of caffeine accumulation in etiolated leaves， even more than in normal green leaves."Then， the expression and location of CsTCS1， a key gene involved in caffeine synthesis， were studied"by real-time PCR， in-situ hybridization and subcellular localization. It was shown"that the expression level of CsTCS1"in different etiolated leaves varied obviously. But the expression site was basically consistent， mainly distributed in the nucleus and cytoplasm of palisade tissues."These results reveal"that the synthetic"site of caffeine at subcellular level in tea leaves were mainly nucleus and cytoplasm， but not chloroplasts.

Keywords："tea plants， etiolated leaf， caffeine， synthetic site， subcellular level

咖啡堿，又名1，3，7-三甲基黃嘌呤，是植物中一類重要的嘌呤生物堿，對人體具有興奮、利尿等作用^[1]。咖啡堿是嘌呤生物堿的主體成分，占比95%以上，不僅參與茶樹生長發育過程，而且與茶氨酸、兒茶素等次級代謝物共同決定了茶葉的品質和風味?？Х葔A主要存在于茶樹葉片，且以幼嫩部位含量最高，占總干重的2%～3%^[2]。咖啡堿的合成也主要在幼嫩葉中進行，且合成速度隨葉片老化而逐漸下降^[3]。目前，茶樹中咖啡堿生物合成途徑已基本闡明，可分為供體途徑和核心途徑兩個部分，黃嘌呤骨架來源于嘌呤核苷酸，初始底物為黃嘌呤核苷，甲基供體是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。咖啡堿合成的核心途徑由黃嘌呤核苷開始，在3種N-甲基轉移酶（N-methyltransferase，NMT）和N-甲基核苷酶的作用下，分別經三步甲基化和一步核苷降解反應，依次生成7-甲基黃嘌呤核苷、7-甲基黃嘌呤、可可堿和咖啡堿^[4-5]。其中，黃嘌呤核苷N-甲基轉移酶（7-NMT）和7-甲基黃嘌呤N-甲基轉移酶（3-NMT）具有幾乎相同的性質，又統稱為咖啡堿合成酶（Tea caffeine synthase，TCS）^[6-7]。研究表明，CsTCS1（GenBank AB031280.1）是茶樹咖啡堿合成的關鍵酶，具有合成可可堿和咖啡堿的雙重作用，其功能已得到廣泛證實和深入研究^[8-10]。

如上所述，目前學者們從生物化學和分子生物學水平，對茶樹中咖啡堿的功能作用、分布規律、合成途徑及關鍵基因等方面進行了系統深入的研究，并取得了顯著進展。但在細胞水平，尤其是亞細胞水平上，咖啡堿合成部位的研究較少。研究表明，植物次生代謝合成途徑中涉及的酶類或中間產物往往定位于不同細胞器中，因此在亞細胞水平上次生代謝呈現出區室化現象，這不僅可以有效降低合成過程中的酶抑制效應，減輕產物對細胞的毒害性，促進其合成累積，還可通過控制代謝流的大小和方向，分散細胞的代謝負擔，從而在植物的生長發育和脅迫響應過程中發揮重要作用^[11-12]。

早期研究認為茶樹咖啡堿合成與葉綠體密切相關，推測合成后的咖啡堿可能與綠原酸結合形成復合物，集中貯存在液泡中^[13]。而在黃化茶樹種質葉片中，葉綠體結構異常，甚至解體，卻仍有大量咖啡堿的積累^[14-16]。由此可見，咖啡堿合成的亞細胞定位仍存在爭議，有待進一步明確。因此，本研究擬以不同黃化茶樹種質為材料，開展咖啡堿合成部位研究。通過葉片超微結構觀察、咖啡堿含量測定、關鍵基因CsTCS1的表達量及表達部位的檢測，以期明確咖啡堿合成的亞細胞部位，為全面解析茶樹中咖啡堿代謝過程奠定理論基礎。

1"材料與方法

1.1 試驗材料

以白雞冠茶樹及其自然雜交后代單株為材料，包括白雞冠茶樹單株（BJG）、綠色單株（L），以及自然生長環境下呈現出穩定的葉色黃化表型的雜交后代黃綠色單株（HL）、黃色單株（H）和黃紅色單株（HH），種植于福建省福安市（119°34′"E，27°12′"N）福建省農業科學院茶葉研究所茶園。分別取芽下第一葉或一芽二葉用于后續試驗。

1.2 葉綠素相對含量測定

使用葉綠素計SPAD-502plus對芽下第一葉進行葉綠素相對含量（SPAD值）的測定，避開葉脈，每組樣品設置8個生物學重復，取平均值，并利用SPSS軟件中的單因素ANOVA檢驗進行顯著性分析（P＜0.05）。

1.3 葉片超微結構的觀察

取芽下第一葉新鮮組織，切成米粒大?。s1 mm²），立即投入2.5%戊二醛溶液中室溫固定2 h，4 ℃保存，用于樣本制備。固定片用0.1 mol·L^-1磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）洗滌15 min，重復2～3次。然后將樣品重新固定在含有0.1 mol·L^-1"PBS的1%鋨酸中2 h，重復按上述方法洗滌。將樣品組織依次用30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%濃度的乙醇溶液進行脫水，每次1 h。依次用V_無水乙醇∶V_丙酮分別為3∶1、1∶1和1∶3進行脫水，每次0.5 h；然后依次用不同比例的丙酮與812包埋劑（3∶1?1∶1?1∶3）于37 ℃下進行滲透包埋2～4 h，繼續用純812包埋劑處理5～8 h后，倒入包埋板于60 ℃烤箱聚合48 h，制成樹脂塊后，用超薄切片機切成60～80 nm的薄片，用150目方華膜銅網撈片。銅網于2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min；70%乙醇清洗3次；超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網切片放入銅網盒內室溫干燥過夜。最后用日立HT7700透射電鏡（HITACHI，日本）進行細胞超微結構觀察。

1.4 咖啡堿含量的測定

取一芽二葉材料冷凍干燥后研磨成粉，精確稱取0.2 g，用70%甲醇-水溶液于70 ℃水浴浸提10 min，3 500 r·min^-1離心10 min取上清液，過0.45 μm有機微孔濾膜后，用于HPLC上機測定。檢測方法如下：色譜柱為Phenomenex C₁₂色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；線性梯度洗脫，0～42 min，4%～18.7%"B，42～43 min，18.7%～4%"B；柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min^-1，檢測波長280 nm；進樣量10 μL。具體方法參考文獻[17]。每組樣品設置3個生物學重復，取平均值，并利用SPSS軟件中的單因素ANOVA檢驗進行顯著性分析（P＜0.05）。

1.5 CsTCS1基因表達量的測定

取一芽二葉立即置于﹣80 ℃液氮速凍，按照南京諾唯贊公司RNA提取試劑盒（FastPure Universal"Plant Total RNA Isolation Kit）的方法進行茶樹葉片總RNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量和完整性，利用Biospec-Nano（島津，日本）測定RNA濃度。按照北京天根公司反轉錄試劑盒（FastKing gDNA Dispelling"RT SuperMix）進行cDNA合成，置于﹣20 ℃冰箱保存備用。根據CsTCS1基因編碼區序列，利用NCBI在線軟件Primer-blast設計qPCR特異引物（上游：ACTACGGGGAAGGTGAACG；下游：GCGAATGTGTTTGGACCCG），以CsGAPDH為內參基因（上游：TTGGCATCGTTGAGGGTCT；下游：CAGTGGGAACACGGAAAGC）。按照南京諾唯贊公司Taq Pro Universal"SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明配制反應體系，利用CFX Connect熒光定量PCR儀（伯樂，美國）進行qPCR反應，每個樣本設置3個生物學重復，采用方法來計算目的基因的相對表達量^[18]。

1.6"CsTCS1原位雜交分析

根據CsTCS1基因編碼區序列，將引物末端加地高辛標簽，進行探針合成。取芽下第一葉新鮮組織，切成塊后立即置于50%"FAA固定液（福爾馬林、冰醋酸和50%乙醇混合液，三者體積分數分別為5%、5%、90%）中固定12 h以上。在通風櫥內切取約3 mm厚的組織，經由低到高濃度梯度的乙醇溶液進行脫水，使用透明劑二甲苯進行浸蠟包埋。用切片機切片（約4 μm厚），攤片機撈片后，62 ℃烤箱烤片2 h。將切片依次放入脫蠟透明液15 min、脫蠟透明液15 min、無水乙醇5 min、無水乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min，再用焦碳酸二乙酯（DEPC）水浸泡清洗。切片于修復液中煮沸10～15 min，自然冷卻后基因筆畫圈，滴加蛋白酶K（20 μg·mL^-1）于37 ℃消化。純水沖洗后用PBS洗3次，每次5 min。探針雜交過程如下：（1）滴加預雜交液，40℃孵育1 h；（2）傾去預雜交液，滴加含探針雜交液，恒溫箱雜交過夜；（3）洗去雜交液，2×SSC，40 ℃洗10 min；1×SSC，40℃洗10 min；0.5×SSC室溫洗10 min；（4）滴加封閉血清液，室溫孵育30 min；（5）傾去血清封閉液，滴加堿性磷酸酶（AP）標記鼠抗地高辛抗體，37 ℃孵育2 h后，用TBS洗4次，每次5 min；（6）滴加BCIP/NBT顯色液，顯微鏡觀察陽性后，用純水沖洗；（7）自然風干后，用甘油明膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.7 CsTCS1亞細胞定位分析

設計帶有酶切位點的上游引物（cagtGGTCTCacaacatggagctagctactgcgggg）及下游引物（cagtGGTCTCatacatccatcaatcttggaaagcactaggatgatac）。經PCR反應、DNA切膠回收、酶切及連接反應，將目標基因CsTCS1連接至pBWA（V）HS-GFP載體；進一步經轉化大腸桿菌、菌落PCR和測序驗證后，將重組質粒轉入農桿菌GV3101，通過擴大培養，將重懸菌液注射煙草葉片下表皮，弱光培養2 d，并做好標記；將標記葉片制成玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。以上試驗委托武漢伯遠生物科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 不同黃化茶樹種質葉片的表型比較分析

以白雞冠茶樹及其自然雜交后代的不同黃化單株為材料，其新梢葉色表型如圖1所示。通過測定芽下第一葉的葉綠素相對含量，發現不同黃化單株葉片的SPAD值為4.57～24.93，呈現為L＞HH＞HL＞BJG＞H。與葉色表型一致，隨著葉片黃化程度的加深，其SPAD值也相應降低。其中L的葉片SPAD值顯著高于BJG、HL、H和HH，差異可達2.1～5.5倍；HH的SPAD值顯著高于其他黃化葉片（BJG、HL和H）；BJG與HL的葉色相近，其SPAD值無顯著差異。H的SPAD值最低，黃化程度最深。

2.2 不同黃化茶樹種質葉片的超微結構的比較

通過透射電鏡對不同黃化茶樹種質的葉片超微結構進行比較，發現BJG、HL、H、HH與L的亞細胞結構存在明顯差異：正常綠色葉片具有清晰完整的葉綠體結構，而葉色黃化變異后的葉片中葉綠體數量減少，面積變小，葉綠體結構均表現為不同程度的損傷（圖2）。其中，BJG與HL的葉片超微結構相似，可觀察到少量的基粒片層結構，但基粒片層堆疊顯著減少，類囊體無法正常堆疊形成明顯的基粒結構。隨著葉片黃化程度的加深，H中葉綠體結構受損嚴重，僅剩單層類囊體結構，無明顯基粒片層堆疊。有趣的是，H和HH中淀粉粒數量明顯增加；與H相比，HH葉片的葉綠體結構有較多保留，可以觀察到部分類囊體堆疊。此外，還可發現在不同黃化茶樹葉片中，葉綠體結構的受損程度與葉片SPAD值變化規律一致。以上結果說明葉綠體結構的變化與葉色黃化變異緊密相關。

2.3 不同黃化茶樹種質葉片的咖啡堿含量與CsTCS1基因表達量分析

基于BJG與HL在表型、SPAD值及葉片超微結構等方面的相似性，選取白雞冠茶樹自然雜交后代的不同黃化單株L、HL、H和HH為材料用于后續試驗。通過HPLC測定咖啡堿含量，發現不同黃化茶樹種質中的咖啡堿含量存在差異，變化幅度為31.65～36.30 mg·g^-1，其中以H中咖啡堿含量最高，其次是L和HL，HH中咖啡堿含量最低（圖3A）。通過qPCR測定CsTCS1基因表達量，發現CsTCS1在H中表達量最高，其次是HL、L和HH（圖3B）。且CsTCS1基因表達模式與咖啡堿含量分布規律一致，其相關性系數為0.889^**（P＜0.01）。因此將CsTCS1作為咖啡堿合成的關鍵酶用于后續咖啡堿合成部位的研究。

2.4 不同黃化茶樹種質葉片中CsTCS1的表達部位分析

利用原位雜交技術對CsTCS1在細胞及亞細胞水平上的表達規律進行探究，如圖4所示，帶有AP標記的抗地高辛抗體與地高辛標記的CsTCS1雜交體結合，經BCIP/NBT染色顯出的陽性表達為藍紫色，表達量越高，顯色越深。結果表明，在不同黃化茶樹種質葉片的各類型細胞中均檢測到了CsTCS1的表達信號，且表達部位基本相同，以葉肉細胞中柵欄組織的表達信號最強，其次是維管束；此外，TCS1在

上表皮、下表皮和海綿組織也有分布。與qPCR結果一致，CsTCS1在H中的表達信號最強，尤以柵欄組織和維管束最為明顯（圖4A）。在亞顯微水平上，以細胞核中CsTCS1的表達信號最強（圖4B，白色箭頭標注），在質膜上也有表達信號。對葉脈中CsTCS1的表達部位進行觀察，發現CsTCS1表達信號在上表皮、下表皮、木質部和韌皮部均有分布（圖4C）。

2.5 茶樹CsTCS1的亞細胞定位分析

為了進一步確定CsTCS1蛋白在亞細胞水平上的表達部位，將空載和融合有CsTCS1基因的GFP表達載體分別轉化農桿菌，侵染煙草葉片進行瞬時表達，觀察CsTCS1在煙草表皮細胞中的分布情況。如圖5所示，對照（空載體）的GFP熒光信號在細胞核、細胞質和質膜上均有分布；而目標蛋白的熒光信號主要分布在細胞核和質膜上（白色箭頭標注），與葉綠體自發的紅色熒光信號基本無重合。表明CsTCS1主要分布在細胞核和細胞質上，這與CsTCS1原位雜交的結果一致。

3 討論

咖啡堿作為茶葉中的特征性次生代謝物，學者們對其合成途徑、代謝調控等方面開展了

大量研究。前人研究結果表明，茶樹中的咖啡堿主要在葉片中進行合成和積累，且以幼嫩部位含量最高^[2-3]。但在亞細胞水平上，咖啡堿的合成部位仍不明確。在早期研究中，Kato等^[19]以3-NMT為標記蛋白，對茶樹中咖啡堿的亞細胞合成部位進行了初步探究。通過茶樹幼嫩葉中的葉綠體分離及純化，對3-NMT酶活和葉綠素含量進行測定，發現3-NMT蛋白活性峰值與葉綠素分布峰值相對應，表明咖啡堿合成與葉綠體密切相關。由于柵欄組織含有較多葉綠體，作者推測茶樹葉片柵欄組織的葉綠體可能是咖啡堿合成的主要場所。Breda等^[20]通過免疫組織化學方法和激光共聚顯微鏡焦掃描探究了茶樹幼嫩葉中咖啡堿的解剖定位，結果表明，咖啡堿分布在維管束細胞，主要是在前體韌皮部中積累，推測咖啡堿在葉綠體的光合細胞中形成后被轉運至維管束細胞中積累。由此可見，茶樹中咖啡堿合成的亞細胞部位研究，仍停留于推測論證階段，缺乏直接的試驗性證據。

近幾年，特異葉色茶樹種質資源陸續被發掘利用，尤其是黃化茶樹成為新品種選育及推廣的熱點。相關研究表明，黃化茶樹葉片的葉綠體結構異常，發生退化，甚至解體，基粒片層和類囊體膜結構發育受阻，卻仍有咖啡堿的積累，且大部分黃化茶樹葉片中的咖啡堿含量與普通綠色茶樹相當^[14-16]。如果咖啡堿在葉綠體中合成，為什么黃化茶樹葉片中仍有咖啡堿累積？這與前人的“茶樹葉片中咖啡堿在葉綠體中合成”這一推測相悖，茶樹中咖啡堿合成的亞細胞定位仍有待進一步明確。

因此，本研究以白雞冠茶樹自然雜交后代單株的一芽二葉為材料，通過葉綠素相對含量測定、葉片超微結構觀察、咖啡堿含量及CsTCS1基因表達量測定、CsTCS1原位雜交及亞細胞定位，對不同黃化茶樹種質中的咖啡堿合成部位進行研究。結果表明，與正常綠色葉片相比，黃化茶樹葉片的葉綠素相對含量均顯著下降（圖1B），葉綠體數量及面積減少，其葉綠體結構均受到不同程度的破壞（圖2）。在中黃2號^[14]、湘妃翠^[15]、白葉1號^[21]、華白1號^[22]、黃金芽^[23]和福黃1號^[24]等黃化茶樹中也發現了相似的結果，表明葉綠體結構的變化是茶樹葉色黃化變異的直接原因^[25]。通過咖啡堿含量測定，發現咖啡堿積累與葉色黃化變異或葉綠體結構變化并無直接關聯，即使在葉綠體受損程度最嚴重的黃化葉片中，仍有較高含量的咖啡堿積累，甚至顯著高于正常綠色葉片中的咖啡堿含量（圖3A），這與前人研究結果一致。王麗鴛等^[16]通過對葉色特異茶樹的生化成分測定，發現大部分黃（白）化茶樹品種的咖啡堿含量與正常綠色品種相當。婁艷華等^[26]對14個黃（白）化茶樹品種（系）的葉綠素和生化成分含量進行分析比較，也發現了不同黃（白）化茶樹品種（系）中葉綠素SPAD值與咖啡堿含量無明顯相關性。進一步通過qPCR測定基因表達量，發現咖啡堿合成途徑的關鍵基因CsTCS1與咖啡堿顯著正相關（圖3）。Mohanpuria等^[27]以4個茶樹品種的不同組織部位為材料，發現咖啡堿集中分布茶樹新梢幼嫩組織，包括頂芽、芽下第一葉、第二葉和嫩莖，而成熟葉及老葉中咖啡堿含量顯著減少；且茶樹中CsTCS1的基因表達也呈現出高度一致的變化規律。李金等^[28]以10個茶樹品種的一芽二葉為材料，通過測定咖啡堿含量及其合成途徑中關鍵基因的表達量發現，CsTCS1基因表達量與咖啡堿含量呈顯著正相關。前人諸多研究也均證實了CsTCS1在咖啡堿合成中的重要性，其基因表達水平在一定程度上決定了茶樹中咖啡堿的含量及嘌呤類生物堿的組成^[8-10]。在早期研究中，Kato等^[19]以CsTCS1作為標記蛋白對茶樹中咖啡堿的亞細胞合成部位進行了探究，但由于研究方法及技術的局限，相關研究進展緩慢。

本研究進一步通過原位雜交技術對不同黃化茶樹種質中CsTCS1的表達部位進行比較分析，結果表明，在不同黃化茶樹種質葉片中，CsTCS1在黃化葉片H中的表達信號最強，與qPCR結果一致。無論是在葉綠體結構完整的綠色葉片，或是葉綠體結構受損的黃化葉片中，CsTCS1的表達部位基本相同。在細胞水平上，CsTCS1主要在柵欄組織細胞中表達，此外，在上表皮、下表皮、維管束細胞中也有分布。與前人研究結果一致，李遠華等^[29]對福鼎大白茶、梅占、上梅州和龍井43茶樹葉片中的CsTCS1表達部位進行比較分析，發現不同品種中CsTCS1的表達信號存在差異，但表達位置基本相似，即主要分布在柵欄組織的細胞核和細胞質。福鼎大白茶、福鼎大毫茶和福安大白茶中CsTCS1的原位雜交信號也主要分布在葉片柵欄組織細胞^[30]。在亞細胞水平上，CsTCS1主要在細胞核中表達，此外，在細胞質上也有分布（圖4）；CsTCS1蛋白在煙草表皮細胞的亞細胞定位分析也得出了一致的結果（圖5）。與CsTCS1具有較高序列相似度的苦茶堿合成酶也定位于細胞核和細胞質^[31]。Teng等^[32]從富含可可堿的野生茶樹中鑒定獲得了可可堿合成酶，發現它定位于細胞核。咖啡中的咖啡堿合成關鍵酶也均定位于細胞質^[33-34]。此外，茶樹中SAM合成酶及產物也均分布在細胞質^[4]。綜上所述，咖啡堿合成途徑的相關酶類均定位在細胞質或細胞核，是咖啡堿合成的主要部位。

本研究通過對不同黃化茶樹種質葉片的細胞超微結果觀察和咖啡堿含量的測定，發現在葉綠體不同受損程度的葉片中，仍有大量咖啡堿積累，甚至超過正常綠色葉片。進一步通過對關鍵基因CsTCS1表達量的測定、原位雜交及亞細胞定位，發現CsTCS1在不同黃化茶樹葉片中的表達信號強度存在差異，但表達部位基本相同，主要分布在柵欄組織的細胞核和細胞質中。本研究明確了茶樹葉片中咖啡堿主要在細胞核和細胞質中合成，而不是葉綠體。這有助于全面闡釋茶樹中的咖啡堿代謝過程，為后續咖啡堿合成后的轉運及儲存過程研究奠定理論基礎。

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