一株云南木霉菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其對(duì)茶炭疽病的防控研究

摘要：為優(yōu)化對(duì)茶炭疽病菌Colletotrichum camelliae有拮抗作用的云南木霉菌Trichodema yunnanense的發(fā)酵培養(yǎng)條件，并明確發(fā)酵液對(duì)茶炭疽病的防控效果，以對(duì)C. camelliae的抑菌率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化云南木霉菌的發(fā)酵條件并獲得發(fā)酵液，比較其對(duì)茶炭疽病的抑菌活性、離體葉片和盆栽茶樹(shù)葉片防效及茶樹(shù)生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，T. yunnanense的最佳發(fā)酵條件為馬鈴薯200 g·L^-1、甘露醇18.85 g·L^-1、酵母浸膏4.73 g·L^-1、裝液量372.60 mL·L^-1、培養(yǎng)溫度25 ℃、pH"6.6、12L∶12D。10%的發(fā)酵液對(duì)C."camelliae的抑菌率達(dá)92.61%，對(duì)感染茶炭疽病的離體茶樹(shù)葉片與盆栽茶樹(shù)葉片的防效分別為63.71%與68.95%，均顯著高于哈茨木霉菌（T. harzianum）可濕性粉劑與多菌靈的防效。同時(shí)，10%發(fā)酵液處理后的茶樹(shù)幼苗根長(zhǎng)提升69.16%，根鮮重提升215.70%，株高增加42.13%，地上部鮮重增加212.11%。表明T. yunnanense發(fā)酵液兼具抗菌和促生作用。研究結(jié)果為T. yunnanense在茶炭疽病生物防治中的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：云南木霉菌；茶炭疽病；發(fā)酵液；響應(yīng)面；生物防控

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；S435.711 """"""""""""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""""""""""文章編號(hào)：1000-369X（2024）04-627-12

Optimization of Culture Conditions of A"Trichoderma yunnanensis"and Its Control Efficiency"of Tea Anthracnose

LIU Hui¹， FENG Yueling^1，2， ZHU Xiuying³， ZHENG Zhouzhou³， LIU Sirui¹，ZHOU Luona¹， PAN Xuezhen⁴， SONG Li^2*

1. Institute of Biotechnology， Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guizhou Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology， Guiyang 550009， China; 2. Key laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）， College of Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China;"3. Guizhou Education University， Guiyang 550018， China;"4. Guizhou Falaidi Agricultural Technology Co.， Ltd.， Longli 551202， China

Abstract： To optimize the fermentation conditions"of Trichoderma yunnanensis， which has"antagonistic effect on Colletotrichum camelliae，"single factor and response surface tests"were performed with the inhibition rate of C. camelliae"as the evaluation index."Then，"the antagonistic activity， in vitro"leaf control effect， indoor pot control effect， and growth effect of the fermentation broth on C. camelliae and"tea plants， respectively， were determined. The results show that the optimum fermentation conditions of T. yunnanense"were as follows： potato 200 g·L^-1， mannitol 18.85 g·L^-1， yeast extract 4.73 g·L^-1， liquid content 372.60 mL·L^-1， culture temperature 25 ℃， pH"6.6， 12L∶12D. The inhibitory rate of the obtained fermentation broth on C. camelliae"reached 92.61% under the ratio of 1∶9 mixed with potato broth （PDA） medium. The control effect of the fermentation broth on anthrax in vitro"leaf was 63.71% and that on"indoor potted tea plants"was 68.95%， both of which were significantly higher than that of T. harzianum"wettable powder and carbendazim. Compared with the water control， the growth of tea seedlings treated with fermentation solution of T. yunnensis was significantly improved， which was"manifested by the increase of"root length， root fresh weight， plant height and above ground fresh weight by 69.16%， 215.70%， 42.13% and 212.11%"respectively. Overall， T. yunnanense"fermentation liquid has both antibiotic and growth-promoting effects. The results provided a theoretical basis for the application of T. yunnanense"fermentation broth in the biological control of tea anthracnose.

Keywords："Trichoderma yunnanensis， tea anthracnose， fermentation broth， response surface method， biological control

貴州茶產(chǎn)業(yè)在我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，茶樹(shù)種植面積位居全國(guó)前列^[1]。據(jù)貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳統(tǒng)計(jì)，2018—2023年，茶炭疽病在貴州的發(fā)病面積呈逐年上升趨勢(shì)，是貴州茶園的第二大真菌病害。茶炭疽病嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，百菌清、代森鋅、吡唑醚菌酯等化學(xué)農(nóng)藥對(duì)茶炭疽病的防治效果快，但連年施用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致病害抗藥性和茶葉農(nóng)藥殘留，不利于茶產(chǎn)業(yè)的良性健康發(fā)展^[2-3]。因此，開(kāi)發(fā)無(wú)毒、無(wú)污染、與環(huán)境相容性好，兼具促生作用的生物制劑對(duì)增強(qiáng)茶產(chǎn)業(yè)的內(nèi)核力具有重要推動(dòng)作用。

木霉菌（Trichoderma"spp.）被認(rèn)為是安全無(wú)毒、不易產(chǎn)生抗藥性、兼具抗菌和促生作用的生物防治菌，目前已成功應(yīng)用于草莓^[4]、辣椒^[5]、高粱^[6]等多種農(nóng)作物炭疽病的生物防治，成為化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的減量替代品。研究表明，木霉菌可有效應(yīng)用于茶樹(shù)病害防控，如T. virid和T. harzianum可以降低茶黑根腐病（Rosellinia arcuata"petch.）和茶枝梢黑點(diǎn)?。?em>Cenangium"spp.）的發(fā)生^[7]。T. koningii、T. longibrachiatum和T. harzianu可有效抑制茶樹(shù)蜜環(huán)菌根腐病（Armillaria"spp.）和輪斑病菌（Pestalotiopsis"spp.）對(duì)茶樹(shù)的侵染^[8]。趙興麗等^[9]從茶樹(shù)根際土壤篩選獲得一株對(duì)茶炭疽病菌（C. boninensis）抑菌率達(dá)70.08%的棘孢木霉菌（T. asperelloides）。

當(dāng)前木霉菌制劑成分多為分生孢子、厚垣孢子或菌絲體等活菌，保存、運(yùn)輸及使用成本高昂，條件要求較高^[10]。木霉菌發(fā)酵液包含揮發(fā)性抗生素、水溶性抗生素、肽類(lèi)化合物與毒性蛋白等拮抗物質(zhì)，對(duì)植物病原菌起直接抑菌或促生作用^{[9，11-16]}。因此，木霉菌發(fā)酵液制劑是實(shí)現(xiàn)木霉菌功效的另一有效途徑。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，云南木霉菌株（T."yunnanense）對(duì)貴州茶炭疽病病原菌（C. camelliae）的平板對(duì)峙抑菌率達(dá)83.68%，發(fā)酵液抑菌率為70.20%。本研究擬設(shè)計(jì)一套進(jìn)一步提升云南木霉菌發(fā)酵液抑菌活性成分含量的方法，旨在為后續(xù)更穩(wěn)定、高效活性成分的分離純化，以及新型木霉菌制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用云南木霉菌（Trichodema yunnanense"CBS121219）和茶炭疽病菌（Colletotrichum"camelliae）均由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，云南木霉菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No.：M20231022。

供試茶樹(shù)品種為烏牛早和福鼎大白茶，茶樹(shù)幼苗由貴州發(fā)來(lái)地農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2"儀器與設(shè)備

Tousimis autosamdri-815"Series A全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀，華納創(chuàng)新（北京）科技有限公司；Hitachi SU8100掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；LBI-200生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；GR85DR立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；Advanced-Ⅱ-24實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司。

1.3"培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（蒸餾水1 L、馬鈴薯200 g·L^-1、葡萄糖20 g·L^-1、瓊脂15～20 g·L^-1），種子液培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基（不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基），發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分為PDB培養(yǎng)基，添加不同的碳源和氮源^[13]。

1.4"試驗(yàn)方法

1.4.1 云南木霉菌種子液培養(yǎng)

平板活化和種子液培養(yǎng)參考周羅娜等^[17]的方法。平板活化：用5 mm直徑的打孔器取T."yunnanense菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。種子液培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中裝入100 mL PDB培養(yǎng)基，挑取活化后的T."yunnanense，接種于三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min^-1，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后進(jìn)行發(fā)酵接種。

1.4.2 茶炭疽菌菌種活化與培養(yǎng)

參考周羅娜等^[17]的方法進(jìn)行平板活化，用5 mm直徑的打孔器取C. camelliae菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件下，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

分別對(duì)不同種類(lèi)的碳源（20 g·L^-1玉米淀粉、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、麩皮、馬鈴薯淀粉替代PDB培養(yǎng)基中的碳源）、氮源（20 g·L^-1氯化銨、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、磷酸氫二銨、尿素、硫酸銨）、發(fā)酵溫度（15～35 ℃）、pH（3～12）、發(fā)酵時(shí)間（1～11 d）、裝液量（200～400 mL·L^-1）進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶中，將T."yunnanense種子液接種于三角瓶中，25 ℃、12L∶12D搖床培養(yǎng)5 d。將獲得的發(fā)酵液經(jīng)針管抽濾、0.45 μm"Millipore PES微孔濾膜微濾后，獲得濾液。將濾液與滅菌的PDA培養(yǎng)基1∶9混合均勻，以不添加濾液的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，將活化后的C. camelliae接種于這兩種培養(yǎng)基上，采用十字交叉法測(cè)量并記錄C. camelliae菌落生長(zhǎng)直徑，每組至少設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)^[13]。根據(jù)菌落直徑，計(jì)算抑菌率，公式如下：

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑－發(fā)酵液處理后的菌落直徑）÷（對(duì)照菌落直徑－0.5）×100%

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

從單因素試驗(yàn)篩選出對(duì)茶炭疽病菌抑菌率影響最顯著的碳源、氮源、裝液量為響應(yīng)面考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，使用Design-Expert 10軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，用（﹣1，0，1）作為編碼，以處理后的云南木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率作為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化，每個(gè)處理3次重復(fù)（表1）^[17]。

1.4.5 掃描電鏡觀察

選取預(yù)先標(biāo)記好的拍照部位，用2.5%戊二醛（V_25%戊二醛∶V_水∶V_PBS=1∶4∶5）浸泡固定，放在4 ℃冰箱過(guò)夜。然后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥制樣：將樣品從戊二醛中取出，依次置于體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、100%、100%的乙醇中進(jìn)行梯度脫水，然后放入臨界點(diǎn)干燥儀中進(jìn)行干燥。干燥約1 h，取出后固定在樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金鍍膜，在掃描電子顯微鏡下，調(diào)節(jié)分辨率，進(jìn)行拍照測(cè)試。技術(shù)參數(shù)：分辨率為0.7 nm（15 kV），0.8 nm（1 kV）；加速電壓為0.5～30 kV；放大倍率為20～1 000 000（底片輸出）。

1.4.6"離體葉片試驗(yàn)

葉片表面消毒和打孔：選擇20株一年生、長(zhǎng)勢(shì)一致且有對(duì)夾葉的烏牛早健康茶樹(shù)幼苗作為試驗(yàn)材料。選取茶苗頂部2個(gè)健康葉片，先用無(wú)菌水將表面洗凈，再用75%的乙醇進(jìn)行消毒1 min，待葉片表面干燥后，用無(wú)菌針頭在葉片中部扎2個(gè)距離相等的小孔。

試驗(yàn)藥劑噴施：根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，將優(yōu)化后的T."yunnanense發(fā)酵液（稀釋10倍）噴灑于茶樹(shù)幼苗上，以噴灑無(wú)菌水作為空白對(duì)照，以噴灑1.5 g·L^-1（產(chǎn)品推薦量）哈茨木霉可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮液作為陽(yáng)性對(duì)照，每種藥劑的用量一致，每個(gè)處理組5個(gè)葉片，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

病原菌接種和病斑測(cè)量：取活化后的C. camelliae平板，在其邊緣取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅覆蓋在葉片刺傷處，于25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，然后調(diào)查并統(tǒng)計(jì)病斑大小。

1.4.7"室內(nèi)盆栽試驗(yàn)

防效測(cè)定：選用福鼎大白茶一年生盆栽苗，在接種茶炭疽病病原菌前1 d，將優(yōu)化好的T."yunnanense發(fā)酵液稀釋10倍后，均勻噴灑于茶苗上，以等體積的無(wú)菌水為空白對(duì)照，以等體積的1.5 g·L^-1哈茨木霉可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮液為陽(yáng)性對(duì)照。藥液均勻噴灑于葉面，呈液滴不掉落狀，待葉面藥液稍干，將活化后的C. camelliae菌餅接種于葉片表面，每個(gè)處理重復(fù)3次，處理完成后于25 ℃、濕度90%，12L∶12D的氣候箱中培養(yǎng)7 d后，再?lài)娛?次藥劑。7 d后每天觀察茶樹(shù)幼苗生長(zhǎng)情況，按照表2中的標(biāo)準(zhǔn)和計(jì)算公式，計(jì)算各個(gè)處理的發(fā)病情況、病情指數(shù)以及防治效果^[18]。

植物生物量測(cè)定：選取3～6葉期的茶樹(shù)苗移栽到花缽中，移栽時(shí)將幼苗基質(zhì)拔出，用注射器吸取5 mL制備好的發(fā)酵液均勻注入到根部營(yíng)養(yǎng)土中，然后吸取5 mL發(fā)酵液注入定植缽中，隔15 d后往茶樹(shù)植株根部再次補(bǔ)接10 mL發(fā)酵濾液，于28 ℃、相對(duì)濕度90%的人工氣候箱中培養(yǎng)，以無(wú)菌水和1.5 g·L^-1哈茨木霉可濕性粉劑分別為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理5株，重復(fù)3次，45 d后測(cè)量植株的株高、根長(zhǎng)、地上部莖葉鮮重及干重、根部鮮重及干重等植株生物量指標(biāo)。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×該病指數(shù)）÷（調(diào)查葉總數(shù)×最高病級(jí)值）×100%

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）÷對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.5"數(shù)據(jù)分析

采用WPS office 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，顯著性分析采用SPSS 26.0軟件中的Duncan's法（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 T. yunnanense的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

9種碳源分別添加到T."yunnanense培養(yǎng)基中，所獲得發(fā)酵液的抑菌率為35.58%～71.50%，其中添加甘露醇的發(fā)酵液抑菌率最高，為T."yunnanense的最佳碳源（圖1A）。以7種氮源分別獲得的T."yunnanense發(fā)酵液進(jìn)行C. camelliae抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母浸膏、蛋白胨、磷酸氫二銨對(duì)發(fā)酵液的抑菌率均達(dá)到55%以上，表明T."yunnanense可以同時(shí)利用有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮。其中，添加酵母浸膏的發(fā)酵液抑菌率最高，達(dá)75.85%，為最佳氮源（圖1B）。當(dāng)pH為3.5～9.1，所獲得的T."yunnanense發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的抑菌率影響差異不顯著，其中pH為6.6時(shí)的抑菌率最高，達(dá)65.76%，為最適pH（圖1C）。

在15～35 ℃的范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的上升，所獲得T."yunnanense發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的抑菌率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)的抑菌率最高，達(dá)66.22%（圖1D）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)，獲得的T."yunnanense發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的抑菌率最高，達(dá)65.93%，之后抑菌活性逐漸降低，因而最佳培養(yǎng)時(shí)間為5 d（圖1E）。裝液量的抑菌活性變化幅度為39.62%～65.72%，其中裝液量為360.00 mL·L^-1時(shí)發(fā)酵液抑菌率最高，達(dá)65.72%（圖1F），為最適裝液量。

綜上所述，甘露醇、酵母浸膏、裝液量對(duì)T."yunnanense發(fā)酵液的茶炭疽病抑菌率影響顯著。

2.1.2 T. yunnanense的發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇甘露醇、酵母浸膏、裝液量作為自變量，以T. yunnanensis發(fā)酵液處理對(duì)C. camelliae的抑菌率作為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表3所示，所有試驗(yàn)方案的抑菌率均在70%以上，其中方案12的抑菌率最高，達(dá)到93.21%，為最優(yōu)發(fā)酵方案。

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert

10.0軟件的RSA程序?qū)Ρ?中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到3個(gè)培養(yǎng)條件與抑菌率的模型回歸方程為Y=90.67－2.26A＋4.74B＋3.82C－2.97AB－1.92AC＋2.27BC－8.52A²－3.32B²－4.29C²，然后對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型的P＜0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著；模型相關(guān)系數(shù)R²=0.994 7，表明模型擬合較好；模型失擬項(xiàng)的P值為0.127 1，差異不顯著，表明該模型與實(shí)際情況相符（表4）。試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)木霉菌發(fā)酵液抑菌效果的影響大小依次為酵母浸膏＞裝液量＞甘露醇。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、C、AB、BC、AC、A²、B²、C²差異極顯著（P＜0.01）。

通過(guò)Design-Expert"10.0軟件繪制響應(yīng)面圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。圖2顯示，方程的拋物線(xiàn)圖形開(kāi)口均向下，說(shuō)明方程存在最大值?；貧w模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出T."yunnanense發(fā)酵液達(dá)到最大抑菌率93.46%時(shí)，各因素水平為甘露醇18.85 g·L^-1、酵母浸膏4.73 g·L^-1、裝液量372.60 mL·L^-1。為驗(yàn)證回歸模型預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件進(jìn)行T."yunnanense的發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的實(shí)際抑菌率為92.61%（圖3A），與理論值較吻合，表明響應(yīng)面法對(duì)T."yunnanense發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的可靠性高。

2.2"T. yunnanense發(fā)酵液的抑菌促生作用

2.2.1 T. yunnanense發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的抑菌作用

采用最優(yōu)條件下培養(yǎng)5 d獲得的T. yunnanense發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)濾后，進(jìn)行茶炭疽病病原菌平板抑菌試驗(yàn)，其平均抑菌率達(dá)到92.61%（圖3C），與優(yōu)化前的70.20%（圖3B）相比，提升了22.41個(gè)百分點(diǎn)。通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，T. yunnanense發(fā)酵液處理后的C. camelliae菌絲發(fā)生彎曲、皺縮（圖3E）。前期對(duì)C. camelliae與T. yunnanense進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，收集兩菌交界處的菌絲，然后進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)C. camelliae與T. yunnanense的菌絲可互相纏繞（圖3F）。因此，推測(cè)T. yunnanense對(duì)C. camelliae的抑制作用通過(guò)兩種方式進(jìn)行，一方面通過(guò)分泌抑菌成分對(duì)病原菌起直接殺菌作用，另一方面通過(guò)物理纏繞、抑制C. camelliae的延伸生長(zhǎng)。

茶樹(shù)離體葉片和盆栽防效試驗(yàn)如圖4所示。離體葉片試驗(yàn)表明，與陽(yáng)性對(duì)照（多菌靈、哈茨木霉可濕性粉劑）及空白對(duì)照（無(wú)菌水處理）相比，T. yunnanense發(fā)酵液的防治效果最佳，達(dá)到63.71%（表5）。盆栽試驗(yàn)表明，與陽(yáng)性對(duì)照（多菌靈、哈茨木霉可濕性粉劑）及空白對(duì)照（無(wú)菌水處理）相比，T. yunnanense發(fā)酵液的防治效果最佳，達(dá)到68.95%（表5）。

2.2.2"茶樹(shù)幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用

茶樹(shù)幼苗被施用T. yunnanense發(fā)酵液后，其根長(zhǎng)、根鮮重、株高、地上部鮮重較無(wú)菌水對(duì)照組分別提升了69.16%、215.70%、42.13%、212.11%，表明T. yunnanense發(fā)酵液具有促進(jìn)茶樹(shù)幼苗生長(zhǎng)的作用（表6）。

3 討論

茶炭疽病是影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要真菌性病害，從茶樹(shù)根際土壤中可以分離得到許多對(duì)茶炭疽病具有生物防治效果的微生物，如木霉菌^[9]、放線(xiàn)菌^[19-20]、鏈霉菌^[21]、解淀粉芽孢桿菌JT68^[22]、巨大芽孢桿菌L2^[23]等。這些生物防治菌所分泌的拮抗物質(zhì)是保證其具有生物防治效果的關(guān)鍵，而拮抗物質(zhì)含量的高低取決于合適的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件^[24]。T."yunnanense是Yu等^[25]從煙草根際分離得到的國(guó)內(nèi)木霉新記錄種，Liu等^[26]研究發(fā)現(xiàn)，T."yunnanense可以促進(jìn)鹽脅迫下農(nóng)作物種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)。但目前還未見(jiàn)T."yunnanense應(yīng)用于茶炭疽病的生物防治中。課題組前期從茶樹(shù)根際分離獲得一株云南木霉菌T."yunnanense，發(fā)現(xiàn)其對(duì)茶炭疽病的平板對(duì)峙抑菌效果達(dá)83.68%，發(fā)酵液抑菌率達(dá)70.20%。因此，本研究以T."yunnanense為研究對(duì)象，在單因素篩選和響應(yīng)面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化菌株T."yunnanense的培養(yǎng)條件，以提高發(fā)酵液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌效果，并通過(guò)離體葉片和室內(nèi)茶樹(shù)幼苗防效試驗(yàn)，鑒定其對(duì)茶炭疽病的防治效果。

優(yōu)化生物防治菌發(fā)酵條件可以增加抑菌代謝物產(chǎn)量，從而有益于提升其防效^[27]。這些代謝產(chǎn)物可以直接作用于病原菌，或間接作用于植物，包括促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抑菌成分，從而抵御病害的侵?jǐn)_^[28-29]。丁志雯等^[10]對(duì)木霉菌YHWG5102的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，得到其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖23.44 g·L^-1、玉米漿26.07 g·L^-1、磷酸氫二鉀0.81 g·L^-1，最佳發(fā)酵條件為裝液量250 mL·L^-1、pH 6.0、接種量4%、160 r·min^-1、28 ℃，此條件下獲得的發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌直徑比優(yōu)化前增加了42%左右。申屠旭萍等^[30]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉菌在葡萄糖為42.8 g·L^-1、接種量1.39 mL，發(fā)酵102.88 h，所產(chǎn)木霉素含量最高，達(dá)147.44 mg·L^-1，為工業(yè)化生產(chǎn)木霉素奠定重要基礎(chǔ)。周羅娜等^[17]研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌T. asperelloides在培養(yǎng)基組成為葡萄糖18.34 g·L^-1、酵母浸膏1.88 g·L^-1、磷酸氫二鉀0.86 g·L^-1、硫酸亞鐵0.63 g·L^-1時(shí)，其發(fā)酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑比優(yōu)化前縮小了13%。綜上，不同木霉菌菌株因生物學(xué)特性的差異，所需的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件不同，從而導(dǎo)致發(fā)酵工藝差異較大。因此，為提高T."yunnanense的防治效果，需要選擇與之相適應(yīng)的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化T."yunnanense的發(fā)酵條件，以對(duì)茶炭疽病病原菌C. camelliae的抑菌率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)T."yunnanense最優(yōu)發(fā)酵條件為馬鈴薯200 g·L^-1、甘露醇18.85 g·L^-1、酵母浸膏4.73 g·L^-1、裝液量372.60 mL·L^-1，發(fā)酵溫度25 ℃、12L∶12D、pH 6.6，在此條件下培養(yǎng)5 d的T."yunnanense發(fā)酵液對(duì)C. camelliae的抑菌率顯著高于棘孢木霉菌T. asperelloides對(duì)C. boninensis的抑菌效果^[9，17]。掃描電鏡結(jié)果表明，T. yunnanense發(fā)酵液可使C. camelliae的菌絲發(fā)生彎曲、皺縮，且T. yunnanense菌絲可以纏繞C. camelliae菌絲，這與已有研究結(jié)果^{[9，21，31]}相似。茶樹(shù)離體葉片和盆栽防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明，T. yunnanense發(fā)酵液使離體葉片防治效果達(dá)到63.71%，對(duì)盆栽茶樹(shù)幼苗炭疽病的防治效果達(dá)到了68.95%，且能顯著提高茶樹(shù)根長(zhǎng)、根鮮重、株高、地上部鮮重，這與Pandey等^[28]和周羅娜等^[32]的結(jié)果一致。

綜上所述，T."yunnanense發(fā)酵液兼具殺菌和促生作用，具有顯著的生物防治效果，為T. yunnanense在茶炭疽病生物防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將對(duì)發(fā)酵液中的抑菌成分及其抑菌機(jī)制進(jìn)行分析。

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