草銨膦·高氟吡·乙羧氟2種不同復配劑對環境非靶標生物的急性毒性與風險評估

摘要：為了開發新型農藥制劑并減輕農藥對環境的污染，利用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法，測定草胺膦·高氟吡·乙羧氟的不同復配劑（21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑、23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑）對斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻、蜜蜂、家蠶5種非靶標生物的急性毒性。結果表明，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對斑馬魚中毒；對大型溞、蜜蜂和家蠶低毒；基于生長抑制率和生物量增長抑制率，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑對羊角月牙藻的毒性分別為中毒和高毒，23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對羊角月牙藻的毒性都為高毒。通過進一步的風險評估可知，這2種復配劑對蜜蜂的風險等級為可接受，但對家蠶的風險等級為不可接受，因此在蠶室及桑園附近禁用這2種復配劑，并在桑田周圍種植高大樹木作為隔離帶，以減少漂移的農藥量。

關鍵詞：乙羧氟草醚；草銨膦；高效氟吡甲禾靈；農藥復配劑；環境非靶標生物；急性毒性；風險評估

中圖分類號：TQ457.2+9" 文獻標志碼：A" 文章編號：1003-935X（2024）02-0082-13

趙" 玲，沈" 鵬，葉" 劍，等. 草銨膦·高氟吡·乙羧氟2種不同復配劑對環境非靶標生物的急性毒性與風險評估［J］. 雜草學報，2024，42（2）：82-94.

doi：10.19588/j.issn.1003-935X.2024.02.0010

Acute Toxicity and Risk Assessment of Two Different Combination Agents of Haloxyfop-P-Methyl·Glufosinate-Ammonium·Fluoroglycofen-Ethyl to Environmental Non-Target Organisms

ZHAO Ling1， SHEN Peng1， YE Jian1， CHEN Qianqiu1， ZHEN Guojian1， WU Yan1， CAO Qinfang1， WU Jing1， WANG Honglei2

（1.Jiangsu EverTest Co.，Ltd.，Nanjing 210046，China； 2.Jiangsu Pesticide Research Institute Co.，Ltd.，Nanjing 210046，China）

Abstract：An experiment was set up to explore novel pesticide formulations and mitigate pesticide pollutants in environment. In this work，we screened five non-target organisms of Danio rerio，Daphnia magna，Pseudokirchneriella subcapitata，Apis mellifera and Bombyx mori and two combination agents of glufosinate-ammonium·haloxyfop-P-methyl·fluoroglycofen-ethyl 21% EW and glufosinate-ammonium·haloxyfop-P-methyl·fluoroglycofen-ethyl

收稿日期：2023-01-15

作者簡介：趙" 玲（1991—），女，河南鄧州人，碩士，中級工程師，從事毒理分析檢測研究，E-mail：zhaoheqiyun@163.com；共同第一作者：沈" 鵬（1986—），男，安徽亳州人，碩士，中級工程師，從事環境影響評價和分析測試研究，E-mail：shenpengslwp@163.com。

通信作者：王洪雷，正高級工程師，從事化學分析、制劑加工、科研生產管理研究。E-mail：wanghonglei@lucaschem.com。

23% ME，and then carried out acute toxicity determination using UPLC-MS/MS.The result showed that toxicity of the two combination agents to D. rerio was moderate，and to D. magna，A. mellifera and B. mori was low. Based on inhibitory rate of growth and biomass gain，toxicities of glufosinate-ammonium·haloxyfop-P-methyl·fluoroglycofen-ethyl 21% EW to P. subcapitata were moderate and high，and toxicities of glufosinate-ammonium·haloxyfop-P-methyl·fluoroglycofen-ethyl 23% ME were all high. Then through a step forward of risk assessment，these two combination agents were acceptable to A. mellifera，but unacceptable to B. mori. Therefore，these two combination agents were banned in the silkworm rearing room and the nearby of mulberry plantation，and tall trees as isolation belts were planted around the mulberry field to reduce the amount of drifting pesticides.

Key words：fluoroglycofen-ethyl；glufosinate-ammonium；haloxyfop-P-methyl；combination agent；non-target organism in environment；acute toxicity；risk assessment

乙羧氟草醚（fluoroglycofen-ethyl）是一種新型高效二苯醚類除草劑，具有高效、低毒、見效快、應用范圍廣等優點，常用于小麥、大麥、花生、大豆和水稻等大田除草［1］。高效氟吡甲禾靈（haloxyfop-P-methyl，HPME）是芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，是油菜田防除一年生禾本科雜草的主要藥劑。此類除草劑長期單一、不合理地使用，在環境中已被廣泛檢出［2-4］。草銨膦（glufodinat）屬于新型廣譜長效觸殺型化學除草劑，是世界上第二大轉基因作物耐受除草劑［5］。高效氟吡甲禾靈和草銨膦都具有活性高、殺草譜廣、選擇性強、吸收性好，被廣泛應用于對禾本科雜草和闊葉雜草的防治［6-8］。有研究表明，草銨膦會造成人體DNA氧化性損傷［9］。農藥在農業生產使用過程中，通過地表徑流、雨水沖刷以及地下水滲透等過程進入水體中影響環境非靶標生物［10-11］，隨后通過食物鏈對環境和人類造成危害。因此，開展其環境非靶標生物毒性的相關研究可以評價其對水體的安全性，對環境安全和人類健康評估具有重要意義。

長期施用單一除草劑，易使雜草產生抗藥性。隨著農業的發展和市場需求的增長，乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦之間各種復配制劑大量研發并登記使用，組合施用具有增加靶區、擴大除草劑譜、延長施用期限、降低殘留活性、減少危害和延緩抗藥性等諸多優點［12-13］。近年來，關于草銨膦對非靶標生物的毒性研究報道比較多，Xiong等在研究草銨膦對斑馬魚胚胎的免疫毒性時發現，草銨膦不僅能降低斑馬魚胚胎的存活率，同時還會對斑馬魚胚胎造成一系列形態畸形［14］。草銨膦對于水生生物的生長毒性、基因毒性、免疫毒性、生殖毒性等方面均存在毒性效應［14］。Qian 等研究了草銨膦對水生單細胞小球藻的毒性，發現草銨膦對小球藻產生了一定的氧化損傷，通過電鏡可觀察到有大部分葉綠體異常，小球藻中與光合作用有關的光合基因轉錄豐度降低［15］。值得注意的是在使用時為了達到更好的防治效果，常與其他藥效的農藥一起施用，應多關注農藥在聯合用藥時的綜合影響［16］。乙羧氟草醚可以使生物體內分泌系統紊亂，并具有較強的致突變性［17-18］，高毒性的乳氟禾草靈可以使人致畸、致癌，同時對各類魚蝦以及水生無脊柱無脊椎生物具有高毒［19］。近年來，高效氟吡甲禾靈長期單一、不合理地施用，經常作為污染物在環境中被檢出［3］。高效氟吡甲禾靈一般不易發生光化學降解或熱分解，因此在環境中較穩定，并且具有一定的生物累積性，有研究表明，高效氟吡甲禾靈能損傷鼠類生精細胞，誘發其形態變化［20］。目前，農藥對非靶標生物的毒性評估大都以單一毒性確定，因而不能反映出多種農藥共同作用的毒性效應。本研究建立了液相色譜-串聯質譜法對21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑進行定量與定性分析，測定其對非靶標生物的聯合毒性分級，并結合相關數據進一步進行風險評估，為農藥登記、雜草防治、安全施用提供了依據，且其聯合毒性和風險評估的結果對于新型制劑的開發研究和減輕環境污染具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1" 供試藥劑和試劑

供試藥劑：21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑（簡稱水乳劑，山東潤揚化學有限公司），其中乙羧氟草醚1%，草銨膦19.5%，高效氟吡甲禾靈0.5%；23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑［簡稱微乳劑，禾美思（山東）植物保護有限公司］，其中草銨膦20%，高效氟吡甲禾靈2%，乙羧氟草醚1%。

試劑：乙羧氟草醚標樣（純度98.9%）、高效氟吡甲禾靈標樣（純度99.1%，上海市農藥研究所有限公司）；草銨膦標樣（純度98.6%，上海安譜璀世標準技術服務有限公司）；乙腈（色譜純，TEDIA公司）；氯化鈉（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；芴甲氧羰酰氯（fmoc-chloride，純度99.0%，Sigma公司）；四硼酸鈉（純度99.5%，上海凌峰化學試劑有限公司）；丙酮（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；魚安定（湖南省漁夫寶水產用品有限公司）；小型熱帶魚專用飼料（山東貝森水產飼料有限公司）；氯化鈉（分析純）、乙酸乙酯（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；氯化鈉（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；甲酸（分析純）、重鉻酸鉀（純度99.8%，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2" 儀器設備

Agilent Technologies 6490液相質譜聯用儀（美國安捷倫科技公司）；XS105DU分析天平（梅特勒托利多集團）；純水儀［默克化工技術（上海）有限公司］；KQ5200B超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；TG20M離心機（湖南平凡科技有限公司）；GL-88B旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；REI-03旋轉蒸發儀（杭州大衛科教儀器有限公司）；S2-T Kit pH 計（梅特勒托利多集團）；HQ40D溶氧儀（美國哈希公司）；CENTER 309數顯溫度計（群特科技股份有限公司）；HI96735總硬度濃度測定儀，哈納；MNT-200游標卡尺［上海美耐特實業（集團）有限公司］；TES-1330A照度計（中國臺灣泰仕公司）；MGC-250BP-2 光照培養箱（上海一恒科技有限公司）；SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；LDZX-75KBS立式壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫療器械廠）；BX43生物顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；TS-2102GZ恒溫光照搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司）；LRH-250生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SHA-CA水浴恒溫振蕩器（上海江星儀器有限公司）；NV24A-Ⅱ濃縮氮吹儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.3" 非靶標生物的急性毒性試驗

本試驗研究中采用中華人民共和國農業農村部公告第2570號《農藥登記試驗質量管理規范》［21］、OECD準則［22］和文獻［23］中的方法進行2種供試藥劑對非靶標生物（供試生物）的急性毒性試驗，在試驗期間測定溫度、濕度、pH值、溶氧量、培養基硬度等參數，具體信息見表1。

1.3.1" 魚類急性毒性試驗

試驗選用斑馬魚作為供試生物，在試驗條件下馴養7 d，采用半靜態法進行染毒，根據預試驗結果，遵循GB/T 31270.12—2014 《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第12部分：魚類急性毒性試驗》［23］。根據預試驗結果，將所有供試物用曝氣自來水稀釋5個濃度組（表1）和1個空白對照組，各組均不設重復，每組投放7尾魚，每48 h更換1次試驗藥液，暴露 96 h，暴露開始后3、6、24、48、72、96 h觀察魚的死亡情況，分別在暴露后0、48、96 h從各濃度組和空白對照組取試驗藥液上機測定濃度，確保試驗期間供試藥劑濃度不低于理論濃度的80%。如果試驗期間供試藥劑濃度發生超過20%的偏離，則應檢測供試藥劑實際濃度并以此計算結果。

1.3.2" 溞類急性活動抑制試驗

試驗選用大型溞作為供試生物，確保所選母溞在實驗室條件下處于孤雌生殖狀態培養3代以上，且不是第1次懷卵。根據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第13部分：溞類急性活動抑制試驗》，采用靜態法進行染毒試驗。根據預試驗結果，將所有供試物用曝氣自來水稀釋成5個濃度組（表1）和1個空白對照組，濃度組設4次重復，每組放入5頭幼溞，燒杯加蓋培養皿后放入光照培養箱中暴露48 h，試驗期間不曝氣、不喂食，分別在暴露0、48 h時從各濃度組和空白對照組取試驗藥液上機測定濃度，確保試驗期間供試藥劑濃度不低于理論濃度的80%。如果試驗期間供試藥劑濃度發生超過20%的偏離，則應檢測供試藥劑的實際濃度并以此計算結果。在24、 48 h觀察并記錄幼溞的受抑制情況。

1.3.3" 藻類生長抑制試驗

試驗選用羊角月牙藻作為供試生物，將對數生長期的純種藻在試驗條件下培養，每隔3 d接種1次，反復接種2次，以此作為試驗用藻。根據GB/T 31270.14—2014 《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第14部分：藻類生長抑制試驗》，開展靜態試驗。根據預試驗結果，將所有供試藥劑用BG11培養基稀釋成5個濃度組（表1）和1個空白對照組。試驗用水為BG11培養基，各組均重復3次，使用生物顯微鏡確定羊角月牙藻培養液細胞濃度，計算得到預培養的2瓶羊角月牙藻培養液細胞濃度，分別為2.95×106、3.05×106個/mL，選擇濃度大的藻液作為接種液，用移液器向每次重復的錐形瓶中接種278 μL藻液，使得羊角月牙藻理論濃度約為1.00×104 個/mL。接種后將錐形瓶轉移至恒溫光照搖床中培養，錐形瓶隨機放在搖床上，并每天更換其位置，試驗周期為72 h，分別在暴露后0、24、48、72 h 從各濃度組和空白對照組中取試驗藥液上機測定濃度，確保試驗期間供試藥劑濃度不低于理論濃度的80%。如果試驗期間供試藥劑濃度發生超過20%的偏離，則應檢測供試藥劑的實際濃度并以此計算結果。

1.3.4" 對蜜蜂的急性經口毒性試驗

試驗選用蜜蜂作為供試生物，采用飼喂染毒糖水法對蜜蜂進行染毒。根據預試驗結果和GB/T 31270.10—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》，開展采用限度試驗，正式試驗僅設置1個濃度組（表1）和1個空白對照組，各組均重復3次，每次重復10頭蜜蜂。使用二氧化碳麻醉系統對蜜蜂進行麻醉，并隨機分配到貼有標簽的試驗籠中，饑餓處理 2 h。然后將試驗藥液（空白對照組為質量濃度50%的蔗糖溶液）放入用有標記的塑料離心管（底部有1個孔，直徑為 2 mm）做成的容量為1 mL的喂食器中，每次重復的施藥量為200 μL。放入黑暗環境中48 h，記錄給藥后24、48 h蜜蜂的死亡數和異常行為。

1.3.5" 對家蠶的急性毒性試驗

將家蠶放置在人工氣候箱中培養至2齡?；陬A試驗結果，根據GB/T 31270.11—2014 《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第11部分：家蠶急性毒性試驗》，正式試驗僅設置1個濃度組和1個空白對照組，空白對照組和濃度組各重復3次，每次重復20頭家蠶。將測試培養皿放置于可控的人工氣候箱內培養96 h，并記錄試驗開始后24、48、72、96 h家蠶的死亡數和異常行為。

1.4" 濃度分析檢測方法

1.4.1" 前處理

魚類、溞類、藻類試驗藥液中草銨膦前處理：取0.5 mL試驗藥液至10 mL離心管中，依次加入0.5 mL的50 g/L硼酸鈉溶液和 0.5 mL 的 10 g/L 芴甲氧羰酰氯衍生液，渦旋混勻振搖后至40 ℃水浴1 h，衍生后的樣品取1 mL過0.45 μm水系濾膜待測。

魚類和溞類試驗藥液中高效氟吡甲禾靈、乙羧氟草醚前處理：取5 mL試驗藥液至50 mL離心管中，依次加入2 g 氯化鈉和5 mL乙腈，渦旋 3 min，混勻，過0.22 μm有機濾膜，待測。

藻類試驗藥液中高效氟吡甲禾靈、乙羧氟草醚前處理：取試驗藥液10 mL，置于50 mL離心管中，依次加入2 g 氯化鈉和10 mL乙酸乙酯，渦旋 3 min，靜置5 min，取上層清液于氮吹瓶中氮吹濃縮至近干；加入1 mL乙腈，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.4.2" 儀器條件

采用液相色譜-三重四級桿質譜法測定，液相條件為色譜柱Eclipse Plus C18（2.1" mm×50 mm，1.8 μm，安捷倫科技有限公司），柱溫為45 ℃，進樣體積為5 μL；草銨膦流動相為0.1%甲酸 ∶乙腈體積比=40 ∶60，流速為 0.2 mL/min；高效氟吡甲禾靈和乙羧氟草醚流動相為0.1%甲酸 ∶乙腈體積比=20 ∶80，流速為0.3 mL/min。質譜條件：采用多離子反應監測（MRM）；離子源類型為AJS ESI，離子化方式為正離子，干燥氣溫度為200 ℃，干燥氣流量為 14 L/min；毛細管電壓為3.00 kV，霧化氣壓力為137.9 kPa；噴嘴電壓為1.50 kV；鞘氣體溫度為 250 ℃，鞘氣流量為11 L/min。具體質譜參數見表2。

1.4.3" 添加回收試驗

準確稱取19.99 mg草銨膦標準品，用超純水定容至20 mL容量瓶中，搖勻，配制成濃度為986 mg a.i./L的草銨膦標準儲備液；準確稱取20.02 mg高效氟吡甲禾靈標準品，用乙腈定容至20 mL容量瓶中， 搖勻， 配制成濃度為992 mg a.i./L的高效氟吡甲禾靈標準儲備液；準確稱取20.04 mg乙羧氟草醚標準品，用乙腈定容至20 mL容量瓶中，搖勻，配制成濃度為991 mg a.i./L的乙羧氟草醚標準儲備液。

取乙羧氟草醚和高效氟吡甲禾靈標準儲備液配，用乙腈配制成系列濃度（表3）并制作標準曲線。取草銨膦標準品，用超純水定配制系列濃度（表3）制作標準曲線。在曝氣自來水和BG11培養基中添加乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦（表3），按照樣品前處理后重復測定5次，在儀器分析條件下分析，并計算準確度和精密度。

1.5" 數據分析

通過Bliss軟件計算21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對非靶標生物的半致死濃度LC50、半最大效應濃度EC50及其95%置信限。

1.6" 風險評估

21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑的良好農業規范（GAP）信息見表4。

根據GAP信息可知，該農藥在小麥田中噴霧施用，農田內外常年均無水生生物生存的水生態系統，故可排除該藥使用對水生生物的暴露，且根據NY/T 2882—2016《農藥登記環境風險評估指南" 第2部分：水生生態系統》［24］要求，水生生物的暴露分析一般采用模型預測地表水中農藥的濃度，現階段僅有TOP-Rice模型可用于水稻田預測暴露分析濃度，該農藥申請登記作物不是水稻，不能用TOP-Rice模型預測暴露濃度，暫不對水生生態系統進行風險評估。

1.6.1" 蜜蜂風險評估

遵照NY/T 2882.4—2016《農藥登記" 環境風險評估指南" 第4部分：蜜蜂》［24］，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑防治對象為雜草，施用方法為莖葉噴霧，施用時間為雜草生長旺期，不能排除田內長有對蜜蜂具有吸引力的其他植物，有可能會對蜜蜂產生風險，因此需對蜜蜂進行風險評估。本產品為復配制劑，因此使用單位面積有效成分的施用量（g a.i./hm2）及毒性終點（μg a.i./頭）來進行風險評估。噴施農藥暴露場景的風險商值（RQSP）按下式進行計算［24］：

RQSP=ARLD50×50。

式中：RQSP表示噴施農藥暴露場景的風險商值；AR表示推薦的農藥單次最高施用量，g a.i./hm2或 g/hm2；LD50表示經口和接觸的蜜蜂半致死劑量，μg a.i./頭或μg/頭。

1.6.2" 家蠶風險評估

遵照NY/T 2882—2016《農藥登記環境風險評估指南第5部分：家蠶》［24］，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑防治對象為雜草，施用方法為莖葉噴霧，不直接用于桑樹，所以本評估不包括直接施用桑樹場景。施藥次數為1次，因此本評估采用單次施藥飄移場景來進行暴露分析。在飄移場景下進行評估并計算預測暴露濃度（PEC），該農藥單次噴霧施用，單次施藥后計算最外圍桑樹上的預測暴露濃度（PECsa-fr）和次外圍桑樹上的預測暴露濃度（PECsa-sr）。采用試驗得出的毒性終點（EnP）和相應的不確定因子（UF），計算預測無效應濃度（PNEC）。

根據PEC和PNEC計算RQ，RQ按下式進行計算［24］：

PECsa-fr=AR×PDFfr×RUD95×DFphi；

PECsa-sr=AR×PDFsr×RUD95×DFphi；

DFphi=e-ln2DT50×PHI；

PNEC=EnPUF；

RQ=PECPNEC。

式中：PECsa-fr表示單次施藥后最外圍1行桑樹上的預測暴露濃度，mg a.i./kg；PDFfr表示最外圍1行桑樹上的飄移因子；PECsa-sr表示單次施藥后次外圍1行桑樹上的預測暴露濃度，mg a.i./kg；DFphi表示桑葉上農藥的降解系數；DT50表示農藥在桑葉上的降解半衰期，d；PHI表示農藥最后一次使用距離桑葉采收的間隔期，d；PNEC表示預測無效應濃度，mg a.i./kg；EnP表示試驗得出的毒性終點，mg a.i./kg；UF表示不確定因子；PEC表示預測暴露濃度，mg a.i./kg。

按照GB/T 31270—2014 《化學農藥環境安全評價試驗準則" 第11部分：家蠶急性毒性試驗》［23］規定的對家蠶急性毒性試驗浸漬法得出LC50，mg a.i./L，沒有對桑葉上的農藥量進行精確定量，不能直接用于計算PNEC。因此，應計算出修正后的半致死濃度（LC50-C），mg a.i./kg，LC50-C按下式進行計算：

LC50-C=LC50-GB×Fc。

式中：Fc表示修正系數，默認為0.46 L/kg。

2" 結果與分析

2.1" 標準曲線

用乙腈配制0.01～2.00 mg a.i./L乙羧氟草醚和0.005～1.000 mg a.i./L高效氟吡甲禾靈標準溶液；用超純水配制0.03～9.00 mg/L（標準曲線1）和0.005 6～0.350 0 mg/L（標準曲線1）草銨膦標準溶液，衍生后上機。以標準溶液濃度為橫坐標（x）、峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，線性相關性試驗結果見表5，r2＞0.999，相關性良好，符合NY/T 3151—2017《農藥登記" 土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南》 ［25］中對決定系數的要求。

2.2" 準確度、精確度和濃度分析

向空白曝氣自來水和BG11培養基溶液加標進行添加回收試驗，每個濃度設置5個平行，乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦在水中的添加回收率和相對標準偏差見表6。乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦在曝氣自來水中的定量限分別為0.05、0.025、1 mg a.i./L，乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦在BG11培養基中的定量限分別為0.004、0.002、0.025 mg a.i./L，均符合NY/T 3151—2017《農藥登記" 土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南》 ［25］中對回收率、精密度和定量限的要求。

采用上述分析方法進行21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對魚類、溞類和藻類急性毒性試驗，取試驗藥液上機進行濃度分析，結果表明，在試驗期間，除了23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對羊角月牙藻急性毒性試驗中供試藥劑濃度相較于理論濃度發生超過20%的偏離，最終毒性結果使用試驗藥液實測濃度的幾何平均值進行計算外，其他試驗藥液中供試藥劑濃度始終不低于理論濃度的80%，最終毒性結果均使用供試藥劑的理論濃度進行計算，結果見表7。

2.3" 毒性效應

魚類、溞類和藻類以重鉻酸鉀為參照物進行驗證試驗，蜜蜂和家蠶以樂果為參照物進行驗證試驗。參照物的毒性值和95%置信限見表8，均在規定的試驗有效性范圍內。

在斑馬魚急性毒性試驗的96 h暴露期間，用玻璃棒輕觸魚尾部，沒有明顯的活動（如鰓動）、尾鰭沒有反應視為死亡，觀察和記錄后清理掉死魚。同時對一些異常行為作記錄?？瞻讓φ战M的死亡率為0，斑馬魚無異常行為；濃度組的斑馬魚出現躺在缸底、翻白、側游等異常行為。

在大型溞急性活動抑制試驗的48 h暴露期間，輕晃試驗容器，15 s內幼溞沒有向前游動則視為被抑制（觸角的輕晃不屬于向前游動）。除此之外，任何異常行為和表現（困在水面或褪色等）也需記錄。在觀察之后立即測定各組溶液的溫度、pH值和溶氧量?？瞻讓φ战M大型溞無異常行為，濃度組的大型溞除死亡外也無異常行為。

在對羊角月牙藻的生長抑制的72 h暴露期間，用生物顯微鏡（目鏡10倍、物鏡40倍）對24、48、72 h的羊角月牙藻進行細胞計數，并在結束暴露時用顯微鏡觀察細胞形態。每天測定并記錄搖床內的溫度、轉速和光照。空白對照組藻細胞生長狀況良好，外觀正常，未出現中毒癥狀，濃度組藻細胞生長受到一定程度的抑制，并出現細胞碎片的中毒癥狀。

在蜜蜂急性經口毒性試驗的48 h給藥期間，濃度組蜜蜂出現躺在籠內和垂死的異常行為，空白對照組蜜蜂無異常行為。

在家蠶急性毒性試驗的96 h給藥期間，濃度組家蠶出現甩頭、晃頭、扭曲掙扎、吐水、攝食減少或抗拒、全部死亡的異常行為，空白對照組蜜蜂無異常行為。

2.4" 毒性等級

在21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑的暴露下，5種非靶標生物都產生一定的毒性作用。根據各試驗終點數據進行統計分析及毒性等級劃分，毒性數據分析見表9，根據文獻［24］的毒性等級劃分，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對斑馬魚均為中毒，對大型溞均為低毒，對蜜蜂和家蠶均為低毒；基于生長率抑制率和基于生物量增長抑制率，21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑對羊角月牙藻的毒性分別為中毒和高毒，23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對羊角月牙藻的毒性都為高毒。

2.5" 初級風險評估

根據表10的初級風險評估結果可知，2種供試農藥對蜜蜂的風險商值RQ均小于1，風險可接受。

家蠶在飄移場景下進行評估并計算單次施藥條件下的預測暴露濃度（PEC），21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑單次噴霧施用0.945 kg a.i./hm2，23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑次噴霧施用1.035 kg a.i./hm2，單次施藥后計算2種供試農藥最外圍桑樹上的預測暴露濃度（PECsa-fr）為82.084 9、89.902 5 mg a.i./kg，次外圍桑樹上的預測暴露濃度（PECsa-sr）為5.025 6、5.504 2 mg a.i./kg，結果見表11。根據預測暴露濃度（PEC）除以預測無效應濃度計算RQ值，結果見表12，2種供試藥劑用最外圍桑樹場景下的風險商值RQ均大于1，說明用最外圍桑葉飼喂家蠶的風險不可接受；次外圍桑樹場景下的風險商值RQ均小于1，說明用次外圍桑葉飼喂家蠶的風險可接受。

3" 結論與討論

3.1" 試驗藥液分析方法建立

目前，尚未見有關于同時測定乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦的分析方法以及對環境非靶標生物聯合毒性的報道。本研究建立了基于液相色譜-串聯質譜法測定曝氣自來水和BG11培養基中乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈和草銨膦濃度的定性定量分析方法，本方法簡單快捷、準確度和精密度好，能夠滿足對環境非靶標生物試驗中此類化合物同時測定的要求，在進行魚類、溞類和藻類急性毒性試驗時分析供試藥劑的濃度，結果表明，除了微乳劑對藻類供試藥劑濃度發生超過20%的偏離，最終毒性結果使用供試藥劑的實測濃度的幾何平均值進行計算，其他試驗期間供試藥劑濃度始終不低于理論濃度的80%，最終毒性結果使用供試藥劑的理論濃度計算。

3.2" 供試物對環境非靶標生物的急性毒性

遵循GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》要求在實驗室環境條件下進行21%草銨膦·高氟吡·乙羧氟水乳劑和23%草銨膦·高氟吡·乙羧氟微乳劑對環境非靶標生物的急性毒性試驗，并根據GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》［23］的毒性等級進行劃分。

有研究報道，草銨膦原藥對小球藻、大型溞、斑馬魚［16］、蜜蜂［26］均為低毒；30%草銨膦水乳劑對蜜蜂低毒［27］；200g/L草銨膦水劑對家蠶低毒［28］。乙羧氟草醚原藥對溞低毒、對藻高毒［29］；10%乙羧氟草醚乳油對斑馬魚高毒、對蜜蜂和家蠶低毒［30］。高效氟吡甲禾靈對四尾柵藻低毒［31］，對羊角月牙藻中毒［4］，對藍鰓太陽魚［32］和虹鱒魚高毒 ［4］，對大型溞中毒［4］，對蜜蜂低毒［33］。

本研究結果表明，水乳劑和微乳劑對斑馬魚的急性毒性均為中毒。從毒性結果上看，草銨膦、乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈的聯合用藥比乙羧氟草醚單劑用藥對斑馬魚的毒性輕一些。

水乳劑和微乳劑對大型溞、蜜蜂和家蠶均為低毒，與草銨膦和乙羧氟草醚的原藥、制劑毒性結果報道一致，對比其他研究報道高效氟吡甲禾靈對大型溞中毒［4］，可見草銨膦、乙羧氟草醚、高效氟吡甲禾靈的聯合用藥比高效氟吡甲禾靈單劑用藥對大型溞的毒性輕一些。

水乳劑和微乳劑對羊角月牙藻的72 h-EC50毒性分別為中毒和高毒、72 h-EyC50毒性都為高毒，與乙羧氟草醚的原藥毒性結果報道接近，雖然草銨膦對羊角月牙藻低毒、高效氟吡甲禾靈對羊角月牙藻中毒但聯合用藥并沒有減輕乙羧氟草醚對羊角月牙藻的毒性。在有藻類的地方實際施用時，選用水乳劑比微乳劑相對來說對環境危害小一些，由于毒性效應受到多種環境因子制約并與藻的種類有關，本研究僅是復配農藥對非靶標生物毒性效應的初步試驗，在室內模擬條件下進行，無法反映出完整生態環境對藻生長的影響，又基于生物量增長微乳劑和水乳劑對羊角月牙藻的毒性都為高毒，故同時還需要注意兩者的長期毒性。另外，對于農藥的多種有效成分聯合使用后的效應機制，還有待進一步探討。

3.4" 供試物對環境非靶標生物的急性毒性

2種供試農藥對水生生物藻類危害極大，魚類次之，對大型溞和陸生生物蜜蜂、家蠶相對友好，田間施用過程中應注意施用劑量、范圍以及方法，在有藻類生長的池塘、河流、溝渠的地方盡量避免施用此類農藥或者控制用量，以免造成環境污染。由于2種供試農藥用于小麥噴霧使用，農田內外均無常年有環境非靶標生物生存的水生態系統，故不對水生生態系統進行風險評估，本研究評估了2種供試農藥對蜜蜂和家蠶的風險，2種供試農藥對蜜蜂的風險商值RQ均小于1，說明風險可接受，對蜜蜂具有一定的安全性。2種供試農藥最外圍桑樹場景下的風險商值RQ均大于1，說明用最外圍桑葉飼喂家蠶的風險不可接受；次外圍桑樹場景下的風險商值RQ均小于1，說明用次外圍桑葉飼喂家蠶的風險可接受，對家蠶具有危害，因此在桑田鄰近區域施用這2種農藥，在采摘桑葉時不可采摘最外圍的桑葉。由此可見，在蠶室附近禁用這2種農藥，并在桑田周圍種植高大樹木作為隔離帶以減少漂移到桑田的農藥量。

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