瀕危植物華木蓮葉片組織培養初探

摘"要：華木蓮是木蘭科的珍貴瀕危樹種，具有重要的潛在應用價值。本研究采用華木蓮葉片為實驗材料，通過單因素實驗，探究華木蓮葉片誘導愈傷組織的最佳消毒時長、最適宜激素濃度配比及最佳培養基。結果表明：（1）以0.1%的升汞溶液（HgCl2）作為消毒劑，消毒時長為8 min時，華木蓮葉片誘導愈傷組織培養外植體污染率最低；（2）MS培養基為華木蓮葉片組織培養的最佳基本培養基；（3）華木蓮葉片誘導愈傷組織形成最適激素配比為MS + 2.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L IBA。研究結果是對華木蓮組織培養技術的經驗總結，同時對華木蓮的保護與利用有一定的實際意義。

關鍵詞：華木蓮；愈傷組織；消毒時長；激素濃度配比；培養基

中圖分類號：S792.99""""""文獻標識碼：A""""""文章編號：20959699（2024）03002305

華木蓮（Sinomanglietia glauca Q. Y. Zheng）又稱為落葉木蓮，是木蘭科木蓮屬落葉喬木，目前僅孤島狀分布于江西省宜春市的明月山和湖南省永順縣的朗溪鄉[1]，野外群體的面積不足36 km2，1996年被列為國家一級保護植物，收錄于《國家重點保護野生植物名錄》中。華木蓮是中國特有單屬種，其在木蘭科中的獨特進化地位，對于研究木蘭科系統發育進化有重要作用[2]；同時，華木蓮樹形端莊優美，花大芬芳、花香沁人心脾，具有較高的園林觀賞價值，已逐漸成為園林綠化的優良樹種，被江西省宜春市評為市花[3-4]。然而，野生華木蓮種子萌發率和結實率較低，傳統的實生繁育手段無法滿足社會對華木蓮日益增長的需求[5-6]。

植物組織培養指的是在無菌條件下，將離體植物組織接種在特定培養基上進行培養的一種技術手段。目前，植物組織培養已經成為獲得可再生完整植株的重要技術手段，同時也普遍應用于生產具有經濟效益的植物衍生產品[7]。將植物組織培養技術應用到華木蓮的繁育中，不僅可實現華木蓮種苗的規?；a，提升華木蓮快速繁育能力，對華木蓮野生資源的保護以及開發利用亦有重要意義[8-10]。

近年來，組培技術已經在轉基因育種、果蔬苗木栽植以及珍稀植物種質資源保存中得到廣泛推廣和應用，特別是在對瀕危植物的離體快速繁殖體系的構建中，取得較大進展[11-14]。但是，針對華木蓮組織培養技術尚未取得突破性進展。本研究采用華木蓮葉片為實驗材料，通過單因素實驗，探究華木蓮葉片誘導愈傷組織的最佳消毒時長、最適宜激素濃度配比及最佳培養基，以期為華木蓮種質資源保護及創新、苗木生產及繁育提供實驗參考。

1"材料與方法

1.1"實驗外植體準備

實驗材料取自景德鎮學院苗圃地正常生長的華木蓮苗木，挑選生長健壯的華木蓮植株，剪取若干帶葉柄的嫩葉，先用自來水簡單沖洗后，然后用洗衣粉溶液洗去表面灰塵和雜質，再用清水沖洗20～30 min，將葉片放入事先準備好的蒸餾水中浸泡10 min，不斷搖晃，以便充分清潔。用0.1%的升汞溶液（HgCl2）浸泡30 s，以75%的酒精浸泡10 s，用無菌水沖洗1～2 min。用剪刀去除葉片主脈和葉緣，修剪成2.5 cm見方的方形葉片。將經過處理的葉片放入培養皿中，置于超凈工作臺，打開紫外線燈照射消毒殺菌30 min后待用。

1.2"實驗試劑

基礎培養基采用MS培養基，來源于Phyto Technology Laboratories（簡稱Phyto Tech）的Murashige amp; Skoog（含維生素）；B5培養基、富鹽平衡培養基和高硝態氮培養基等按照陳世昌和徐明輝的方法進行配制[15]；凝固劑采用瓊脂，來源于MicroanalysisInc 的Agar Powder；細胞分裂素使用6芐氨基嘌呤（6BA），即6Benzyil aminopurine；生長素使用吲哚乙酸（IBA），即Indole Acetic Acid。

1.3"實驗方法

將處理好的材料放入高溫滅菌的無菌錐形瓶中，用濃度為75%的酒精浸泡30 s，去離子水沖洗3～5次，使用濃度為0.1%的升汞溶液進行殺菌消毒。分別進行如下處理：

1.3.1"消毒時長

將處理好的實驗材料進行消毒，消毒時長分別設置為3 min、4 min、5 min、6 min、8 min、10 min，消毒后再用去離子水沖洗3～5次，充分洗凈，然后放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在事先配制好的MS + 1.5 mg/L 6BA+0.2 mg/L IBA培養基里面。每個消毒時長處理10瓶，每瓶3～5個葉片。

1.3.2"基本培養基

將處理好的材料分別接種至MS培養基、B5培養基、富鹽平衡培養基、高硝態氮培養基中。每種培養基處理20瓶，每瓶3～5個葉片。

1.3.3"激素濃度配比

將處理好的材料接種至MS培養基，分別添加6BA（0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L）和IBA（0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L）。每個處理20瓶，每瓶3～5個葉片，具體實驗設置如下：

（1）MS培養基 + 6BA 0.50 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（2）MS培養基 + 6BA 1.00 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（3）MS培養基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.05 mg/L；

（4）MS培養基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.10 mg/L；

（5）MS培養基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.20 mg/L；

（6）MS培養基 + 6BA 1.50 mg/L + IBA 0.40 mg/L；

（7）MS培養基 + 6BA 2.00 mg/L + IBA 0.20 mg/L；

（8）MS培養基 + 6BA 2.00 mg/L + IBA 0.40 mg/L。

1.3.4"數據統計與分析

采用Excel 2020軟件進行數據的錄入、整理和方差分析。華木蓮外植體的污染率、存活率、愈傷率等計算公式如下［13-15］：

污染率（%）=污染的外植體個數÷接種外植體個數×100%；

存活率（%）=成活的外植體個數÷接種外植體個數×100%；

愈傷率（%）=誘導出愈傷組織的外植體個數÷接種外植體個數×100%。

2"研究結果

2.1"消毒時長對華木蓮葉片誘導愈傷組織的影響

華木蓮外植體污染率、存活率和愈傷率受葉片消毒時長的影響較為明顯，隨消毒時長增加，華木蓮外植體污染率逐漸下降（表1）。當消毒時長為3 min時，污染率達到了100%；當消毒時長增加到4 min時，其污染率降低到了84.22%；當消毒時長增加到6 min時，華木蓮外植體污染率降低到43.25%；當消毒時長調整到8 min和10 min時，華木蓮外植體的污染率分別為25.32%和23.58%，明顯低于短時間（3 min、4 min、5 min）消毒處理下的污染率，但是兩者之間的差異不明顯。

隨消毒時長增加，華木蓮葉片誘導愈傷組織存活率和愈傷率呈現出先升高后降低的變化趨勢（表1）。當消毒時長為3 min和4 min時，華木蓮葉片誘導愈傷組織存活率較低，分別為23.52%和2517%；當消毒時長為5 min和6 min時，華木蓮愈傷組織存活率可提升至34%左右；當消毒時長為8 min時，華木蓮葉片誘導愈傷組織存活率和愈傷率均最高，分別為67.85%和37.82%；當消毒時長增加到10 min時，存活率和愈傷率均降低，分別為63.28%和35.67%。綜合實驗數據，對比污染率、愈傷率和存活率3個指標，本次實驗得出華木蓮葉片誘導愈傷組織的最佳消毒時長為8 min。

2.2"基本培養基對華木蓮葉片誘導愈傷組織的影響

基本培養基對華木蓮葉片誘導愈傷組織的產生有明顯影響（表2）。MS培養基的愈傷組織誘導率最高，其污染率為37.50%，存活率達到了最高的65.82%，而愈傷率也達到了38.57%，切口有較多的愈傷組織形成，愈傷組織的生長速度較快；B5培養基的愈傷組織誘導率相比較于MS培養基偏低，污染率為39.53%，存活率為40.37%，愈傷率為23.79%，愈傷組織的生長比較緩慢，且愈傷組織形成較少；富鹽平衡培養基的愈傷組織誘導率較低，污染率為35.59%，存活率為45.28%，愈傷率為2813%，愈傷組織形成較少，且生長十分緩慢；高硝態氮培養基的愈傷組織誘導率最低，污染率很高，污染率達到了45.76%，愈傷率只有12.18%，幾乎沒有愈傷組織形成，且存活率僅有29.73%。MS培養基是進行華木蓮葉片誘導愈傷組織有效形成的最佳培養基。

2.3"激素濃度配比對華木蓮葉片誘導愈傷組織的影響

華木蓮葉片誘導愈傷組織形成與激素的濃度配比組成具有較大相關性（表3）。在IBA濃度一定時，6BA濃度的增加會導致華木蓮葉片誘導愈傷組織污染率略有降低，同時存活率和愈傷率出現不同程度的增加（表3處理1-3）。當6BA濃度一定時，IBA濃度增加則會使得華木蓮葉片誘導愈傷組織的污染率呈現先降低后增加的變化趨勢，同時伴隨著愈傷組織存活率和愈傷率先增大后降低（表3處理3-6）。當培養基激素配比分別為（2.0 mg/L6BA + IBA 0.2 mg/L）時，愈傷組織誘導率較高（約36.25%），切口的愈傷組織形成數量較為可觀，生長速度較快，呈乳白色、疏松，形成的愈傷組織的質量較好。綜合實驗數據，可以得出本次實驗華木蓮葉片誘導愈傷組織形成最適激素配比為MS + 6BA 2.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L。

3"討論

經過數十年的研究、探索與發展應用，植物的組織培養技術已經日趨成熟，形成了材料選擇與前處理、外植體制備、接種和培養、移栽煉苗等四個主要階段。其中，接種和培養過程中無菌體系的建立是組織培養的核心，而外植體制備過程中的消毒處理又是重中之重[15]。外植體消毒時長直接影響愈傷組織污染率和存活率。0.1%升汞溶液是進行組織培養時的常用消毒劑，但是不同植物材料的最適消毒時長存在明顯差異，例如桂花嫩葉組織的最佳消毒時長約為5 min[16]；中華枸杞的最適消毒時長約為8 min[17]；華木蓮莖段最佳消毒時長為7 min [18]。

MS培養基是植物組織培養中的常用培養基之一，根據研究目的不同，學者們又開發出不同種類的培養基類型，例如林志魁等[18]指出，改良MS培養基可有效誘導不定芽的產生；吳幼媚等[19]在MS培養基中加入Ca（NO3）2能夠誘導初始芽的產生，促進芽的正常生長。研究發現，與其他類型的培養基相比，MS培養基接種的華木蓮葉片誘導愈傷組織污染率較低，成活率最高（約為65.82%），同時切口有較多的愈傷組織形成，愈傷組織生長較快，因此MS培養基是進行華木蓮葉片誘導愈傷組織的最適培養基類型。

外源激素可有效誘導外植體不定芽分化以及芽苗生根培養，對植物組織培養有重要作用。6BA和IBA是植物組織培養中應用最廣的激素類型。辜夕容等[20]發現，低濃度的6BA有利于香樟莖段愈傷組織的形成與生長。外源激素不僅可以單獨起作用，激素間的不同配比對植物外植體愈傷組織形成有較大影響。任菲宏等[21]發現，單獨添加6BA或生長素NAA均可誘導沙子空心李芽的分化；但是以適當比例配置6BA與生長素NAA時，誘導增殖效果明顯提升。研究發現， 2.0 mg/L6BA + IBA 0.2 mg/L的配比是適用于華木蓮葉片誘導愈傷組織形成的最適激素配比，在這種激素水平下，華木蓮葉片外植體污染率最低，同時能夠維持最高的存活率。

4"結論

文章研究了不同消毒時間、激素配置和培養基對瀕危植物華木蓮組織培養的影響，測定了不同處理條件下華木蓮愈傷率、污染率和存活率等關鍵指標。實驗表明：以0.1%的升汞溶液作為消毒劑，伴隨消毒時間增加，華木蓮愈傷組織污染率逐漸降低，綜合考慮污染率、愈傷率和存活率等指標，8 min是華木蓮葉片組織培養的最適時間；MS培養基可作為華木蓮葉片誘導愈傷組織的最適培養基類型；2.0 mg/L 6BA + 0.2 mg/L IBA是適用于華木蓮葉片植物組織培養的最佳外源激素配比，在此條件下，華木蓮葉片誘導形成的愈傷組織污染率最低，同時能夠保持較高的存活率。

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責任編輯：肖祖銘

Preliminary Study on Leaf Tissue Culture of Endangered Plant Sinomanglietia glauca

YU Yiliang， DONG Xia， LING Yu， CHENG Ranran

（Jingdezhen University， Jingdezhen 333400， China）

Abstract： Sinomanglietia glauca is a precious and endangered tree species in Magnoliaceae family， with important potential application value. In this study， the optimal disinfection time， optimal hormone concentration ratio and optimal culture medium to induce callus were explored with leaves of Sinomanglietia glauca through single factor experiment. The results showed that： （1） 8 minutes was the optimal disinfection time， with 0.1% mercuric chloride solution （HgCl2） as disinfectant; （2） MS medium was the optimal basic medium for tissue culture of leaves of Sinomanglietia glauca; （3） The optimal hormone ratio for inducing callus formation in leaves was MS+2.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L IBA. These results are a summary of experience in tissue culture techniques of Sinomanglietia glauca， and have practical significance for its protection and utilization.

Keywords： Sinomanglietia glauca; disinfection duration; hormone concentration ratio; culture medium