畢赤酵母分泌型遺傳操作工具的構建與優化

摘要：為了解決畢赤酵母遺傳操作效率低且流程繁瑣的問題，提高其應用價值，構建并優化了分泌型遺傳操作工具。首先，以α-淀粉酶為報告蛋白，通過融合自主復制序列構建非整合型表達質粒；其次，借助通用引物和POE-PCR，快速篩選評估與目的蛋白最匹配的內源信號肽；最后，構建以亞磷酸鹽為唯一磷源的營養依賴型篩選標記。結果表明：2種非整合型質粒表達α-淀粉酶的酶活分別是整合型質粒的2倍和1.6倍；以FLO10、EXG1和MSB2為信號肽引導的α-淀粉酶酶活分別是常規信號肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍；亞磷酸脫氫酶基因（ptxD）成功篩選出異源表達α-淀粉酶的重組菌株。研究簡化了基因操作流程，改進了遺傳操作工具，開發的綠色安全且低成本的營養依賴型篩選標記，有助于畢赤酵母分泌表達系統的應用和推廣。

關鍵詞：

合成生物學；畢赤酵母；分泌表達；復制子；信號肽；篩選標記

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2024yx04008

Constructionandoptimizationofsecretorygenetic

manipulationtoolsinPichiapastoris

ZHANGMengyu，WANGYihan，LIHan，LITianming，FENGHuiyong

（SchoolofFoodandBiology，HebeiUniversityofScienceandTechnology，Shijiazhuang，Hebei050018，China）

Abstract：

InordertosolvetheproblemsoflowefficiencyandcumbersomeprocessofPichiapastorisgeneticmanipulation，secretorygeneticmanipulationtoolswereconstructedandoptimizedtoimprovetheirindustrialproductionandapplicationvalue.Firstly，theα-amylasewasemployedasthereporterprotein，andthenon-integratedexpressionplasmidwasconstructedbyfusingtheself-replicatingsequence.Secondly，endogenoussignalpeptidesthatbestmatchthetargetproteinwerequicklyscreenedandevaluatedusinguniversalprimersandPOE-PCR.Finally，anutrition-dependentscreeningmarkerwasconstructedwithphosphiteasthesolephosphorussource.Theresultsindicatethatnon-integratedplasmidsexpressα-amylasewith2-foldand1.6-foldhigherenzymeactivitycomparedtointegratedplasmids，respectively;TheuseofFLO10，EXG1，andMSB2signalpeptidesresultsin2.5-fold，1.94-fold，and1.75-foldhigherα-amylaseactivitythantheconventionalsignalpeptideα-MF，respectively;Arecombinantstrainforheterologousexpressionofα-amylaseissuccessfullyscreenedusingthephosphitedehydrogenasegene（ptxD）.Theprocessofgeneoperationissimplified，thegeneticoperationtoolsareimproved，andgreen，safe，andlow-costnutrition-dependentscreeningmarkersareprovided，whichlaysafoundationfortheapplicationandpromotionofthePichiapastorissecretoryexpressionsystem.

Keywords：

syntheticbiology;Pichiapastoris;secretoryexpression;replicon;signalpeptide;screeningmarker

巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris，又稱Komagataellaphaffii）是一種非常規甲基營養型酵母，被美國食品藥品監督管理局認定為GRAS（generallyrecognizedassafe，即公認安全的食品成分）微生物[1]，其具有表達效率高、分泌能力強、易于高細胞密度培養、產物純化回收成本低等優勢，適合用于大規模工業化生產，且在食品和藥品領域有廣闊的應用潛力[2]，是目前最常用的真核表達宿主之一[3]，甚至超過了釀酒酵母[4]。然而，畢赤酵母在應用中缺少穩定的非整合型質粒[5]，基因操作的主要載體仍然是整合型質粒，整合型質粒的拷貝數低，通常采用高濃度抗生素篩選或在體外構建不含復制子的多拷貝表達載體[6]。由于抗生素用量較高、操作相對復雜、同源重組及轉化效率較低、整合后染色體不穩定等問題，使得開發非整合型質粒成為研究重點。

由于畢赤酵母分泌機制的復雜性，仍然有多種蛋白質的表達量相對較低[7]。為了提高異源蛋白的分泌表達，通常將目的蛋白融合在信號肽的C末端，促進其分泌[8]。目前，釀酒酵母的α交配因子信號肽（α-MF信號肽）在畢赤酵母中應用最為廣泛[9]。CHAHAL等[10]通過密碼子優化、疏水區域改造等策略，可以有效提高α信號肽在畢赤酵母中介導的分泌效率，但是不同類型的外源蛋白需要通過實驗選擇表達效果最好的信號肽[11]。隨著人們對畢赤酵母X33蛋白質組的深入研究，發現一些畢赤酵母內源信號肽也有較強的分泌能力，并且推測內源信號肽更容易被宿主識別，從而有利于外源蛋白的分泌[12-13]。篩選標記是載體轉化酵母時篩選轉化子所必須的元件，畢赤酵母的表達質粒有抗性篩選標記和營養缺陷型篩選標記。近年來，因抗生素及其抗性基因被視為一類新的污染物[14]，使得其向環境的釋放受到限制，加上抗生素價格昂貴，因此需要開發具有低環境風險的篩選標記。ZHUANG等[15]在釀酒酵母中表達亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），使攜帶該基因的菌株在以亞磷酸鹽作為唯一磷源的選擇培養基上正常生長，而不攜帶該基因的菌株不能生長，從而達到菌株篩選目的。該篩選標記在畢赤酵母中的應用還未見報道。

本研究通過構建可以穩定存在于畢赤酵母中的非整合型載體，避免載體線性化等復雜步驟，使后續基因操作更為簡便。在非整合型質粒的基礎上優化α信號肽，分析和克隆15個畢赤酵母內源信號肽。以α信號肽作為對照，α-淀粉酶為報告蛋白，評估信號肽的分泌能力，開發新型營養依賴的篩選標記基因亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），并將此篩選標記應用到畢赤酵母遺傳操作系統上，克服抗生素價格昂貴及污染的問題，為畢赤酵母分泌表達系統提供更加高效便捷的遺傳操作工具。

1材料和方法

1.1材料

本研究所使用的菌株、質粒詳情見表1。

酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖，均購自OXOID生物制品有限公司；DNS試劑盒，購自Solarbio公司；凝膠DNA小量回收試劑盒，購自Magen公司；超薄DNA產物純化試劑盒，酵母質粒提取試劑盒，質粒小提中量試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；KODDNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶EcoRⅠ，KpnⅠ，NdeⅠ和XbaI，購自ThermoScientific公司；DNAMarker，6×DNALoadingBuffer，購自北京全式金生物科技公司；博來霉素，購自Invitrogen公司；其他試劑均為國產分析純。

LLB培養基10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉，調節pH值為7.5（若配置其固體培養基，則加入20g/L瓊脂粉）。

YPD培養基酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，固體培養基添加20g/L瓊脂粉，可根據需求添加適量的博來霉素。

YNB培養基葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，20種氨基酸及Ade和Ura200mg/L，固體培養基添加20g/L瓊脂粉。

SD篩選培養基葡萄糖20g/L，20種氨基酸及Ade和Ura200mg/L，碘化鉀0.1mg/L，硫酸銅0.04mg/L，

氯化鐵0.4mg/L，硫酸錳0.8mg/L，硫酸鋅0.8mg/L，鉬酸鈉0.4mg/L，硼酸1mg/L，硫酸銨5g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.2g/L，對氨基苯甲酸0.4mg/L，硫胺素0.8mg/L，核黃素0.4mg/L，煙酸0.8mg/L，泛酸鈣0.8mg/L，吡哆醇0.8mg/L，生物素0.4mg/L，葉酸0.4mg/L，肌醇4mg/L，亞磷酸氫二鉀2g/L，固體培養基添加20g/L瓊脂粉。

1.2表達載體的構建

1.2.1帶有2種不同復制子的非整合型質粒的構建

2種自主復制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）即來自畢赤酵母線粒體的mitoARS[16]與來自乳酸克魯維酵母基因組優化后的OPT-panARS[17]均由金唯智公司合成。以實驗室保存的pGAPZαA（pXY001）為出發質粒，將mitoARS和OPT-panARS分別無縫克隆到pXY001中，通過PCR驗證并經測序確認后，得到含有ARS的2種游離型載體pXY002和pXY003。

1.2.2淀粉酶表達質粒的構建

以實驗室保存的解淀粉酶芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）的基因組為模板，克隆獲得解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因（amyS），將2種非整合型載體pXY002和pXY003與整合型載體pXY001分別經EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切后，同淀粉酶基因amyS進行組裝，經PCR驗證及測序確認后，得到3種表達淀粉酶基因的載體：pWY01、pWY02和pWY03。

1.2.3含有信號肽質粒的構建

為了提高異源蛋白的分泌表達，本研究對α-MF信號肽進行優化。根據文獻報道，在信號肽α-MF的pre區和pro區按照畢赤酵母的密碼子偏好性新增13個氨基酸[18]，獲得優化后的信號肽OPT-α-MF，利用無縫克隆技術，構建含優化信號肽的質粒pWY04。同時，為了進一步增強異源蛋白分泌表達，在信號肽與淀粉酶基因amyS之間插入Linker：GGGGS[19]，分別構建出含原始信號肽的載體pWY05和含有Linker的信號肽載體pWY06。通過在線分析軟件SignalP6.0[20]，分析和篩選出15種畢赤酵母X33自身分泌的信號肽，借助通用引物和POE-PCR方法[21]，以構建成功的重組載體pWY05為模板，將信號肽片段快速與模板質粒序列融合，轉化畢赤酵母X33感受態細胞。

1.2.4亞磷酸脫氫酶基因表達質粒的構建

通過調研獲得亞磷酸脫氫酶基因ptxD的序列（gi|3127080），并委托金唯智生物公司合成。以WY003為基礎質粒，使用無縫克隆技術，將質粒中的博來霉素基因（BleoR）替換為亞磷酸脫氫酶基因ptxD，經PCR驗證及測序確認后，得到篩選標記為（ptxD）的質粒pWY07。

1.3畢赤酵母轉化子的篩選與鑒定

畢赤酵母感受態的制備及電轉化操作參照文獻[22]。將載體和信號肽片段進行POE-PCR后，將5μgPCR產物與80μL畢赤酵母X33感受態混合，轉入0.2mm電轉杯冰浴5min，1500V電壓下電擊，在1mol/L山梨醇中孵育1～2h后涂布于含有100μg/mLZeocin的YPD淀粉平板上，于30℃培養3～4d。得到轉化子后，倒入適量的碘液，觀察透明圈，較大透明圈且PCR驗證正確的單菌落即為陽性克隆。

1.4α-淀粉酶的酶活檢測

分別挑取野生型菌株及陽性克隆菌株，置于西林瓶中進行微培養，采用DNS法檢測酶活。酶活測定的反應條件如下：2%玉米淀粉溶液270μL，粗酶液30μL（發酵液經過6000r/min，離心10min后取上清），混合均勻后于60℃水浴10min，加入600μLDNS溶液，于100℃水浴5min，取200μL測OD540，計算淀粉酶的酶活。

2結果與分析

2.1非整合型載體的構建

2.1.1重組表達載體的構建

以實驗室保存的pGAPZαA（pXY001）為骨架，通過無縫克隆技術分別插入2種自主復制序列構建非整合型質粒pXY002和pXY003。然后，將3種質粒pXY001、pXY002及pXY003使用EcoRⅠ與KpnⅠ進行雙酶切后插入淀粉酶基因（amyS），成功構建1種整合型及2種非整合型含淀粉酶基因的表達質粒pWY01、pWY02及pWY03。以pWY03表達載體為例，構建過程如圖1所示。

2.1.2非整合型質粒的功能驗證

將2種含有非整合型載體的菌株在無抗性的YPD液體培養基中連續傳代培養后涂布到無抗性的YPD固體培養基上，獲得單菌落。將單菌落分別稀釋影印至無抗性的固體培養基YPD及含博來霉素的固體培養基YPDZ上，如圖2所示。2種游離質粒均可在YPD培養基上生長，在YPDZ培養基上無法生長。這說明2種質粒已在無抗性的YPD液體培養基中連續傳代培養時丟失，沒有整合到染色體上，而是以游離形式存在，即將2種復制子OPT-panARS與mitoARS作為質粒骨架時，可以使質粒以游離形式存在于畢赤酵母體內。

將2種含有非整合型載體的菌株于抗性培養基YPDZ中連續傳代培養，使用試劑盒提取傳至第10代的質粒，對其進行穩定性檢測，質粒大小分別為6027bp和5051bp。使用內切酶EcoRⅠ進行酶切驗證，電泳結果如圖3所示，可以看出，條帶大小正確，證明2種質粒經抗性培養基傳代10代時仍可穩定存在畢赤酵母細胞內。

通過在無抗性液體培養基YPD中傳代培養，并對每代菌液留樣，再將留樣菌液稀釋后，分別涂布于無抗性的固體培養基YPD及含博來霉素的固體培養基YPDZ上，獲取單菌落后進行計數，計算質粒丟失率，如表2所示。

由表2可知，含OPT-panARS復制子的質粒在第1代、第2代的丟失率明顯高于含mitoARS復制子的質粒，但兩者的質粒均于第3代全部丟失。這表明2種復制子均可較快丟失質粒，可作為畢赤酵母CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1的基因編輯工具。

2.1.3以mitoARS和OPT-panARS為復制子的載體淀粉酶的表達情況比較

不同復制子表達淀粉酶基因的蛋白表達量不同，以α-淀粉酶為報告蛋白，整合型質粒pWY01為對照，將2種非整合型質粒pWY02和pWY03轉入X33菌株后，選取生理驗證中水解圈較大的菌株進行搖瓶發酵，將上清液進行酶活測定，比較不同復制子的蛋白表達情況。分別于24、48、72h測定淀粉酶酶活，結果如圖4所示。

由圖4可知，在48h酶活均達到最高，且含有非整合型質粒的菌株WY02和WY03比含有整合型質粒的菌株WY01表達α-淀粉酶酶活高，其中攜帶復制子OPT-panARS的菌株WY03酶活是整合型菌株WY01的2倍，含有復制子mitoARS的菌株WY02的酶活是整合型WY01的1.6倍。

綜上所述，本研究以畢赤酵母整合型質粒pGAPZαA作為出發質粒，分別以mitoARS和OPT-panARS作為復制子，構建含不同復制子的α-淀粉酶表達質粒及菌株。畢赤酵母中沒有穩定的非整合型質粒，與商用整合型載體相比，非整合型載體無需線性化處理，實驗操作更為方便，且研究顯示含有畢赤酵母ARS復制子的表達載體蛋白質產量與轉化效率更高[23]。除常用的PARS1外，來自畢赤酵母線粒體中的mitoARS[16]與來自乳酸克魯維酵母基因組的panARS[24]均可作為游離質粒的復制子。有研究對panARS的3個區域進行突變，得到的OPT-panARS保持了強大的ARS活性且穩定性優于panARS[17]。本研究通過DNS法測定淀粉酶酶活。結果表明，mitoARS和OPT-panARS游離質粒可以穩定傳代，并在無篩選壓力下使質粒丟失，具備進行外源基因表達及作為基因編輯工具質粒的功能。與整合型質粒相比，mitoARS和OPT-panARS非整合型質粒拷貝數高，淀粉酶的表達量是整合型質粒的2倍，這與文獻報道相一致。文獻[25]報道，畢赤酵母整合型質粒表達熒光蛋白為單拷貝，復制子panARS為10余個拷貝，是整合型的7倍～9倍。本研究也側面表現出非整合型質粒可實現高拷貝數的表達。

2.2信號肽的分析與評估

2.2.1α-MF信號肽的優化

釀酒酵母α-MF信號肽廣泛用于畢赤酵母重組蛋白的分泌表達。為了提高異源蛋白的分泌表達，在信號肽α-MF的pre區和pro區按照畢赤酵母的密碼子偏好性新增13個氨基酸[18]，獲得優化后的α-MF信號肽，進而構建4種含有優化后信號肽的重組質粒及其對照質粒，再將4種質粒分別轉化至畢赤酵母獲得工程菌株，分別是帶有原始信號肽α-MF的工程菌pWY03、帶有優化后信號肽OPT-α-MF的工程菌pWY04、帶有Linker序列的原始信號肽α-MF-（GGGGS）1的工程菌pWY05和帶有Linker序列的優化信號肽OPT-α-MF-（GGGGS）1的工程菌pWY06。借助淀粉酶作為報告蛋白，對經過改造的α-MF信號肽引導淀粉酶的分泌能力進行評估，將4種工程菌進行搖瓶發酵，并分別于24、48、72h取樣，利用DNS法測定樣品裂解前后粗酶液的酶活，結果如圖5所示。

結果顯示，在24h和48h內發酵液裂解后的酶活高于裂解前的酶活，而在72h達到一致。這表明信號肽在引導外源蛋白分泌表達時具有時間延遲的特點。因此，使用72h的樣品粗酶液的酶活，比較4種工程菌中的信號肽分泌能力。其中：含有OPT-α-MF-（GGGGS）1信號肽的菌株WY06酶活最高，是含有α-MF信號肽的對照菌株WY03酶活的2.4倍；含有OPT-α-MF信號肽的菌株WY04的酶活是對照菌株WY03酶活的1.4倍；含有α-MF-（GGGGS）1信號肽的菌株WY05酶活是對照菌株WY03酶活的1.24倍。實驗結果表明，改造后的α-MF信號肽比原始α-MF信號肽的酶活高，因此適當改造信號肽對提高畢赤酵母分泌表達水平具有積極意義。

2.2.2畢赤酵母內源信號肽的預測

為了選擇用于在畢赤酵母中分泌異源蛋白的新信號肽，通過對畢赤酵母分泌體進行研究[26]，挑選15種畢赤酵母X33自身分泌的信號肽。使用在線分析軟件SignalP6.0[20]進一步分析這15種潛在的信號肽序列，獲得預測的切割位點及各個蛋白的信號肽序列。氨基酸序列會影響信號肽酶對信號肽切割的效率[13]，因此將信號肽的氨基酸序列后延2位，保證信號肽切割位點的正常識別與切割，獲得的信號肽序列如表3所示。使用釀酒酵母α-MF作為對照，研究15種新信號肽的分泌效率。

2.2.3畢赤酵母內源信號肽的評估

為了研究15種信號肽的分泌能力，借助通用引物和POE-PCR方法[21]，以構建成功的重組載體pWY06為模板，將信號肽片段快速與模板質粒序列融合，轉化畢赤酵母X33感受態細胞后獲得15種工程菌。再將含不同信號肽的15種工程菌以及含有α-MF信號肽的工程菌分別進行發酵，以α-淀粉酶為指征蛋白，檢測重組菌株的生長情況以及α-淀粉酶酶活。選用72h發酵樣品上清液的酶活比較不同信號肽的分泌效率，結果如圖6所示。

由圖6可知：有7種畢赤酵母內源信號肽分泌α-淀粉酶的能力比α-MF信號肽高，其中畢赤酵母FLO10、EXG1和MSB2信號肽引導淀粉酶的酶活分別是α-MF信號肽引導淀粉酶酶活的2.5倍、1.94倍和1.75倍；有4種信號肽（SCW10、GAS1、DSE4、PHO5）分泌α-淀粉酶的能力同α-MF信號肽差異不大；剩余4種信號肽（UTH1、CPR5、DAN4、PDI1）低于α-MF信號肽的分泌能力，其中PDI1分泌α-淀粉酶的能力最低。因此對于同一外源蛋白而言，不同的信號肽分泌蛋白質的效率也不同，選擇并使用高效信號肽是提高畢赤酵母分泌表達外源蛋白的有效途徑。

綜上所述，釀酒酵母的α-MF信號肽是畢赤酵母中應用最廣泛的信號肽，對α-MF信號肽的結構和功能及相關分泌通路的詳細研究表明信號肽在協助胞外分泌中不可或缺[7]。本研究優化的α-MF信號肽，不僅可以利用通用引物，方便構建操作，而且淀粉酶的表達活性最高提高了2.4倍。根據生物信息挖掘與分析，確定了15種還未見其他文獻報道的內源信號肽的氨基酸序列。利用通用引物和POE-PCR方法，建立了一個操作方便的信號肽庫，無需通過大腸桿菌構建質粒，可以直接與任何待表達基因融合，直接轉化畢赤酵母進行篩選和評估。該方法高效簡便，為異源蛋白更廣泛分泌表達提供了新的操作工具和方案。通過測定淀粉酶酶活，評估15種畢赤酵母內源信號肽，其中畢赤酵母FLO10、EXG1和MSB2信號肽引導的淀粉酶的酶活都高于商品質粒常用的α-MF信號肽，可以為其他外源蛋白表達提供借鑒。

2.3營養依賴的篩選標記的建立

2.3.1亞磷酸脫氫酶基因作為篩選標記的可行性與有效性

以WY003為基礎質粒，使用無縫克隆技術將質粒中的博來霉素基因BleoR替換為亞磷酸脫氫酶基因ptxD，構建攜帶ptxD基因的表達質粒，并通過電穿孔法轉化到畢赤酵母X33菌株中，涂布于以亞磷酸為唯一磷源的SD篩選培養基上，轉化子生長正常。其生長圖如圖7所示。

對轉化子進行PCR驗證，單克隆1號—4號擴增出的ptxD基因大小與目的條帶一致，獲得了具有ptxD篩選標記的淀粉酶表達菌株WY07，結果如圖8所示，證明了ptxD可作為營養型篩選標記基因用于轉化子的篩選。

利用淀粉酶水解圈對重組菌株WY07進行生理驗證，如圖9所示。由圖9可知：對照菌株X33不含有淀粉酶基因，故影印于1%淀粉平板后，無法產生水解圈；而重組菌株WY07含有淀粉酶基因，可觀察到較大透明圈，說明以ptxD為篩選標記基因的質粒可成功表達淀粉酶基因，證明該篩選標記在畢赤酵母中進行異源表達時篩選轉化子具有可行性。

2.3.2亞磷酸脫氫酶基因作為篩選標記的穩定性

將重組菌株WY07在以亞磷酸為唯一磷源的培養基中連續傳代培養，使用試劑盒提取傳至第10代的質粒，進行穩定性檢測，質粒大小應為4817bp。通過使用內切酶KpnⅠ進行酶切驗證，電泳結果如圖10所示。M代表Trans5KDNAMarker；+代表陽性對照；1—3代表第10代菌株所提質粒。由圖10可以看出，條帶大小正確，證明該質粒經以亞磷酸為唯一磷源的培養基傳10代仍可穩定存在于畢赤酵母細胞內。

2.3.3亞磷酸脫氫酶基因表達菌株的生長情況

將驗證正確的重組菌株WY07及野生型菌株X33分別在YNB全價培養基與SD培養基中培養，檢測其生長情況，繪制生長曲線，結果如圖11所示。

由圖10可知：野生型菌株由于不能利用亞磷酸，因而只能在YNB全價培養基中生長；含有亞磷酸脫氫酶基因的菌株既可以在YNB全價培養基中生長，也可以在SD培養基中生長。這表明，亞磷酸脫氫酶基因可以作為畢赤酵母的篩選標記基因，達到篩選目的。但重組菌株WY07在YNB培養基中的生長速度高于SD培養基，表明菌株利用亞磷酸鹽生長較為緩慢。推測后續以亞磷酸鹽為唯一磷源進行篩選時，轉化子生長所需時間將長于2～4d。鑒于重組菌株在以亞磷酸鹽為唯一磷源的篩選培養基中生長較慢，后續可以在轉錄水平及培養基配方上進行優化，使該基因能夠更好地發揮篩選標記基因的作用。

綜上所述，篩選標記基因是質粒中必不可少的元件。近年來抗生素抗性標記在轉基因微生物商業應用中受到限制，所以開發安全性篩選標記基因十分重要。磷是所有生物的必需營養元素，許多微生物體內含有亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），參與生物體中亞磷酸代謝[27]。但畢赤酵母只能利用五價的磷酸鹽而不能利用三價的亞磷酸鹽。本研究使用無縫克隆技術構建亞磷酸脫氫酶基因表達質粒，驗證結果表明ptxD作為游離質粒的篩選標記基因是有效可行的，可以穩定傳代。同抗生素相比，亞磷酸鹽是一種無毒、安全且價格低廉的化學品，克服了抗性基因篩選標記的弊端，已在釀酒酵母[16]、水稻[28]中得到應用，但在畢赤酵母中的應用還未見報道。目前，以ptxD作為游離質粒的篩選標記基因存在的問題是在亞磷酸培養基上菌體生長的速度低于在磷酸培養基中的速度，后續研究還有待通過適應性進化加快其生長速度。

3結語

本研究以α-淀粉酶為報告蛋白，通過構建非整合型質粒、優化α-MF信號肽、篩選內源信號肽以及開發新的營養依賴的篩選標記等多個方面對畢赤酵母分泌表達系統進行優化。結果表明，含有非整合型質粒的菌株WY03表達α-淀粉酶的酶活可達到含整合型質粒菌株WY01的2倍，含優化的α-MF信號肽的菌株WY06是含常規α-MF信號肽菌株WY03的2.4倍，篩選出的FLO10、EXG1和MSB2信號肽屬于畢赤酵母強信號肽，以亞磷酸脫氫酶基因ptxD為篩選標記穩定、安全且價格低廉，實現了畢赤酵母表達系統在基因水平及蛋白轉運水平方面的優化。

本研究僅針對自主復制序列、信號肽及篩選標記等方面進行了探索，尚未對培養基、菌株生長狀態等培養條件進行優化和調整。后續工作將著眼于分子伴侶、糖基化修飾等方面，提高畢赤酵母外源蛋白的折疊、修飾效率，進而提升畢赤酵母分泌型遺傳操作工具的性能。

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收稿日期：2023-09-01；修回日期：2024-03-26；責任編輯：張士瑩

基金項目：

國家科技支撐計劃項目（2015BAD15B0501）；河北省重點研發計劃項目（21372402D）

第一作者簡介：

張夢宇（1998—），女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事畢赤酵母分泌表達系統方面的研究。

通信作者：李天明。E-mail：dayafterday2006@163.com

馮惠勇，教授。E-mail：fenghuiyong@163.com

張夢宇，王祎涵，李涵，等.

畢赤酵母分泌型遺傳操作工具的構建與優化

［J］.河北科技大學學報，2024，45（4）：415-424.

ZHANGMengyu，WANGYihan，LIHan，etal.

ConstructionandoptimizationofsecretorygeneticmanipulationtoolsinPichiapastoris

［J］.JournalofHebeiUniversityofScienceandTechnology，2024，45（4）：415-424.