響應面法優化樺樹液沙棘復合酒發酵工藝

摘要： "以樺樹液和沙棘為原料，篩選出適合樺樹液沙棘復合酒酒精發酵的菌種；在此基礎上，通過單因素和響應面試驗優化樺樹液沙棘復合酒的發酵工藝條件。結果表明：最適用于樺樹液沙棘復合酒酒精發酵的商業菌種為釀酒酵母DV10；最佳發酵工藝為：酵母菌接種量為0.07%，初始pH值為3.6，發酵溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。在此條件下釀制的樺樹液沙棘復合酒呈金黃色，具有明顯的酒香以及樺樹液、沙棘的清香，香味協調，酒體豐滿，醇香濃厚，典型性佳，以期為樺樹液沙棘復合酒工業化開發以及樺樹液和沙棘的綜合利用提供一定的理論基礎。

關鍵詞： "樺樹液； "沙棘； "菌種篩選； "發酵工藝； "響應面法

中圖分類號： " S 79; TS 2 " " " " " " " 文獻標識碼： " A " " " " " " " "文章編號：１００1 － 9499（２０24）04 － 0036 － 07

Optimization of Fermentation Process of Birch Sap and Sea Buckthorn Compound Wine by Response Surface Methodology

QU Wei HAO Diqiu LI Wenjia LI Peishan MENG Zhuoyi PENG Bo JIA Pengbo**

（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences， "Heilongjiang Jiamusi 154000）

Abstract Using birch sap and sea buckthorn as raw materials， the strains suitable for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine were screened. On this basis， single factor and response surface tests were used to optimize the fermentation conditions of birch sap and sea buckthorn compound wine. The results showed that the most suitable commercial strain for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine was saccharomyces cerevisiae DV10. The optimum fermentation conditions were as follows： the inoculated amount of yeast was 0.07%， the initial pH value was 3.6， the fermentation temperature was 25 ℃， and the added amount of SO2 was 83 mg/L. Under these conditions， the birch sap and sea buckthorn compound wine was golden in color， with obvious aroma and fragrance of birch sap and sea buckthorn. The aroma was coordinated， the wine was full-bodied， mellow and good typical. It was expected to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch sap and sea buckthorn compound wine and the comprehensive utilization of birch sap and sea buckthorn.

Key words Birch sap; sea buckthorn; strain screening; fermentation process; response surface methodology

樺樹液是從樺樹流出的無色或淡黃色的透明液體，帶有獨特的木質清香味[ 1 ]，樺樹液中蘊含著人體所需的各種氨基酸、礦物質、脂肪酸等常見營養成分[ 2 ]，此外，還含有過氧化物酶、過氧化氫酶、樺芽酸、細胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 3 ]。樺樹液具有祛痰止咳、促進人體新陳代謝、抗疲勞、增強機體免疫力等作用[ 4 ]。

沙棘是一種胡頹子科沙棘屬落葉性灌木，具有較強的適應性，主要分布在我國東北、華北、西北和西南等地區[ 5 ]。其果實富含維生素、黃酮、微量元素、礦物質等營養成分，具有抗衰老、抗氧化、改善腸道菌群、增強免疫力、降血脂等作用[ 6 ]。

樺樹液酒釀造過程中存在發酵困難、易氧化、口感平淡的問題；沙棘果由于其過高的酸度，制得果酒口感較酸，且易渾濁[ 7 ]。樺樹液與沙棘混合釀酒，能夠優勢互補，解決單一原料釀酒存在的問題，并且復合酒的顏色穩定、口感較好，但目前國內對樺樹液沙棘復合酒釀造工藝鮮有報道。本研究以樺樹液、沙棘為主要原料制備樺樹液沙棘復合酒。通過試驗篩選適用于樺樹液沙棘復合酒發酵的商業菌種，并采用單因素和響應面試驗優化樺樹液沙棘復合酒的發酵工藝，旨在為樺樹液沙棘復合酒工業化開發以及樺樹液、沙棘的綜合利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

樺樹液、沙棘果：采自伊春市帶嶺區東方紅林場；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；殼聚糖（食品級）：廣州天佳生物科技有限公司；DV10、EC1118和K1型號酵母菌：上海杰兔工貿有限公司；檸檬酸（分析純）：長春健鷹食品添加劑公司；氫氧化鈉（分析純）哈爾濱新春化工產品有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1. 2 儀器與設備

ESJ182-4型電子天平：上海拓西電子科技有限公司；PHS-3C型精密PH計：杭州雷磁分析儀器廠；HJ-6磁力攪拌器：天津市濱海新區大港紅杉實驗設備廠；HWS-70B恒溫恒濕箱：青島明博環保科技有限公司；721紫外可見分光光度計：上海力辰儀器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 樺樹液沙棘復合酒的加工工藝流程

1. 3. 2 操作要點

工藝操作要點

（1）沙棘汁的制備：挑選果實完整、飽滿、無霉變的沙棘果，清洗，去梗后，用榨汁機破碎，稱量果汁重量后，加入0.8%的果膠酶，在30 ℃下酶解2 h。酶解完成后，將果汁進行過濾，得到沙棘汁。

（2）樺樹液的采集：在樺樹葉還未長出前，樺樹液開始流動時對樺樹液進行采集，并對采集的樺樹液進行過濾后，待用。

（3）調配：經過前期預實驗將樺樹液與沙棘的混合比例確定為3∶1。

（4）糖酸度調整：使用蔗糖調節混合汁調節初始糖度為180 g/L，使用檸檬酸鈉或碳酸氫鈉調節混合汁和酸度。

（5）酒精發酵：在釀酒酵母中加入10倍質量的5%蔗糖溶液后，將其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌種子液。將酵母菌種子液接種到樺樹液沙棘混合汁中，攪拌均勻后，進行酒精發酵。每隔12 h測一次糖度和比重，糖度和比重不再變化時判斷達到發酵終點。

（6）過濾、澄清：將復合酒通過過濾去除果肉和酒腳，靜置一段時間，進行澄清處理。

（7）陳釀、滅菌：將果酒置于橡木桶內進行陳釀1個月后，置于80 ℃條件下處理30 min，無菌裝瓶，即得樺樹液沙棘復合酒成品。

1. 3. 3 酵母菌的篩選

在試驗過程中將活化好的DV10、EC1118和K1型號的酵母，按照0.06%的接種量分別接入到樺樹液與沙棘果混合汁中，初始pH調至3.6，SO2添加量為90 mg/L，在26 ℃恒溫培養箱內進行發酵，以酒精度和感官評價作為復合酒發酵狀況的評價指標，選出發酵性能好，復合酒口感佳的酵母。

1. 3. 4 樺樹液沙棘復合酒發酵的單因素實驗

在試驗過程中分別將接種量、pH值、溫度和SO2添加量作為自變量，以酒精度和感官評分為評價指標，探究不同的酵母菌接種量、初始pH值、發酵溫度和SO2添加量對樺樹液沙棘復合酒的影響。

1. 3. 5 樺樹液沙棘復合酒發酵工藝優化

在單因素試驗的基礎上，對接種量、pH值、溫度和SO2添加量進行優化（表1），以酒精度和感官評價作為評價指標，從而明確復合酒發酵最佳工藝參數。

表1 響應面試驗因素與水平

1. 3. 6 理化指標測定

總糖測定參照張開平[ 8 ]等采用的3，5-二硝基水楊酸（DNS）法；酒精度測定參照GB 5009.225-2016；揮發酸、總二氧化硫和干浸出物的測定參照GB/T 15038-2006。

1. 3. 7 感官評價

選擇食品專業10名感官品評人員對樺樹液沙棘復合酒進行感官評價，并按照表2樺樹液沙棘復合酒的感官評分細則給予相應的分數。

表2 樺樹液沙棘復合酒的感官評分細則

1. 3. 8 微生物微指標測定

菌落總數、大腸菌群及沙門氏菌的測定分別參照GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016和GB 29921-

2021項下方法及標準進行測定。

2 結果與分析

2. 1 酵母菌的篩選

由圖1可知，隨著發酵時間的增加，發酵液內的酒精度數逐漸升高。其中使用酵母菌EC1118發酵用時6 d，最短，樺樹液沙棘復合酒的酒精度數達到9.5 %vol；使用酵母菌DV10發酵用時為7 d，樺樹液沙棘復合酒的酒精度為9.5 %vol；使用酵母菌K1發酵用時為7 d，樺樹液沙棘復合酒的酒精度為9.0 %vol。

2. 1. 1 不同酵母菌對樺樹液沙棘復合酒感官品質的影響

不同酵母菌對樺樹液沙棘復合酒感官品質的影響如圖2所示，使用酵母菌EC1118制備的復合酒酒樣呈土黃色，酒味較重，苦澀，入喉有刺激感，感官評分最低；使用酵母菌K1制備的復合酒酒樣呈橙黃色，比較澄清，具有淡酒香和樺樹液、沙棘的清香，但后味苦澀；使用酵母菌DV10制備的復合酒酒樣呈金黃色，澄清度高，香氣純正，具有酒香和樺樹液、沙棘的清香，入口綿軟醇厚，無苦澀味，感官評分最高。

2. 2 樺樹液沙棘復合酒發酵單因素試驗結果

2. 2. 1 酵母菌接種量對樺樹液醋酸度的影響

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的增加，樺樹液沙棘復合酒的酒精度和感官品質均呈現升高的趨勢，這是因為酵母菌的產酒精速度隨著酵母菌數量的增多而加快。接種量為0.06%時，酒精度和感官評分達到最大值，分別為9.5 %vol和88.2分；當接種量高于0.06%時，酒精度和感官品質均呈現降低的趨勢。這可能是酵母菌接種量過大，菌體增長繁殖耗費了樺樹液沙棘混合汁中大部分營養，使得酒精發酵相關的底物含量降低，不利于酒精發酵[ 9 ]，并且酵母味過重，導致復合酒的酒精度和感官評分降低。因此，樺樹液沙棘復合酒的最適酵母菌接種量為0.06%。

2. 2. 2 初始pH值對樺樹液沙棘復合酒品質的影響

由圖4可知，隨著初始pH的增大，樺樹液沙棘復合酒酒精度和感官評分均呈現先升后降低趨勢。當初始pH值低于3.6時，不利于酵母菌的生長繁殖，使得復合酒的酒精度較低，酒香不足。當pH值為3.6時，酒精度和感官評分達到最大值，分別為9.5 %vol和87.5分。當pH值高于3.6時，酒精度和感官評分均降低，這主要是因為過高的初始pH值使酵母菌的成長、代謝受到限制[ 10 ]，從而導致了復合酒的酒精度和感官評分下降。因此，樺樹液沙棘復合酒的最適初始pH值為3.6。

2. 2. 3 發酵溫度對樺樹液沙棘復合酒品質的影響

由圖5可以看出，隨溫度升高酒精度及感官評分增大。當溫度為26 ℃時，酒精度和感官評分最高，分別為9.5 %vol和87.6分。當溫度高于26 ℃時，酒精度和感官評分開始下降，溫度過高會導致酵母菌快速繁殖和衰老，并且還會產生不良的發酵味[ 11 ]，從而導致復合酒的酒精度和感官評分降低。因此，最適溫度為26 ℃。

2. 2. 4 SO2添加量對樺樹液沙棘復合酒品質的影響

由圖6可以看出，隨著SO2添加量的增加，樺樹液沙棘復合酒的酒精度和感官評分呈現先升后降趨勢。當SO2添加量低于90 mg/L時，復合酒的酒精度和感官評分較低，這主要是因為SO2添加量過低時，對雜菌的抑菌作用并不完全，干擾了酵母菌的正常生長和代謝過程[ 8 ]，從而降低了復合酒的酒精度和感官評分。當SO2添加量為90 mg/L時達到最大值，分別為9.5 %vol和89.1分。當添加量高于90 mg/L時，抑制酵母菌的活性且硫味較重，使得酒精度和感官評分降低。因此，樺樹液沙棘復合酒的最適SO2添加量為90 mg/L。

2. 3 樺樹液沙棘復合酒發酵工藝響應面試驗結果

響應面試驗設計方案及樺樹液沙棘復合酒的酒精度和感官評價如表3所示。

利用Design-Expert13.0軟件對表5數據進行多元回歸擬合，回歸方程方程為：

Y1=9.42+0.2A-0.033 3B-0.058 3C-0.225D-

0.225AB-0.075AC-0.1AD+0.05BC+0.075BD+

0.35CD-0.380 8A2-0.530 8B2-0.543 3C2-0.193 3D2

Y2=88.76+1.42A-0.266 7B-0.475C-1.55D-

1.77AB- 0.65AC-0.85AD+0.3BC+0.475BD+

2.38CD-3.16A2-3.93B2-4.24C2-1.75D2

酒精度和感官評分的相關系數R2分別為0.886 8和0.896 6，校正系數R2Adj分別為0.773 5和0.793 2，變異系數C.V.分別為2.54%和1.90%，說明該模型的擬合度、可信度和重現性較好，可以對樺樹液沙棘復合酒發酵工藝進行預測和分析。由表5可知，各因素酒精度的影響依次為：SO2添加量（D）gt;酵母菌接種量（A）gt;發酵溫度（C）gt;初始pH值（B），其中一次項A、D，交互項CD以及二次項A2、B2和C2對復合酒的酒精度有極顯著影響（P＜0.01），二次項D2對復合酒的酒精度有顯著影響（P＜0.05）。由圖7可知，溫度和SO2添加量對復合酒的酒精度影響最為顯著。

由表5可知，SO2添加量對感官評分的影響最為顯著，其次是接種量，再次是溫度，最后是初始pH值。其中一次項A、D，交互項CD以及二次項A2、B2和C2對復合酒的感官評分有極顯著影響（P＜0.01），交互項AB和二次項D2對復合酒的感官評分有顯著影響（P＜0.05）。由圖8可知發酵溫度和SO2添加量對樺樹液沙棘復合酒的感官評分影響最為顯著。

通過軟件Design-Expert 13.0分析，酵母菌接種量為0.068%，pH值為3.563，溫度為25.372 ℃，SO2添加量為82.691 mg/L時，復合酒酒精度理論值達到最高，為9.607 %vol；接種量為0.068%，pH值為3.603，溫度為25.388 ℃，SO2添加量為83.148 mg/L時，復合酒感官評分理論值達到最高為89.76分。為便于實際操作，將復合酒最佳工藝修正為：接種量為0.07%，pH值為3.6，溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。平行3次試驗，樺樹液沙棘復合酒酒精度和感官評分實際值分別為9.61±0.02 %vol和89.79± " 0.40分，與模型的理論預測值接近。因此，該方法對樺樹液沙棘復合酒的工藝優化真實可信。

2. 4 優化發酵工藝后樺樹液沙棘復合酒的感官評價

根據優化后的發酵工藝制得的樺樹液沙棘復合酒澄清透明，呈金黃色，具明顯酒香及樺樹液、沙棘的清香，香味協調，醇香濃厚。

2. 5 樺樹液沙棘復合酒的理化指標和微生物指標檢測結果

根據優化后的發酵工藝制得復合酒，其理化指標和微生物檢測結果如表5和表6所示，可以看出樺樹液沙棘復合酒均滿足GB 2758-2012和QB/T 5476-2020的要求。

3 結 論

本試驗篩選出適用于樺樹液沙棘復合酒酒精發酵的商業菌種為釀酒酵母DV10。根據單因素和響應面試驗得到的最佳發酵工藝條件為：酵母接種量為0.07%，pH值為3.6，溫度為25 ℃，SO2添加量為83 mg/L。在此條件下制得的樺樹液沙棘復合酒酒精度為9.61 %vol，酒體澄清透明，呈金黃色，具有明顯的酒香以及樺樹液、沙棘的清香，香味協調，醇香濃厚，且其理化指標和微生物指標均符合國家標準。

參考文獻

［1］ 裴蕾. "樺樹汁發酵醋飲料加工工藝研究［D］. "長春： 吉林農業大學， 2016.

［2］ 王永奇， "李延忠， "張育新， "等. "樺樹汁中的微量元素和氨基酸［J］. 中國林副特產， 1988（2）： 32.

［3］ KALLIO H. Aroma of birch syrup［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1989， 37（5）： 1367 - 1371.

［4］ 趙華文， "覃軍. "樺樹液應用現狀與開發方向［J］. "中國林副特產， 2001（2）： 38 - 40.

［5］ 張銳， "孫仁艷， "尹巍， "等. "沙棘資源綜合開發利用概述［J］.食品研究與開發， 2012， 33（4）： 229 - 232.

［6］ 周張章， "周才瓊， "闞健全. "沙棘的化學成分及保健作用研究進展［J］. 糧食與食品工業， 2005（2）： 15 - 18.

［7］ 寧志雪， "牛廣財， "朱立斌， "等. "沙棘活性成分、生理功能及開發利用研究進展［J］. 食品與機械， 2021， 37（11）： 221 - 227.

［8］ 張開平， "劉玫梅， "劉燕麗， "等. "響應面法優化大果山楂紅棗復合果酒發酵工藝及其抗氧化活性分析［J］. 食品工業科技，2023， 44（23）： 184 - 193.

［9］ 王瑞璇， "張莉， "周霞， "等. "響應面法優化芋頭蓮藕復合醋釀造工藝的研究［J］. 中國調味品， 2021， 46（5）： 93 - 97 + 106.

［10］ 張海霞， "張曉燕， "龔建軍. "籽用南瓜蘋果復合果酒的研制［J］.農業技術與裝備， 2022（6）： 87 - 89.

［11］ 邵士鳳. "五味子枸杞復合果酒生產工藝研究［J］. "輕工科技， 2023， 39（6）： 24 - 26 + 30.