臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體對急性肺損傷幼鼠的保護作用研究

摘 要：為探索人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體（hUCMSC-Exo）對急性肺損傷（ALI）幼鼠模型的保護作用機制，為治療新生兒呼吸窘迫綜合征（NARDS）研究新的方法，本研究構(gòu)建了一種基于新生幼鼠的ALI的動物模型。經(jīng)hUCMSC-Exo治療后發(fā)現(xiàn)，新生幼鼠的死亡率明顯降低，新生幼鼠的體重下降趨勢也得到緩解。收集各組幼鼠的肺組織提取總蛋白、RNA和勻漿，用蛋白質(zhì)免疫印記（Western blot）檢測p-NF-κB、IL-6、Occludin、Cludin 5、β-Catenin、Cyclin D1的蛋白表達水平；用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13 的mRNA表達水平；用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）檢測肺組織中TNF-α、IL-6、IL-10細胞因子的濃度。肺組織病理切片結(jié)果顯示，外泌體治療后的炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚、肺泡出血及水腫程度均有所減弱。研究結(jié)果說明，脂多糖（LPS）可以有效誘導(dǎo)新生幼鼠產(chǎn)生肺部炎癥反應(yīng)，從而引起ALI，而外泌體的治療減輕了ALI的程度。本研究結(jié)果為NARDS治療提供了新的策略。

關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細胞；外泌體；幼鼠；急性肺損傷；新生兒呼吸窘迫綜合征

中圖分類號：R363 " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.04.005

The Protective Effect of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Exosomes on Acute Lung Injury in Neonatal Rats

LONG Jing1， 2#， MAO Ying2#， YAN Feng1， LIU Ailong1，

DING Hao1， CHEN Anji3， HU Xiang2*， YOU Changqiao1*

（1. Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Stem Cell Exosome， Hunan Landfar Biotechnology Co. Ltd.， Changsha 410027， China; 2. College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China; 3. Changsha Hospital for Maternal amp; Child Health Care Affiliated to Hunan Normal University， Changsha 410007， China）

Abstract： The aim of this study is to explore the protective mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes （hUCMSC-Exo） on acute lung injury （ALI） in neonatal rats， and to provide a new method for the treatment of neonatal respiratory distress syndrome （NARDS）， This study constructed an animal model of ALI based on neonatal rats. After treatment with hUCMSC-Exo， it was found that the mortality rate of neonatal rats was significantly improved， and the trend of weight loss in neonatal rats was also alleviated. Lung tissue samples were collected from each group of neonatal rats to extract total protein， RNA， and homogenate. Western blot was used to detect the protein expression levels of p-NF-κB， IL-6， Occludin， Cludin 5， β-Catenin， and Cyclin D1; the mRNA expression levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-4， IL-10 and IL-13 were detected by RT-qPCR; enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the concentrations of TNF-α， IL-6， and IL-10 "in lung tissue. The results of pathological sections of lung tissue showed that the infiltration of inflammatory cells， thickening of alveolar septa， pulmonary hemorrhage， and edema were all reduced after treatment with exosomes. The research results indicate that LPS can effectively induce pulmonary inflammation in neonatal rats， leading to acute lung injury， the treatment with exosomes alleviated the degree of ALI. The results of this study can provide new strategies for the treatment of NARDS.

Key words： human umbilical cord mesenchymal stem cells; exosomes; neonatal rats; acute lung injury; neonatal acute respiratory distress syndrome

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（4）： 326-334）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種嚴重到危及生命的肺功能障礙性疾病，通常是由肺部受到嚴重的損傷或感染導(dǎo)致的［1-2］。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是ALI的嚴重形式。ALI的主要特征是肺泡毛細血管膜被破壞，通透性增加，肺泡內(nèi)液體積聚，導(dǎo)致肺水腫和呼吸功能受損［3-4］。人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes，hUCMSC-Exo）可以促進細胞的再生和修復(fù)，并且含有多種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的分子，如TGF-β、IL-10、TNF-α等。這些分子可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，抑制炎癥反應(yīng)。除了通過釋放多種抗炎分子改變炎癥反應(yīng)水平來影響肺損傷程度的方式外，外泌體還可以通過介導(dǎo)不同的miRNA作用于相應(yīng)靶點［5-6］，促進肺泡上皮再生，改善內(nèi)皮細胞功能，進而影響ALI/ARDS患者的肺組織［7］。

新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal acute respiratory distress syndrome，NARDS）是新生兒ALI的嚴重表現(xiàn)形式，伴隨病理過程的發(fā)展導(dǎo)致強烈的肺部炎癥反應(yīng)，嚴重影響新生兒的肺部發(fā)育，是新生兒時期常見的危急重癥［8］。目前關(guān)于NARDS的治療方法較多，但治療效果較差，因此，尋找更好的治療手段成為本領(lǐng)域的研究熱點。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對新生大鼠（Rattus norvegicus）進行腹腔注射誘導(dǎo)炎癥，從而構(gòu)建NARDS動物模型，并用hUCMSC-Exo進行治療，探究hUCMSC-Exo對新生大鼠的ALI治療效果及潛在機制，旨在為NARDS提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株

試驗用的人臍帶間充質(zhì)干細胞由湖南南華生物技術(shù)有限公司提供，采用無血清培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)。細胞出庫前，通過流式細胞術(shù)對臍帶間充質(zhì)干細胞的表面標志物CD34、CD45、CD73和CD90進行鑒定，同時對臍帶間充質(zhì)干細胞成脂成骨分化潛能進行評估。

1.1.2 試劑耗材

DMEM/F-12培養(yǎng)基（Gibco），細胞培養(yǎng)皿（Gibco），100×青霉素-鏈霉素溶液（Pricella），明膠（Sigma），多聚甲醛固定液（Servicebio），放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（Beyotime），LPS（MedChemExpress），蛋白Marker（Thermo），化學(xué)發(fā)光底物（Thermo），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），qPCR試劑盒（TaKaRa），TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），IL-6 ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），IL-10 ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），Calnexin、HSP70、CD63（ZENBIO），beta Actin（Affinity），IL-6（Affinity），Phospho-NF-κB p65/RelA-S276（Gibco），β-Catenin（Gibco），Cyclin D1（Gibco），Occludin（SAB），Claudin （SAB）。

1.1.3 試驗動物

本研究所使用的出生24 h內(nèi)的新生SD（Sprague-Dawley）大鼠購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證編號 ：SCXK（湘）2019-0014。本研究動物試驗方案通過了湖南師范大學(xué)倫理委員會審核，倫理審核編號：倫審科（2022）第（509）號。

1.2 試驗方法

1.2.1 超速離心法分離hUCMSC-Exo

收集培養(yǎng)好的第3代（passage 3，P3）人臍帶間充質(zhì)干細胞上清液，轉(zhuǎn)移至離心管中。在4℃預(yù)冷的離心機內(nèi)依次經(jīng)過300 g離心10 min、2 000 g離心10 min、10 000 g離心30 min后，用0.22 μm濾頭將上清液過濾后轉(zhuǎn)移至厚壁超離管中。經(jīng)4℃下100 000 g離心70 min后吸去上清液，并用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）反復(fù)吹打超離管底部沉淀進行洗滌。再次經(jīng)4℃下100 000 g離心70 min后吸去上清液，并用適量的PBS重懸和收集外泌體，-80℃保存。

1.2.2 hUCMSC-Exo鑒定

取適量的外泌體溶液，用超純水稀釋一定倍數(shù)后轉(zhuǎn)移至石英比色皿中，在動態(tài)光散射儀（dynamic light scattering，DLS）中分析外泌體粒徑大小，用PBS對適量的外泌體溶液進行稀釋，直接用納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術(shù)檢測外泌體的粒徑和顆粒濃度。將外泌體樣本與裂解液按體積比1：1添加混勻，置于冰上裂解10 min。4℃下12 000 g離心5 min，取上清液，測定蛋白質(zhì)濃度，并進行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）試驗，分析外泌體表面膜蛋白抗原CD63、HSP70和陰性標志物Calnexin。取30 μL外泌體樣本送至湘雅醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)電鏡室，通過透視電鏡觀察外泌體的形態(tài)。

1.2.3 新生幼鼠ALI模型的建立與治療

取SD大鼠的雄性幼鼠15只，隨機分為3組，每組5只，分別為對照組（PBS組）、模型組（LPS組）和治療組（LPS+Exo組）。試驗前稱量每只幼鼠的體重，使用一次性無菌胰島素注射器分別對LPS組和LPS+Exo組幼鼠的腹腔注射1 mg/kg劑量的LPS，PBS組注射等量的PBS，期間密切關(guān)注幼鼠的生命體征。對LPS+Exo組的5只幼鼠進行外泌體腹腔注射治療，注射時間為LPS注射后的4 h，注射劑量為每只5×109 particles。待LPS注射24 h后再次稱取體重，采用2%戊巴比妥鈉對幼鼠進行安樂死，剖取肺組織保存于-80℃用于后續(xù)試驗。

1.2.4 Western blot檢測肺組織蛋白的表達

將提取的待檢測蛋白放入105℃金屬浴中變性 10 min。短暫離心后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上。用 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入特異性一抗與膜上的目標蛋白結(jié)合，搖床上孵育過夜。用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育 1 h，利用免疫熒光發(fā)光液檢測p-NF-κB、IL-6、Occludin、Cludin5、β-Catenin、Cyclin D1的蛋白表達水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測肺組織基因的表達

利用 Trizol 法提取細胞RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取出的肺組織RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按qPCR試劑盒說明檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13的 mRNA表達水平。

1.2.6 ELISA檢測肺組織細胞因子的濃度

提取肺組織勻漿后，往樣本孔中加入50 μL待測樣本；標準品孔和樣本孔中分別加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，按照ELISA試劑盒說明進行孵育、洗滌、避光孵育。分別于每孔中加入50 μL終止液，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的吸光值。檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-6、IL-10細胞因子的濃度。

1.2.7 肺組織Hamp;E染色

幼鼠實施安樂死后，取一葉肺組織用4%多聚甲醛固定12 h；倒去固定液，用PBS清洗1遍后改用75%乙醇浸泡；然后進行石蠟包埋、石蠟切片、Hamp;E染色等操作，在顯微鏡下觀察所得的染色切片并拍照。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差（x±s）表示。使用t檢驗比較兩組之間的差異，Plt;0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 hUCMSC-Exo的鑒定

大量收集P3代人臍帶間充質(zhì)干細胞上清液，超速離心法分離外泌體后重懸在PBS中。外泌體通常表達一些膜標記物，如跨膜蛋白CD63和熱休克蛋白HSP70，并且不表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Calnexin。通過Western blot檢測外泌體表面標志物Calnexin的結(jié)果為陰性，HSP70、CD63的結(jié)果為陽性（圖1a）。透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)為典型的圓盤狀、具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡（圖1b）。通過動態(tài)光散射和NTA等方法可以確定外泌體的大小和相對數(shù)量，DLS檢測外泌體粒徑大小在80.0 nm到200.0 nm之間（圖1c）。NTA檢測外泌體的平均粒徑為166.5 nm，濃度為1.6×1011 particles/mL（圖1d）。以上結(jié)果說明，人臍帶間充質(zhì)干細胞的上清培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后可以穩(wěn)定大量獲取其來源的外泌體。

2.2 hUCMSC-Exo緩解LPS誘導(dǎo)新生幼鼠的ALI癥狀

試驗幼鼠通過腹腔注射LPS（1 mg/kg）誘導(dǎo)ALI，給藥后24 h內(nèi)幼鼠存活率下降，經(jīng)外泌體治療后的LPS+Exo組幼鼠的生存狀況明顯好于LPS組（圖2a）。每組幼鼠處死取樣前稱量體重，分別比對其各自在注射LPS前的初始體重，獲得每組幼鼠的體重相對變化情況。結(jié)果顯示，LPS處理24 h后的幼鼠體重變化趨勢相比于PBS組明顯降低，經(jīng)外泌體治療后的LPS+Exo組幼鼠體重較LPS組有明顯升高（圖2b）。

2.3 hUCMSC-Exo可改變新生幼鼠ALI炎癥相關(guān)細胞因子的表達

Western blot檢測各組幼鼠肺組織促炎細胞因子IL-6和p-p65的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，LPS組幼鼠的IL-6表達水平顯著升高，p-p65被激活，LPS+Exo組幼鼠IL-6和p-p65的表達水平明顯降低（圖3）。

多種肺部疾病，包括感染、肺水腫和纖維化，都與緊密連接蛋白的異常表達和緊密連接復(fù)合體的結(jié)構(gòu)破壞密切相關(guān)。因此，研究緊密連接蛋白有助于深入了解細胞間隙的調(diào)節(jié)機制，從而揭示ALI的病理基礎(chǔ)。Occludin和Claudin是常見的緊密連接蛋白。Occludin是一種跨膜蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細胞間隙的通透性和選擇性。Claudin是一類跨膜蛋白質(zhì)，主要負責細胞間隙的密封和選擇性。Western blot檢測緊密連接蛋白Occludin和Claudin 5的表達水平，結(jié)果顯示，在用LPS誘導(dǎo)幼鼠的ALI后，緊密連接蛋白的表達水平都明顯降低，在外泌體治療后，緊密連接蛋白的表達水平都有一定的升高（圖4）。

RT-qPCR檢測各組幼鼠肺組織勻漿的RNA水平，結(jié)果顯示，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6經(jīng)外泌體治療后的mRNA表達水平明顯降低（圖5a），抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13經(jīng)外泌體治療后有一定的升高（圖5b）。

ELISA法檢測各組幼鼠肺組織勻漿中的促炎細胞因子TNF-α、IL-6和抗炎細胞因子IL-10的表達。結(jié)果顯示，LPS組幼鼠的TNF-α和IL-6濃度顯著升高，LPS+Exo組幼鼠的TNF-α和IL-6濃度明顯降低，IL-10濃度顯著升高（圖6）。以上結(jié)果都表明，hUCMSC-Exo主要通過抑制炎癥緩解新生幼鼠的ALI。

Wnt/β-Catenin途徑參與調(diào)控細胞的分化、組織的修復(fù)和再生，通常也與調(diào)控炎癥的信號通路有著不同程度的交聯(lián)。ALI模型中的緊密連接蛋白表達的缺失可導(dǎo)致肺組織受損，炎癥信號激活，由此可猜測，Wnt信號通路在hUCMSC-Exo緩解新生幼鼠ALI癥狀的過程中發(fā)揮了一定的作用。Western blot檢測Wnt信號通路中上游β-Catenin和下游Cyclin D1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)其在LPS組中表達下調(diào)，外泌體治療后表達上調(diào)。結(jié)果表明，hUCMSC-Exo可能是通過作用于Wnt信號通路參與了緩解ALI的過程（圖7），但具體的分子機制仍需進一步探究。

2.4 hUCMSC-Exo改善ALI新生幼鼠的肺組織病理變化

對各組幼鼠的肺組織切片進行Hamp;E染色，結(jié)果顯示，與PBS組相比，LPS處理24 h后，幼鼠肺組織內(nèi)可見大量炎癥細胞浸潤（綠色箭頭）、肺泡間隔增厚（紅色箭頭）、肺泡出血并水腫同時伴有明顯的滲出物（藍色箭頭）等肺損傷表現(xiàn)。經(jīng)外泌體治療后，LPS+Exo組幼鼠的肺損傷程度較LPS組更輕，炎癥細胞浸潤明顯減少（圖8）。

3 討論

ALI是臨床上常見的一種呼吸系統(tǒng)危急重癥，隨著病情進展，在最終階段會發(fā)展為ARDS，若發(fā)生在新生兒時期則特稱為NARDS。它們在病理生理方面存在相同的變化，主要為炎癥引起的肺泡上皮細胞受損、肺泡通透性增加及肺泡內(nèi)液體積聚導(dǎo)致的肺水腫和呼吸功能障礙，目前仍以支持治療為主要手段，包括原發(fā)病的控制以及通過機械通氣進行呼吸支持，從而改善通氣。然而，現(xiàn)行的治療方式只能暫時緩解ALI/ARDS相關(guān)癥狀，臨床病死率依舊居高不下，并且治療過程對患者尤其是新生幼兒的患者會造成極大的痛苦且預(yù)后效果不理想。因此，尋找更加積極有效的治療方式是臨床上亟待解決的難題［9-11］。

隨著干細胞再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和研究深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞具有靶向受損組織的歸巢能力以及參與抑制免疫及炎癥反應(yīng)的生物學(xué)功能［12-14］。同時，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體具備更加優(yōu)秀的免疫原性和應(yīng)用前景［15-17］。本研究通過組織塊貼壁法分離得到的人臍帶間充質(zhì)干細胞多次傳代后形態(tài)穩(wěn)定、純度高，流式細胞術(shù)鑒定的陽性標志物CD73和CD90高表達，陰性標志物CD34和CD45表達極低，同時具有很好的成脂、成骨兩系分化能力。本研究通過超速離心法可以穩(wěn)定大量地獲取hUCMSC-Exo，經(jīng)檢測鑒定后，hUCMSC-Exo陽性標志物跨膜蛋白CD63和熱休克蛋白HSP70高表達，并且不表達陰性標志物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Calnexin。在透射電子顯微鏡下能清晰地觀察到外泌體的膜結(jié)構(gòu)，并且其形態(tài)為典型的圓盤狀。通過動態(tài)光散射和NTA測得外泌體的平均粒徑為166.5 nm，濃度為1.6×1011 particles/mL，說明超速離心法分離的hUCMSC-Exo雜質(zhì)少、濃度高。

本研究通過LPS腹腔注射的方法成功構(gòu)建了一種基于新生幼鼠的ALI/NARDS的動物模型［18-19］。并且經(jīng)過外泌體治療后，新生幼鼠的死亡率明顯降低，同時，新生幼鼠的體重下降的趨勢也得到了緩解。肺組織病理切片的結(jié)果顯示，外泌體治療后的炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚、肺泡出血及水腫程度均有所減弱。另外，對LPS組和LPS+Exo組的肺組織進行的分子層面的研究結(jié)果表明，p-p65和IL-6的蛋白表達水平在LPS誘導(dǎo)后顯著升高，同時緊密連接蛋白Occludin和Claudin 5的蛋白表達水平顯著降低。經(jīng)外泌體治療后，這些蛋白表達水平的改變都有所逆轉(zhuǎn)，說明LPS可以有效誘導(dǎo)新生幼鼠產(chǎn)生肺部炎癥反應(yīng)，從而引起ALI，而外泌體的治療減輕了ALI的程度。基因水平上，LPS組幼鼠的肺組織中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達相較PBS組有明顯的升高，外泌體治療后，這些促炎因子的表達有所降低，同時抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表達有所升高。這說明經(jīng)過外泌體治療后，ALI幼鼠的炎癥程度有所緩解。另外，這些幼鼠的肺組織勻漿通過ELISA檢測也說明了同樣的問題，促炎因子TNF-α和IL-6以及抗炎因子IL-10的變化趨勢和RT-qPCR的結(jié)果相符。

綜上所述，hUCMSC-Exo可降低肺部炎癥，從而緩解新生幼鼠的ALI癥狀［20］，這為干細胞外泌體治療NARDS提供了理論依據(jù)。

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收稿日期：2024-01-05；修回日期：2024-01-30。

基金項目：長沙市自然科學(xué)基金項目（kq2208477）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81972642）；湖南師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（2023275）。

作者簡介：#為并列第一作者。隆警，碩士，主要從事干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究；毛穎，本科生。

* 通信作者：胡翔，副教授，主要從事分子生物學(xué)研究，E-mail： huxiang@hunnu.edu.cn；游昌喬，湖南師范大學(xué)生物與醫(yī)藥專碩導(dǎo)師，科普師，主要從事干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，E-mail： youcq@landfar.cn。