右美托咪定下調PI3K/AKT信號通路改善脂多糖誘導的結腸炎結腸上皮細胞損傷

摘 要：為研究右美托咪定對脂多糖（LPS）誘導的人結腸上皮NCM-460細胞的炎癥、增殖和凋亡的影響及磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）信號通路的調控作用，本研究體外培養人結腸上皮NCM-460細胞，將其分為對照組、LPS組（1 μg/mL LPS）和不同質量濃度右美托咪定組（1 μg/mL LPS+1.25、2.50、5.00和10.00 μg/mL右美托咪定），干預24 h，篩選出合適的右美托咪定作用質量濃度用于后續試驗。隨后，將人結腸上皮NCM-460細胞分為對照組、LPS組、右美托咪定組（1 μg/mL LPS+5.00 μg/mL右美托咪定）、LY294002組（1 μg/mL LPS+10 μmol/L PI3K/AKT通路抑制劑LY294002）、抑制劑組（1 μg/mL LPS+5.00 μg/mL右美托咪定+10 μmol/L LY294002）和激活劑組（1 μg/mL LPS+5.00 μg/mL右美托咪定+10 μmol/L PI3K/AKT通路激動劑SC79），干預24 h。用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）檢測細胞活力；通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-8（IL-8）的表達水平；用5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）測定細胞增殖率；用Hoechst 33258染色法測定細胞凋亡率；用蛋白免疫印跡（WB）法測定細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、剪切的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase 3）和PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達水平。根據細胞活力和炎癥因子TNF-α的表達水平選擇5.00 μg/mL右美托咪定用于后續試驗。結果顯示，與對照組相比，LPS組細胞增殖率和Cyclin D1的表達水平顯著降低（Plt;0.05），細胞凋亡率、TNF-α、IL-8、cleaved Caspase 3的表達水平、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT的比值顯著升高（Plt;0.05）；右美托咪定組和LY294002組中的右美托咪定和LY294002扭轉了LPS對人結腸上皮NCM-460細胞的上述作用（Plt;0.05）；與右美托咪定組相比，抑制劑組中的LY294002增強了右美托咪定對LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞的作用（Plt;0.05），激活劑組中的SC79則削弱了右美托咪定對LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞的作用（Plt;0.05）。研究表明，右美托咪定能促進LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞增殖，抑制其炎癥和凋亡，其作用機制可能與阻滯PI3K/PI3K信號通路信號轉導有關。本研究為結腸炎的治療提供了新的方向。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎；人結腸上皮細胞；右美托咪定；磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶

中圖分類號：R574.62 " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.04.010

Dexmedetomidine Regulates the PI3K/AKT Signaling Pathway to Improve Lipopolysaccharide-induced Colitis Colon Epithelial Cell Injury

DONG Jianglonga*， SONG Wanjuna， SHAN Xina， TONG Yefengb

（The Third Hospital of Hebei Medical University a. Department of Anesthesia I; b. Department of Anesthesia II， Shijiazhuang 050051， China）

Abstract： In order to study the effects of dexmedetomidine on inflammation， proliferation and apoptosis of human colonic epithelial NCM-460 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） and the regulation of phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase （PI3K/AKT） signaling pathway， we cultured human colonic epithelial NCM-460 cells in vitro， they were divided into control group， LPS group （1 μg/mL LPS） and dexmedetomidine groups with different mass concentrations （1 μg/mL LPS+1.25， 2.50， 5.00 and 10.00 μg/mL dexmedetomidine）. After 24 hours’ intervention， the appropriate mass concentration of dexmedetomidine was screened out for subsequent experiments. Then， The human colonic epithelial NCM-460 cells were divided into control group， LPS group， dexmedetomidine group （1 μg/mL LPS+5.00 μg/mL dexmedetomidine）， LY294002 group （1 μg/mL LPS+10 μmol/L PI3K/AKT pathway inhibitor LY294002） and inhibitor group （1 μg/mL LPS+ 5.00 μg/mL dexmedetomidine +10 μmol/L LY294002）， and activator group （1 μg/mL LPS+5.00 μg/mL dexmedetomidine +10 μmol/L PI3K/AKT pathway agonist SC79） were intervened for 24 hours. Cell viability was detected by live cell counting kit-8 （CCK-8）. The expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin -8（IL-8） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The cell proliferation rate was determined by 5- ethynyl -2' deoxyuridine （EdU）. The apoptosis rate was determined by Hoechst 33258 staining. The expression levels of cyclin D1， cleaved cysteine protease 3 （cleaved Caspase 3） and key proteins of PI3K/AKT signaling pathway in cells were determined by Western blot （WB）. According to the cell viability and the expression level of inflammatory factor TNF-α， 5.00 μg/mL dexmedetomidine was selected for the follow-up experiment. The results showed that compared with the control group， the cell proliferation rate and the expression level of Cyclin D1 in LPS group significantly decreased （Plt;0.05）， while the cell apoptosis rate， the expression levels of TNF-α， IL-8， and cleaved Caspase 3， the ratio of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT significantly increased （Plt;0.05）. Dexmedetomidine and LY294002 in dexmedetomidine group and LY294002 group reversed the above-mentioned effects of LPS on human colonic epithelial NCM-460 cells （Plt;0.05）. Compared with dexmedetomidine group， LY294002 in inhibitor group enhanced the effect of dexmedetomidine on human colonic epithelial NCM-460 cells induced by LPS （Plt;0.05）， while SC79 in activator group weakened the effect of dexmedetomidine on human colonic epithelial NCM-460 cells induced by LPS （Plt;0.05）. Studies have shown that dexmedetomidine can promote the proliferation of human colonic epithelial NCM-460 cells induced by LPS and inhibit its inflammation and apoptosis， and its mechanism may be related to blocking the signal transduction of PI3K/PI3K signaling pathway. This study can provide a new direction for the treatment of colitis.

Key words： ulcerative colitis; human colonic epithelial cells; dexmedetomidine; phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（4）： 377-384）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種由多因素導致的慢性炎癥性疾病，多發于結直腸黏膜和黏膜下層，具有發病率高、病程長和反復發作的特點，嚴重威脅著患者的生活質量。該病多采用藥物治療，但尚無治療該病的特效藥，因此，尋找治療UC的有效方法和藥物具有重要意義［1-2］。右美托咪定是一種特異性受體激動劑，具有緩解疼痛、抗炎的作用［3］。越來越多的研究發現，右美托咪定還具有治療UC的作用。有研究顯示，右美托咪定可通過阻滯UC小鼠炎癥介質的分泌發揮其治療UC的作用，抑制UC大鼠腸上皮細胞凋亡，對UC大鼠具有保護作用［4-5］。但是目前關于右美托咪定影響UC的相關作用機制尚待探究。磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）是一種轉導來自各種受體的信號通路，通過招募和激活先天免疫細胞（如巨噬細胞）來改變炎癥反應。Liu等［6］研究發現，潰結湯可通過抑制PI3K/AKT信號通路改善UC的腸道屏障和抗炎特性，從而發揮其治療UC的目的。Zhao等［7］報道，右美托咪定可通過抑制PI3K/AKT信號通路改善脂多糖誘導的急性腎損傷。但右美托咪定能否通過調控PI3K/AKT通路對UC的生物學行為造成影響仍不清晰。基于此，本文在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導構建體外人結腸上皮NCM-460細胞損傷模型的基礎上研究了右美托咪定對其炎癥反應、增殖和凋亡的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

人結腸上皮NCM-460細胞購自美國ATCC公司。主要試劑：右美托咪定、LPS（北京康瑞納生物科技有限公司，純度≥98%）、LY294002、SC79（PI3K/AKT通路抑制劑和激活劑，上海滬震實業有限公司，純度≥98%），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒、Hoechst 33258染色液、酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］、放射免疫沉淀分析（radio immuno precipitation analysis，RIPA）裂解液（美國abw公司）、鼠抗人［細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、剪切化的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved cysteine protease 3，cleaved Caspase 3）、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、β-actin］及堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG（武漢Proteintech公司）。主要儀器：光學顯微鏡系統（德國Leica公司，型號：DMI1）、二氧化碳培養箱（武漢益普生物科技有限公司，型號：HF151）、酶標儀（美國Thermo公司，型號：Multiskan FC）、凝膠成像系統（上海金鵬分析儀器有限公司，型號：ZF-288）。

1.2 人結腸上皮NCM-460細胞培養

復蘇人結腸上皮NCM-460細胞，將其培養于DMEM培養基（含10% FBS，1%青-鏈霉素）中，并置于37℃、5% CO2、70%～80%濕度培養箱中培養。

1.3 分組與處理

將人結腸上皮NCM-460細胞分為對照組、LPS組、不同質量濃度右美托咪定組。對照組不做干預，LPS組是以1 μg/mL LPS刺激24 h構建體外炎癥模型［8］，不同質量濃度右美托咪定組是先用1 μg/mL LPS刺激24 h，再分別加入（1.25、2.50、5.00和10.00 μg/mL）右美托咪定，干預24 h。篩選出右美托咪定最適質量濃度進行后續的試驗。在后續試驗中將細胞分為對照組、LPS組、右美托咪定組（先用1 μg/mL LPS刺激24 h，再加入5.00 μg/mL右美托咪定）、LY294002組（先用1 μg/mL LPS刺激24 h，再加入10 μmol/L LY294002［9］）、抑制劑組（在右美托咪定組的基礎上加入10 μmol/L LY294002）、激活劑組（在右美托咪定組的基礎上加入20 μmol/L SC79［10］），每組設置3個復孔，并進行24 h藥物干預，在37℃、5% CO2條件下培養。

1.4 CCK-8法測定人結腸上皮NCM-460細胞的活力

細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104個/孔。設置空白組（只添加培養基進行空白對照），細胞分組同1.3。分別處理24 h后，各孔加入質量分數為10%的CCK-8溶液；細胞與CCK-8試劑在37℃、5% CO2培養箱中孵育培養2 h后，在酶標儀上檢測各孔細胞在450 nm處的光密度值，計算細胞活力（%）。

1.5 ELISA法測定人結腸上皮NCM-460細胞炎癥因子的表達水平

干預后取細胞上清液，按照說明書步驟嚴格操作，對細胞炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白介素-8（interleukin-8，IL-8）的表達情況進行檢測。

1.6 EdU法測定人結腸上皮NCM-460細胞的增殖能力

藥物處理24 h后，將細胞與EdU液一起孵育2 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% TritonX-100滲透10 min；向每個孔中加入100 μL Click反應溶液，并在避光條件下孵育30 min；之后用Hoechst 33258復染，裝片后拍照并計數。細胞增殖率為紅細胞數占藍細胞數的百分比。

1.7 Hochest 33258染色法測定人結腸上皮NCM-460細胞的凋亡能力

將細胞接種于24孔板中，當細胞密度達到80%時，接受藥物處理；24 h后，細胞與質量分數為10%的Hoechst 33258工作液避光孵育10 min。在熒光顯微鏡下觀察Hoechst 33258熒光信號并拍照。高強藍色信號為凋亡細胞，低弱藍色信號為正常細胞。細胞凋亡率為凋亡細胞數占總細胞數的百分比。

1.8 蛋白免疫印跡（WB）法檢測人結腸上皮NCM-460細胞中Cyclin D1、cleaved Caspase 3和PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的表達水平

各組細胞在藥物作用24 h后被RIPA裂解液重懸并裂解；在4℃下12 000 r/min離心10 min后收集上清液，即總蛋白樣品；定量并上樣，進行凝膠電泳，轉膜，利用脫脂牛奶法進行膜封閉；接著加入抗Cyclin D1、cleaved Caspase 3、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K及β-actin的抗體稀釋液，4℃孵育過夜；加入抗鼠IgG的抗體稀釋液室溫孵育2 h，封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進行3～5次膜洗滌。使用凝膠成像系統拍照記錄，并用Image J軟件進行蛋白灰度分析。

1.9 統計學分析

用GraphPad Prism 8軟件作圖，用Image J計算凋亡細胞數和蛋白灰度值。所有數據均符合正態分布，以平均值±標準差（x±s）表示，多組間采用單因素方差分析，進一步兩組間采用Dunnett’s t檢驗。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 右美托咪定干預LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞作用質量濃度篩選

試驗結果顯示：與對照組相比，LPS組的細胞活力顯著降低（Plt;0.05），TNF-α表達水平顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組相比，2.50、5.00、10.00 μg/mL右美托咪啶組的細胞活力升高，TNF-α的表達水平降低，差異有統計學意義（Plt;0.05），1.25 μg/mL右美托咪啶組差異無統計學意義（Pgt;0.05）。其中5.00 μg/mL右美托咪定組的細胞活力最高，TNF-α的表達水平最低，效果最好，所以選擇5.00 μg/mL為右美托咪定最佳作用質量濃度用于后續試驗（圖1）。

2.2 右美托咪定下調PI3K/AKT通路改善LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞炎癥損傷

藥物干預24 h，試驗結果顯示（圖2）：LPS組TNF-α和IL-8的表達水平高于對照組（Plt;0.05）；右美托咪定組和LY294002組TNF-α和IL-8的表達水平顯著低于LPS組（Plt;0.05）；與右美托咪定組相比，抑制劑組TNF-α和IL-8的表達水平顯著降低（Plt;0.05），激活劑組TNF-α和IL-8的表達水平顯著升高（Plt;0.05）。

2.3 右美托咪定下調PI3K/AKT通路促進LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞增殖

藥物干預24 h，試驗結果顯示：LPS組細胞的增殖率低于對照組（Plt;0.05）；右美托咪定組和LY294002組細胞的增殖率高于LPS組（Plt;0.05）；抑制劑組細胞的增殖率高于右美托咪定組，而激活劑組細胞的增殖率低于右美托咪定組（Plt;0.05）（圖3）。

2.4 右美托咪定下調PI3K/AKT通路抑制LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞凋亡

藥物干預24 h，試驗結果顯示：對照組細胞形態較為清晰，大小較為均勻，細胞核呈現淡藍色且彌散均勻；而其他各組細胞核體積出現濃縮變小，染色不均勻且具有較強的熒光，為亮藍色（圖4a）。與對照組相比，LPS組細胞的凋亡率高，而右美托咪定組和LY294002組細胞的凋亡率低于LPS組，抑制劑組細胞的凋亡率低于右美托咪定組，激活劑組細胞的凋亡率高于右美托咪定組，以上差異均有統計學意義（Plt;0.05）（圖4b）。

2.5 右美托咪定下調PI3K/AKT通路促進LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞Cyclin D1蛋白的表達，抑制cleaved Caspase 3蛋白的表達

與對照組相比，LPS組細胞Cyclin D1蛋白的相對表達水平降低，而cleaved Caspase 3蛋白的相對表達水平升高（Plt;0.05）；與LPS組相比，右美托咪定組和LY294002組細胞Cyclin D1蛋白的相對表達水平降低，而cleaved Caspase 3蛋白的相對表達水平升高（Plt;0.05）；與右美托咪定組相比，抑制劑組細胞Cyclin D1蛋白的相對表達水平升高，而cleaved Caspase 3蛋白的相對表達水平降低（Plt;0.05），激活劑組Cyclin D1與cleaved Caspase 3蛋白的相對表達水平分別降低和升高（Plt;0.05）（圖5）。

2.6 右美托咪定抑制LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞PI3K/AKT通路活化

WB試驗檢測右美托咪定對LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白AKT、PI3K、p-AKT和p-PI3K表達的調節作用（圖6a）。蛋白定量后，LPS組細胞p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值高于對照組（Plt;0.05）；右美托咪定組和LY294002組細胞p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值低于LPS組（Plt;0.05）；與右美托咪定組相比，抑制劑組細胞p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值進一步顯著降低，激活劑組細胞p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值則顯著升高（Plt;0.05）（圖6b）。

3 討論

UC是一種以結腸黏膜損傷為主的慢性腸炎性疾病。結腸黏膜屏障由緊密連接的結腸上皮細胞組成。在結腸上皮細胞更迭的過程中，其動態平衡被打亂，結腸黏膜屏障受損，而結腸黏膜屏障持續性損傷是UC持續發作和遷延難愈的主要原因。因此，探明其發生發展機制，并找到滿意療效的治療方法一直以來是人們研究的熱點［11-12］。

本研究用LPS誘導人結腸上皮NCM-460細胞體外構建UC模型，結果發現，相較于對照組，LPS組TNF-α和IL-8的表達水平顯著升高，且伴隨著低細胞活力、低細胞增殖率和低Cyclin D1表達水平以及高凋亡率和高cleaved Caspase 3表達水平，說明LPS誘導能促進人結腸上皮NCM-460細胞的炎癥反應和凋亡，抑制細胞增殖，提示模型構建成功。

右美托咪定是一種強效且高度選擇性的跨膜G蛋白偶聯α2腎上腺素受體激動劑，臨床上常用于緩解疼痛，同時還可通過抑制炎癥因子的釋放發揮抗炎的作用［13］。邢海林等［14］研究發現，右美托咪定可通過改善腸黏膜屏障與降低腸黏膜的通透性，對自發性結腸炎小鼠發揮一定的保護作用。沈雁等［15］報道，抑制cleaved Caspase 3蛋白的表達能抑制結腸上皮細胞的過度凋亡，達到發揮其保護UC模型小鼠的目的。但是右美托咪定是否可以影響UC還不完全清楚?；诖?，本研究用不同質量濃度的右美托咪定干預LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞，結果發現，與LPS組相比，2.50、5.00、10.00 μg/mL右美托咪定組的細胞活力顯著升高，TNF-α的表達水平明顯降低，其中，5.00 μg/mL右美托咪定作用效果最好，因此，本研究選擇了5.00 μg/mL為右美托咪定最適作用質量濃度用于后續試驗。試驗發現，與LPS組相比，右美托咪定組表現出高增殖率、高Cyclin D1表達水平和低凋亡率、低cleaved Caspase 3表達水平的現象，提示右美托咪定能促進LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞增殖，抑制其凋亡。以上結果表明，右美托咪定能修復LPS引起的人結腸上皮NCM-460細胞損傷。

PI3K/AKT信號通路是新近發現的與炎癥反應密切相關的重要信號通路，PI3K和AKT蛋白是該通路的中心環節。PI3K/AKT信號通路在腸道異常激活可介導炎癥失控性反應，引起結腸黏膜損傷，因此，該通路成為研究腸道性疾病的關鍵靶點［16］。有研究顯示，阻滯PI3K/AKT信號通路能改善腸上皮細胞屏障，減少炎癥介質的表達水平，發揮其治療UC的作用［17］。另有研究顯示，右美托咪定可通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活減少炎癥因子TNF-α的釋放量，緩解阻塞性黃疸大鼠肺損傷［18］。但是，目前尚未見到關于右美托咪定通過調控PI3K/AKT信號通路影響UC的報道。因此，本研究分析了右美托咪定對LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白的影響，結果發現，LPS組p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值高于對照組，提示LPS誘導能夠激活人結腸上皮NCM-460細胞的PI3K/AKT信號通路。與LPS組相比，右美托咪定降低了LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值，說明右美托咪定能抑制LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞PI3K/AKT信號通路的激活。隨后，在右美托咪定組的基礎上加LY294002和SC79后，抑制劑組相較于右美托咪定組，其細胞增殖率和Cyclin D1蛋白的表達水平升高，炎性因子和cleaved Caspase 3的表達水平、凋亡率、p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比值進一步降低，激活組上述指標變化趨勢與抑制劑組則相反，說明右美托咪定可通過阻滯PI3K/AKT通路信號轉導促進LPS誘導的人結腸上皮NCM-460細胞的增殖，抑制其炎癥和凋亡。

綜上所述，右美托咪定很可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化并上調Cyclin D1的表達，下調cleaved Caspase 3的表達，從而保護結腸炎結腸上皮細胞NCM-460細胞免受LPS誘導的炎癥反應和凋亡，促進增殖。但是否存在其他通路參與UC的生物學行為有待進一步研究。

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