侵染中國河北大豆的大豆花葉病毒的鑒定和全基因組序列分析

關鍵詞大豆花葉病毒；小RNA深度測序；基因組序列

大起源于我國，已有幾千年的種植歷史。由于其蛋白質和油脂含量高，并含有異黃酮等功能性化合物，被用作糧食、油料及飼料。大豆在生長發育過程中受到多種病原物的危害，其中大豆花葉病毒引起的大豆花葉病是世界上分布范圍廣泛、對產量和品質影響很大的大豆病害之一。SMV也是我國三大大豆產區（東北、黃淮海、華南）最常見的大豆病害的病原。在自然條件下，受SMV侵染的感病大豆品種表現出花葉、褶皺和植株矮化等癥狀，并導致嚴重的產量損失。SMV還可侵染大豆種子，導致種皮斑點及種子質量下降，受病毒侵染的種子次年將成為主要的侵染源。

SMV為馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyuirus成員，其基因組為約9600個核苷酸組成的正義單鏈RNA，僅包含一個開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼11種成熟蛋白：P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、Nla-Pro、NIb和Cp。SMV可由蚜蟲以非持久型方式傳播，還可以通過機械和種子傳播。SMV的寄主范圍非常窄，除大豆外，僅在西番蓮屬PassifLora、決明屬Senna、半夏屬和豇豆屬中有過自然感染的報道。

基于二代測序技術的小RNA測序（small RNAsequencing，sRNA-seq）于2009年出現，并首次被提出可以作為一種通用手段來檢測動植物DNA或RNA病毒。該技術易于發現新病毒或新分離物，已被廣泛應用于植物病毒的檢測。本研究利用小RNA深度測序方法在表現病癥的大豆葉片上檢測到6株SMV分離物，并通過分段克隆方法，獲得了SMV全基因組序列并進行了同源性分析，這些為SMV的深入研究提供基礎，為SMV病害防控提供依據。

1材料與方法

1.1材料來源

大豆樣品于2022年8月采集自河北省盧龍縣農戶自營的大豆田塊，根據癥狀分成6組，每組混合作為一個樣品，編號為Gm1～Gm6，癥狀表現為，Gm1：葉肉黃綠相間；Gm2：葉肉黃綠相間并伴有褶皺；Gm3：葉肉密布褪綠黃點；Gm4：葉片嚴重皺縮、葉邊緣下卷、畸形；Gm5：葉片黃綠相間、皺縮、畸形；Gm6：葉片有凸起、嚴重褶皺、畸形（圖1）。

1.2植物總RNA的提取

采用小量總RNA提取試劑盒（簡石生物）提取大豆葉片樣本的總RNA，使用NanoDrop微量核酸蛋白濃度測定儀（Thermo Scientific）測定濃度。

1.3小RNA文庫建立、測序及分析

文庫構建、測序及原始數據整理由北京奧維森基因科技有限公司完成。質量合格的總RNA樣品采用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫，隨后使用Agilent 2100系統對文庫的insert size進行檢測，并通過qPCR對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，對不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后，利用Il-lumina NovaSeq 6000進行上機測序。采用有參考基因組寄主病毒siRNA分析流程進行候選病毒評估。

1.4病毒全長基因組序列的獲取

根據小RNA深度測序結果及參考基因組序列，分別針對每個樣品設計5組特異性引物（Gm-SMV-F1/R1～F5/R5）用于擴增病毒的中間序列，并設計2組引物（5-F/R和3-F/R）用于擴增病毒的5'端和3'端序列（表1），以大豆葉片總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠純化，克隆至pCE2 TA/Blunt-Zero載體（南京諾唯贊），利用通用引物M13F/M13R檢測陽性克隆并測序。將獲得的序列進行拼接得到病毒的全長基因組序列。

1.5病毒基因組序列分析以及進化樹構建

利用軟件Snapgene繪制病毒的基因組結構；使用BLAST（blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/）對獲得的病毒分離物序列進行同源序列檢索；利用SDT軟件對得到的病毒分離物序列、GenBank數據庫中鄰近地區的SMV分離物以及部分其他馬鈴薯Y病毒屬分離物序列進行比對；使用MEGA11.0進行進化分析，采用neighbor joining法構建系統發育樹，bootstrap設置為1000。

2結果與分析

2.1大豆葉片小RNA深度測序結果

通過對6個大豆感病樣品進行小RNA深度測序，獲得11357732～13370921條reads，除雜、拼接后獲得897～1621個contigs，經與GenBank數據庫中登錄的病毒序列進行比對，初步鑒定樣品感染病毒種類（表2）。測序結果初步表明，河北大豆病葉混合樣品中可能只含有SMV病毒。

2.2病毒全長基因組序列及結構分析

擴增的病毒基因組片段（圖2a）經測序、拼接后得到9588nt（SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5）和9584nt （SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6）的病毒基因組序列各3條，上傳GenBank數據庫，獲得登錄號OR514681～OR514686。經過BLAST分析發現SMV-Gml、SMV-Gm3和SMV-Gm5（登錄號：OR514681～OR514683）與SMV江蘇分離物（登錄號：MH919386）的基因組核苷酸序列的相似性較高，為98.06%～98.07%; SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6（登錄號：OR514684～（）R514686）與SMV韓國分離物（登錄號：FJ640954）的基因組核苷酸序列的相似性較高，為98.48%-98.51%。本研究獲得的SMV河北分離物的基因組均具有典型的馬鈴薯Y病毒屬基因組結構特征，在基因組的第132位至第9332位核苷酸處存在1個大的開放閱讀框，編碼1個由3 067個氨基酸組成的多聚蛋白（分子量349.74～350.24kD）。該多聚蛋白能夠加工成為10個成熟的蛋白質，從N端到C端依次為：35.1～35.2kD的P1蛋白（132-1058nt）、52. 2～52.4kD的HC-Pro蛋白（1059-2429nt）、40.1kD的P3蛋白（2430-3470nt）、5.8kD的6KI蛋白（3471-3626nt）、71.2～71.4kD的CI蛋白（3627-5528nt）、6.1 kD的6K2蛋白（5529-5687nt）、22.1kD的VPg蛋白（5688-6257nt）、27.7 kD的NIa-Pro蛋白（6258-6986 nt）、59.6kD的NIb蛋白（6987-8537nt）和29.8～29.9kD的CP蛋白（8538-9332nt），并在P3蛋白內移碼產生的1個26.6kD的P3N-PIPO蛋白（2430-3112nt）（圖2b）。

2.3SMV分離物與其他馬鈴薯Y病毒屬分離物的同源性分析

選取我國不同省份、日本和韓國的SMV分離物以及部分鄰近省份的其他馬鈴薯Y病毒屬分離物，利用SDT軟件兩兩比較這些病毒分離物與SMV6個分離物的全長基因組核苷酸序列以及編碼蛋白的氨基酸序列的同源性。結果表明，河北分離物SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5（登錄號：OR514681～OR514683）與SMV江蘇分離物（登錄號：MH919386）的核苷酸序列相似性較高，為98.1%，與GenBank數據庫中登錄的SMV河北分離物（登錄號：KR065437gt;的核苷酸序列相似性為92.6%-92.7%。其編碼蛋白的氨基酸序列（登錄號：WNY15496～WNY15498）分別與不同地區來源的SMV分離物具有較高的相似性：P1和6K2與山西（登錄號：AGR55588.1）和江蘇分離物（登錄號：AYR17245.1）相似性最高，為97.7%～100%，其中P1與GenBank數據庫中登錄的SMV河北分離物（登錄號：ALF99870.1）的P1蛋白的相似性為66.3%～67.0%; HC-Pro和VPg與山西分離物相似性較高，為99.5%～100%；P3和P3N-PIPO與浙江分離物（登錄號：CAC86162.1）相似性較高，為98.6%-100%;6K1與浙江、山西和黑龍江分離物（登錄號：AKN90466.1）相似性最高，為100%; CI和NIa-Pro與江蘇分離物相似性較高，為99.4%～100%;NIb和CP與江蘇和浙江的分離物相似性較高，為99.2%～99.6%。

本研究獲得的河北分離物SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6（登錄號：OR514684～OR514686）與SMV韓國分離物（登錄號：FJ640954）相似性較高．達98.5%，與GenBank數據庫中登錄的SMV河北分離物（登錄號：KR065437）相似性為92.3%-92.4%。SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6編碼蛋白的氨基酸序列（登錄號：WNY15499～WNY15501）除NIa-Pro外，均與SMV韓國分離物（登錄號：ACU98939.1）具有較高相似性，為98.4%～100%，NIa-Pro則與北京（登錄號：QLL99540.1）、黑龍江、浙江和日本分離物（登錄號：BBG28435.1）相似性最高，為100%，而Pl與GenBank數據庫中登錄的SMV河北分離物（ALF99870.1）的Pl蛋白的相似性為65.4%～65.7%。本研究獲得的SMV河北分離物與我國其他地區及日本、韓國的SMV分離物核苷酸序列均具有92%以上的相似性，而與鄰近省份其他種類馬鈴薯Y病毒屬分離物相似性均低于80%。

通過比較本研究獲得的各分離物的氨基酸序列，發現SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5和SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6之間差異相對較大的蛋白為6K2和P3，差異率分別為3.8%和3.7%～4.3%。兩組分離物在6K2蛋白序列上存在2個氨基酸的差異（圖3a），且在P3蛋白的C端出現較大差異（圖3b）。為明確該病毒分離物的系統進化情況，利用上述進行同源性比較的病毒分離物基因組全長核苷酸序列構建系統發育樹（圖4）。從圖中可以看出，本研究獲得的河北分離物SMV-Gml/SMV-Gm3/SMV-Gm5與SMV江蘇分離物具有較近的遺傳距離，并與江蘇、浙江和山西的SMV分離物聚為一小簇；而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6與SMV韓國分離物具有較近的遺傳距離并聚為一小簇，所有SMV分離物聚為一大簇，與來自鄰近省份的其他馬鈴薯Y病毒屬分離物均有較遠的遺傳距離。

3結論與討論

本研究利用小RNA深度測序技術從河北大豆樣品中鑒定到SMV，按照國際病毒分類委員會（In-ternational Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）關于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的劃分標準，病毒全長基因組的核苷酸序列一致性低于76%即可劃分為新種。本研究測定的SMV-Gml～SMV-Gm6分離物的全長基因組核苷酸序列與GenBank中登錄的SMV分離物一致性最高為98.06%～98.51%，高于76%標準，因此，SMV-Gm1～SMV-Gm6是SMV的6個變體。值得一提的是，雖然Gm1、Gm5和Gm6樣品中通過高通量測序技術能夠檢測到CMV的RNA1片段，但是卻沒有CMV的RNA2和RNA3斤段。RT-PCR擴增也沒有在這些大豆樣品中檢測到CMV的RNA2和RNA3。與此一致的是，之前的報道表明，CMV的RNAI能夠整合到大豆基因組中，產生大量針對CMV RNA1的小RNA，從而可能傳遞對CMV的抗性。所以，我們檢測到的CMV RNA1來源的小RNA可能是整合到寄主DNA后轉錄加工產生的小RNA，而不是CMV病毒侵染產生的小RNA。

本研究鑒定到的6個SMV河北分離物中，SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5序列之間相似性最高，且與江蘇省分離物（登錄號：MH919386）的相似性達到98.06%-98.07%，而SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6之間相似性最高，且與韓國分離物（登錄號：FJ640954）相似性達到98.48%～98.51%；氨基酸序列比對發現，SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5的氨基酸序列分別與不同地區的SMV分離物有較高的相似性；而SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6的氨基酸序列則主要與SMV韓國分離物有較高相似性。但本研究獲得的SMV分離物的PI蛋白與GenBank數據庫中登錄的SMV河北分離物的P1蛋白相似性僅為65.4%～67.0%，文獻報道表明，SMV容易與其他病毒復合侵染而發生重組，推測本研究獲得的SMVP1蛋白是由SMV和菜豆普通花葉病毒（bean common mosaic vlrus，BCMV）在P1編碼區重組而來。

本研究中參與鑒定的6個樣品在癥狀上存在一定程度的差異，通過比較各分離物的氨基酸序列，我們發現6K2蛋白和P3蛋白的C端在兩組樣品SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5和SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6之間存在較大差異。報道表明，6K2蛋白可參與病毒復制、運動和癥狀的形成，而P3蛋白的C端可決定癥狀差異，推測這可能是導致田間大豆植株癥狀差異的部分因素。

系統發育分析顯示，SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5與浙江、江蘇和山西SMV分離物聚為一小簇，且與黑龍江和日本的分離物遺傳距離較近，而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6僅與韓國分離物聚為一小簇，表明SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5的基因型在我國分布范圍較廣，而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6的基因型可能由韓國傳播而來。