2個分離自新疆不同棗樹樣本的花葉伴隨病毒

關鍵詞高通量測序；棗樹；棗樹花葉伴隨病毒；全核苷酸序列

桿狀病毒（badnavlruses）可侵染世界各地的多種重要經濟作物，造成的經濟損失在10%-90%之間。其病毒顆粒存在于寄主細胞質或液泡中，因病毒種類的不同顆粒長度從120nm到150nm不等?；蚪M為一個開放雙鏈環狀DNA分子，全長一般在7200～9200bp，至少包括3個開放閱讀框架（ORF）。ORF3編碼的反轉錄酶（reverse transcriptase，RT）和RNA酶H（RNA enzyme H，RNase H）區在桿狀病毒復制中起關鍵作用，是基因組中最保守的區域。該區域的核苷酸差異大于20%可用于桿狀病毒屬的新種的分類標準。某些情況下，桿狀病毒可以被整合到寄主植物的基因組中。因此桿狀病毒也被稱為內源性病毒。桿狀病毒既可以感染單子葉植物，也可以感染雙子葉植物，但大多數桿狀病毒的寄主范圍有限。

桿狀病毒引起的病害癥狀主要取決于寄主及其品種，病毒種類和環境條件。癥狀主要包括黃化斑點或壞死條紋，葉片畸形，以及節間長度縮短，植株矮化。感染桿狀病毒的作物大多具有隱癥階段，當寄主受到溫度變化和養分缺乏等非生物脅迫時，癥狀就會出現，嚴重程度也會增加。侵染熱帶和亞熱帶作物的桿狀病毒較多，有香蕉條紋病毒（bananastreak virus），可可腫枝膨大加納R病毒（cacaoswollen shoot Ghana R virus），柑橘黃花葉病毒（citrus yellow mosaic virus），菠蘿桿狀病毒（pineapple bacilliform comosus

virus），胡椒黃斑駁病毒（piper yellow mosalc virus），甘蔗桿狀病毒（sugarcane bacilliform virus），芋頭桿狀病毒（taro bacilliform virus）等。侵染溫帶植物的有無花果桿狀病毒1號（fig badnavirus l）、獼猴桃脈帶伴隨病毒（kiwifruit pulse band associatedvirus）等。

棗樹花葉伴隨病毒（jujube mosalc-associatedvlrus，JuMaV）是一種新的棗樹病害，于2015年在北京地區首次發現，感染該病毒的棗葉癥狀表現為花葉和畸形。JuMaV屬于花椰菜花葉病毒科桿狀病毒屬，基因組全長為7194bp，含有5個開放閱讀框（ORF），均位于基因組的正鏈上。

紅棗在新疆南部是農民增收的主要果樹。田間調查發現，近幾年發生花葉病的棗樹面積越來越大，棗葉黃化卷曲，棗果畸形失去商品性，嚴重影響果農的經濟收入。本研究分離了2個JuMaV毒株，并測定了全序列，為進一步探索JuMaV的傳播途徑和致病性提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

2020年7月，從阿克蘇市和喀什市岳普湖縣‘灰棗’種植區采集了36個感病樣本，包括病葉、病果和感病幼枝各12個樣本。這些感病植株的幼葉上表現為花葉和畸形的癥狀，受感染的果實上帶有圓形的失綠斑點（圖1）。幼枝上的葉片間隙變大，病葉帶有黃色斑點并畸形（圖1）。從北京房山區大石窩鎮采集了6個棗樹花葉伴隨病毒葉片樣本。于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1高通量測序

依據前人報道的方法，將等量的3個葉片樣本混合，構建1個小RNA（sRNA）的cDNA文庫，在Illumina HiSeq XTen上進行測序。使用FASTP1.5.6對原始reads進行質控：去除接頭序列，去除比重超過5%的歧義堿基（NS）或比重超過10%的低于Q20質量的reads，去除低于15個核苷酸和高于30個核苷酸的reads。然后，分別使用軟件IDBA-UD 1.1.1將k-mer值設置為15～17，軟件Velve1.2.08將K-聚合值設置為80、90和110。將過濾后的reads從頭組裝成更大的重疊群。使用BlastX和BlastN進一步分析重疊群與NCBI數據庫（http：∥www. ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列的相似性。為確定試驗的準確性，每個試驗至少設置3個重復，以健康的葉片和果實樣本作為對照。

1.2.2病毒基因組序列鑒定

用天根植物基因組DNA提取試劑盒從有明顯癥狀的葉片和果實中提取總I）NA（葉片樣本：AKS-6，YPH-1；果實樣品：FAKS-6，FYPH-1；幼枝樣品：TAKS-6，TYPH-1）。根據高通量測序結果，使用Primer 5.0軟件設計1對特異性檢測引物對JuMaV進行鑒定。為獲得樣品中JulVLaV的全序列，設計了4對覆蓋全基因組的引物（表1）。以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

為了進一步驗證JuMaV-AKS和JuMaV-YPH的反轉錄酶（RT）和RNA酶H（RNase H）結構域在ORF3b上的氨基酸序列與JuMaV-26的相應序列上的差異性和是否存在缺失片段，我們設計了1對引物QZ-F（5'-TCGAGGAACTTTGGACAGGC_3）和QZ-R（5'-TCATATAATGGGCCTAGTT_3），對采集自阿克蘇市、喀什市岳普湖縣和北京的棗樹花葉伴隨病毒的陽性樣本分別進行PCR擴增，回收、克隆并測序。

1.2.3序列分析

使用MEGA7.0對測序獲得的基因組序列進行組裝并分析。組裝后的全序列使用NCBI Gen-Bank數據庫BLAST（http：∥www. ncbi. nlm. nih.gov/genbank/）進行同源性搜索?；蚪M的序列對比以及基因組圖譜生成使用Snapgene Viewer4.3.6。并使用NCBI ORF finder預測ORF，設置最小ORF長度為75nt（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orff inder/）；使用NCBI保守結構域搜索工具預測基因產物的保守結構域（http：∥WWW．ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）。

以病毒全序列及RT和RNase H區核苷酸序列為基礎，用軟件MEGA 7．0[neighbour-Joining（NJ），bootstrap=1000]構建系統進化樹確定病毒的分類地位。

2結果與分析

2.1高通量測序結果

通過高通量測序得到44533809個raw reads，39607094個clean reads。得到的contig通過NC-BI的Nr和Nt數據庫進行BlastX和BlastN搜索。contig序列比對表明，與已報道的桿狀病毒匹配的contig有140個（表2），其中有39個contig與Ju-MaV匹配，其長度為48～448bp，序列的相似性為71.89%～99.54%。

2.2病毒特異性引物對樣品的檢測結果

特異性引物檢測結果表明：從阿克蘇市和喀什市岳普湖縣采集的感病葉片、果實、幼枝中都檢測到了JuMaV（圖2）；從北京采集的感病葉片也檢測到了JuMaV，而同一株棗樹上采集的果實上尚未檢測到。測序得到核酸序列經BLAST分析表明，該片段與JuMaV相應區域序列（登錄號：KX852476.1）的最大相似性為100%。

2.3基因組序列測定及分析

利用4對引物進行PCR擴增均可得到特異性條帶（圖3），序列拼接后得到2條病毒全序列，全長分別為7086bp和7146bp。分析表明這2條全基因序列與JuMaV的全基因序列的同源性較高，為棗樹花葉伴隨病毒的Ⅺ分離株，分別稱為JuMaV的AKS株（JuMaV-AKS）和YPH株（Ju-MaV-YPH），GenBank登錄號分別為MW892537和OL739568。

這2個分離物的基因組結構與分離物26高度相似（圖4）。ORF1、ORF2和ORF3a的核酸序列和位置完全相同，而反轉錄酶和RNase H結構域在ORF3b上的氨基酸序列存在明顯差異，大多數氨基酸的差異是隨機分布在整個多聚蛋白中的。由于該區域的核苷酸插入和缺失，從殘基5046到5987的JuMaV-AKS和JuMaV-YPH的核苷酸序列與JuMaV-26的相應序列有很大的不同（圖5）。通過對比，JuMaV-AKS和JuMaV-YPH 2個分離物與JuMaV-26的核苷酸序列相似性分別為99.54%和95.93%，氨基酸同源性分別為100%和98.48%。

用引物QZ-F/QZ-R對采集自阿克蘇市、喀什市岳普湖縣和北京的棗樹花葉伴隨病毒的陽性樣本PCR擴增結果顯示：阿克蘇市、喀什市岳普湖縣的陽性片段大小基本一致，分別為813bp和873bp，與北京樣本的擴增產物大小有明顯差異（圖6）。通過克隆測序得出：阿克蘇市、喀什市岳普湖縣、北京樣本PCR產物大小分別為813、873、923bp。結果表明3個不同地區的棗樹花葉伴隨病毒分離株的全基因序列在RT和RNase H編碼區的差異性是確實存在的，也說明棗樹花葉伴隨病毒在新疆紅棗上正在發生變異，但還未達到新種的分類標準。

2.4系統進化分析

基于全基因組構建的系統進化樹顯示，JuMaV-AKS和JuMaV-YPH與JuMaV-26同屬一組（圖7a）?；赗T和RNase H區域核苷酸序列的系統發育樹表明，JuMaV-AKS和JuMaV-YPH與Ju-MaV-26進化關系非常近（圖7b）。

3討論

桿狀病毒屬病毒種類多樣，能侵染世界各地很多重要的經濟作物，造成嚴重的經濟損失。受到棗樹花葉伴隨病毒侵染的棗樹，癥狀首先表現為棗葉黃化、扭曲、花葉，棗樹嫩枝表現更甚。果實畸形，內部會出現大量黑色或褐色結實，口感變差，品質下降而失去商品性，并出現大量落果，損失率在50%～85%，嚴重致絕產絕收。桿狀病毒屬病毒在新疆地區作物上只在棗樹上有報道，且研究文獻較少，是否會侵染其他作物有待進一步研究。

桿狀病毒屬基因組序列一般都包含3個ORFs，編碼的蛋白質被命名為P1、P2、P3，但甘薯白斑病毒和棗花葉伴隨病毒較為特殊，ORF3被較短的核酸序列間隔區分為兩部分（分別為ORF3a和ORF3b），蛋白P1的功能未知，P2是病毒粒子相關蛋白，P3是一種含有運動蛋白、衣殼蛋白、天冬氨酸蛋白酶和RT/RNaseHI蛋白前體的多聚蛋白。棗樹花葉伴隨病毒Ⅺ株的序列具有明顯的桿狀病毒屬特征，與以前的報道結果一致。

已知的棗樹病害有枯萎病、果腐病、銹病、炭疽病、縮果病、白粉病、棗瘋病等近30種。棗樹花葉病是2016年由新疆林業科學院果樹病理實驗室科研人員在阿克蘇地區溫宿縣發現，但近幾年來在新疆紅棗種植區呈逐年擴散并加重趨勢。對采集于新疆阿克蘇市和喀什市岳普湖縣的疑似棗樹花葉伴隨病毒的感病葉片、果實以及幼嫩枝條樣本分離出的棗樹花葉伴隨病毒的基因組進行了克隆和測序，結果表明，得到的2個分離物與JuMaV-26的序列相似性較高，但也出現了一些核苷酸替換、缺失、插入，并且氨基酸的變化主要集中RT編碼區，表明這些分離株在種群中可能存在遺傳異質性。

桿狀病毒屬會因為寄主的不同或者病毒種類的不同其傳播方式也不同。桿狀病毒最初的大規模傳播是通過營養繁殖發生的，少數病毒是通過其他方式傳播的?？煽赡[枝病毒（CSSV）是通過不同種類的粉虱進行二次傳播或水平傳播，懸鉤子黃網病毒（rubus yellow net virus，RYNV）、獼猴桃脈帶相關病毒（GVBaV）通過蚜蟲半持久化傳播。近幾年的田間調查發現，棗樹花葉伴隨病毒可以通過營養繁殖傳播。在田間采取具有花葉病癥狀的嫩枝進行嫁接，成活后新發的嫩葉有明顯的黃化、斑點、畸形等發病特征。棗樹花葉伴隨病毒是否通過蟲媒或其他方式傳播是我們進一步研究的重點。

本文獲得了JuMaV-AKS和JuMaV-YPH的全基因組序列，在分子水平上表明了JuMaV傳播的廣泛性和遺傳變異性。此外，筆者所在課題組，前期根據對棗樹花葉病病葉的高通量測序結果確定了Ju-MaV的存在，并設計了1對檢測該病毒的特異性引物，建立了高效的檢測技術，對紅棗整個生育期進行病害侵染動態的追蹤檢測與分析，表明了JuMaV與棗樹田間表現的病害癥狀有極大關系，極有可能是主要病原。

4結論

通過對新疆阿克蘇市和喀什市岳普湖縣采集的疑似JuMaV樣本的高通量測序，證實了該病毒的存在，并通過全基因序列測序得到2個分離物的全序列。本試驗證實了新疆地區的棗樹花葉病是由Ju-MaV的侵染引起的，并且JuMaV在新疆發生了一定的遺傳變異。