Bt對棉鈴蟲天蠶素抗菌肽基因（HacD）轉錄的影響

關鍵詞棉鈴蟲；蘇云金芽胞桿菌；免疫致敏；抗性；抗菌肽；脂肪體

近年來棉鈴蟲暴發為害嚴重阻礙了甘肅河西地區玉米制種產業的良好發展。為治理此害蟲，蘇云金芽胞桿菌作為一種友好型生物農藥在田間被廣泛推廣，但同化學殺蟲劑一樣，隨著長期大規模使用，抗性問題逐漸凸顯，現在已成為影響Bt轉基因作物和Bt殺蟲劑可持續利用的主要因素。為了治理害蟲對Bt的抗性，學者從適合度代價、分子機理和內環境免疫等多方面進行了探索，其中體液免疫和細胞免疫是昆蟲清除體內病原物和防止致病或致死性微生物侵染的重要屏障，而在昆蟲的免疫系統中，抗菌肽發揮了主要的抑菌活性。例如用一種非致病性大腸桿菌Escherichia coli誘導煙草天蛾Manduca seZta幼蟲抗菌肽表達，能夠降低其感染毒性發光桿菌后的死亡率。經金黃色葡萄球菌、粉虱座殼孢、枯草芽胞桿菌等多種菌源誘導的黃粉蟲抗菌肽提取物對昆蟲病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌Escherichia coli均有抑菌作用。由此可見，抗菌肽表達是害蟲對生物殺蟲劑產生抗性的重要途徑。

截至目前，在植物和動物中已有超過1200多種抗菌肽被相繼發現，其中昆蟲抗菌肽超過200種，主要包括天蠶素、防御素、攻擊素、雙翅肽、葛佬素和溶菌酶等。對鱗翅目昆蟲分析表明，幼蟲期抗菌肽在消化道、血淋巴和脂肪體中相對表達量較高，且不易被胰蛋白酶和胃蛋白酶水解。另有研究表明，不同抗菌肽針對的病原微生物不同，但天蠶素抗菌肽具有相對較廣的抑菌范圍，不僅對黏質沙雷氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等病原細菌具有很強的抑制作用，而且對蟬擬青霉和白色念珠菌等病原真菌也有拮抗作用。因此天蠶素抗菌肽常被添加到動物飼料中來防治微生物侵染引起的疾病，天蠶素抗菌肽主要存在于鱗翅目和部分雙翅目昆蟲中，為一類小分子肽，由31～39個氨基酸殘基組成，等電點為9.52～11.17，100℃下暴露10～15mln仍可保持抑菌活性，其“螺旋一卷曲一螺旋”的結構特點能夠保持較高抗菌活性，而酰胺化的C端則對其廣譜作用極為重要。天蠶素抗菌肽并不是通過直接的毒理方式殺滅病原微生物，而是通過與細胞膜結合形成具有活性的功能結構，進而改變質膜通透性，使病原菌滲透壓失衡而消亡。天蠶素抗菌肽在宿主防御中除了能殺死病原菌，還可阻斷由脂多糖等細菌組分誘導的基因表達，從而表現出抗菌和抗內毒素的雙重性質，這對害蟲形成Bt抗性具有促進作用。

綜上所述，免疫系統表達的抗菌肽能夠抵御多種病原菌的侵染，尤其天蠶素抗菌肽是昆蟲抵御外源生物侵害的重要物質基礎，與害蟲對生物農藥的抗性密切相關。因此研究Bt對棉鈴蟲天蠶素抗菌肽基因（HacD）轉錄的影響有助于進一步理解棉鈴蟲對Bt的抗性發展機制，對害蟲抗藥性治理、降低農藥用量等方面均具有重要借鑒意義。

1材料與方法

1.1試蟲和Bt菌株來源

棉鈴蟲采自甘肅省武威市黃羊鎮（37°41'N，102°56'E），帶回室內在溫度（27±1）℃，相對濕度（75±1）%，光周期L∥D=16h∥8h條件下用人工飼料飼養，繁殖3代以上，形成穩定種群備用。

Bt菌株由甘肅省農業科學院植物保護研究所提供，在LB培養液中37℃，240r/min振蕩培養24h，10000g離心10min，去上清液后收集菌體，后用PBS沖洗2次稱重備用。

1.2Bt誘導飼料制備

飼料配方參照梁革梅等的人工飼料配方4。在配制過程中，每1000mL人工飼料加50mgBt菌，使飼料中的菌濃度為0.05mg/mL。在加入Bt時需要進行重懸浮處理，所用100mL蒸餾水從飼料配方中分取，待飼料溫度降至約40℃時加入，迅速攪拌均勻后倒出冷卻定型，4℃保存備用。

1.3試驗方法

1.3.1短期Bt誘導

將備用的Bt誘導飼料切成1cm3的小塊，分裝在滅菌的24孔板中。用潤濕的小毛筆挑取活躍且大小一致的棉鈴蟲3齡幼蟲，輕放在分裝的飼料上，每塊飼料接入1頭幼蟲，完成后在24孔板上蓋一層95%乙醇滅菌的吹塑紙，后蓋上蓋子防止幼蟲逃逸。最后將處理的試蟲轉移至人工智能培養箱中，培養條件同1.1。Bt誘導處理每3板（24頭）試蟲為1組重復，每處理設3組重復，同時設1組未添加Bt活菌的常規飼料作對照。

1.3.2持續Bt誘導

Bt誘導接蟲方法和飼養條件同1.3.1。接蟲時選取活躍且大小一致的初孵幼蟲接人，每3d更換新的Bt誘導飼料，直至幼蟲發育至5齡。Bt誘導處理每3板試蟲為1組重復，每處理設3組重復，同時設1組未添加Bt活菌的常規飼料作對照。對照組幼蟲生長發育快，會較早發育至5齡，因此先提取對照組RNA，并在-80℃下保存待測。

1.3.3傳代培養

待持續Bt誘導且存活的老熟幼蟲化蛹后，收集蛹并轉移至羽化盒中，10～14d時觀察羽化情況，并將羽化的成蟲轉移至產卵籠中，飼以30%蜂蜜水，促其產卵；后將卵在溫度（27±1）℃，相對濕度（75±1）%，光周期L∥D=16h∥8h條件下孵化，初孵幼蟲飼以常規人工飼料，直至幼蟲化蛹并再次羽化，飼養條件同1.1。Bt誘導處理每3板試蟲為1組重復，每處理設3組重復，同時設1組未添加Bt活菌的常規飼料作對照。

1.3.4樣本采集

棉鈴蟲天蠶素抗菌肽基因（HacD）在幼蟲整體的相對轉錄水平、Bt誘導下不同組織中HacD的相對轉錄水平、HacD cDNA序列測定均在Bt短期誘導24h時采集3齡幼蟲進行試驗。HacD隨Bt誘導時間的相對轉錄水平在3齡幼蟲短期誘導0h時即開始采集幼蟲，后每隔6h采集1次，直至48h結束；Bt誘導棉鈴蟲不同階段HacD相對轉錄水平根據發育時期采集樣本，直至F1代成蟲。以上不同時間、不同組織及F1代的轉錄水平均以未添加Bt的常規飼料處理為對照，不同處理組每重復采集6頭幼蟲，每處理共采集18頭幼蟲。

1.3.5樣本組織收集

血淋巴收集：將試蟲放置在冰塊上，待其活動敏捷度降低或不動時，用滅菌的昆蟲針將其臀足刺破，輕輕擠壓蟲體，使血淋巴溢出，并迅速轉移至滅菌的離心管內，液氮中保存。

中腸收集：將收集完血淋巴的試蟲用滅菌的小剪刀從頸部刺入，向臀足方向剪開表皮，暴露出中腸，用鑷子取下中腸，在4℃預冷的4% NaCI溶液中用昆蟲針將中腸剖開，洗去內含物，再用預冷的蒸餾水沖洗，后轉移至滅菌的離心管內，于液氮中保存。

脂肪體收集：將收集完中腸的試蟲用滅菌的鑷子刮取附著在表皮上的脂肪體，用濾紙吸去脂肪體上殘留的淋巴液，后轉移至滅菌的離心管內，液氮中保存。

1.3.6樣本RNA提取、cDNA合成和目的基因擴增

采用RNAprep Pure動物組織總RNA提取試劑盒（Tiangen，DP431）提取樣品總RNA，采用FastKing -步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒（Tiangen，KR118-02）合成cDNA。根據HacD cDNA序列（GenBank登錄號：EU041763.1）在NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih. gov/）上設計擴增HacD全長的特異性引物（表1）。PCR總體積50uL，包括100umol/L的上下游引物各1uL，反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環35次；72℃延伸10min。HacD全長PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳驗證后送通用生物（安徽）股份有限公司（http：∥WWW.generalbiol. com/）測序。

1.3.7HacD轉錄分析

根據HacD cDNA序列（GenBank登錄號：EU041763）在NCBI（https：∥www. ncbi. nlm. nih.gov/）上設計RT-qPCR特異性引物（表1），以Actin為內參基因進行RT-qPCR分析。反應體系總體積25uL，包括100umol/L上、下游引物各1uL，SuperReal PreMix（SYBR Green） 12.5uL，模板cDNA 1uL。反應程序：95℃預變性30s；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，循環40次。

1.4數據統計與分析

基因相對轉錄水平計算采用2 -△△法。采用Excel進行數據整理，采用IBM SPSS Statistics25.0進行數據處理。其中多重比較采用Duncan氏新復極差法，置信區間為95%;兩兩比對采用配對樣本t檢驗進行顯著性分析，置信區間為95%。

2結果與分析

2.1HacD cDNA序列與蛋白質翻譯

棉鈴蟲HacD cDNA序列大小為189 bp，其中G、C、A、T含量分別為26.46%、21.69%、25.40%和26.46%，其肽鏈翻譯為MNSKIVLFLCVCLV-LVSTATAWDFFKELEGAGQRVRDAIISAGPAV-DVLTKAKGLYDSSEEKD，以具有疏水性的甲硫氨酸起始，以酸性天冬氨酸結束，共有63個氨基酸。通過NCBI數據庫檢索，該序列與棉鈴蟲HacDcDNA序列（GenBank登錄號：EU041763.1）的匹配度為100%，表明所獲得的棉鈴蟲HacD基因完整性良好，序列準確可靠。

2.2Bt誘導下棉鈴蟲HacD的轉錄情況

Bt短期誘導棉鈴蟲3齡幼蟲24h后，其HacD轉錄整體呈上調趨勢（圖1），但在中腸、血淋巴和脂肪體中的相對轉錄水平不同（圖2），其中以脂肪體HacD轉錄上調最為顯著，且相對轉錄水平最高，其次為血淋巴；中腸轉錄水平最低，與對照無顯著差異。

2.3不同組織中HacD隨誘導時間的轉錄特性

Bt短期誘導下，HacD在中腸、血淋巴和脂肪體中的轉錄規律不同（圖3），整體以脂肪體中HacD的相對轉錄水平最高，在Bt誘導前期呈持續升高的上調趨勢，24h時達到最高值，隨后逐漸下降；血淋巴中HacD的轉錄規律與脂肪體相似，但相對轉錄水平最高值為誘導18h，且整體上調程度較脂肪體低。中腸HacD相對轉錄水平最低，幾乎不受Bt影響，誘導期間沒有出現明顯的上調或下調趨勢。

2.4Bt誘導下HacD在兩代間的轉錄特征

為了明確Bt誘導下HacD在兩代間的轉錄特征，利用Bt從Fo代開始對棉鈴蟲進行持續誘導。結果顯示（圖4），F0代初孵幼蟲、5齡幼蟲、蛹和成蟲的HacD相對轉錄水平均顯著高于對照組各蟲態，尤其以5齡幼蟲相對轉錄水平最高。傳代培養至F1代時，初孵幼蟲、5齡幼蟲、蛹和成蟲的HacD相對轉錄水平較F0代呈顯著下調趨勢。在F1代HacD轉錄水平下調趨勢下，除5齡幼蟲外，初孵幼蟲、蛹和成蟲與對照組對應蟲態的相對轉錄水平沒有顯著性差異，但各蟲態仍然保持了高于對照組的表達特性。

3結論與討論

近年來，棉鈴蟲對河西地區制種玉米和高產玉米的為害居高不下，為了防治該害蟲，Bt制劑成為諸多綠色防控技術集成的核心內容，盡管多種Bt殺蟲蛋白已經被挖掘，但基于應用成本和當前開發程度的限制，菌劑仍然是當前推廣的首選防治藥劑。隨著Bt菌劑長期使用，抗藥性發展問題逐漸凸現，并且許多研究發現昆蟲免疫系統也參與了Bt抗性形成的過程，因此本研究從棉鈴蟲體液免疫出發，對其HacD基因誘導轉錄進行了研究。結果表明，在Bt誘導下，HacD基因轉錄整體呈上調趨勢，這與小菜蛾抗菌肽的表達特征相似。小菜蛾取食Bt殺蟲蛋白之后，體內抗菌肽含量顯著增高，并且生測結果顯示血淋巴富集液表現出較強的抑菌活性。昆蟲抗菌肽主要在脂肪體、血淋巴和消化道中表達，本研中Bt誘導的HacD基因在脂肪體中轉錄上調最高，其次為血淋巴。脂肪體內HacD基因在誘導24h時轉錄水平達到最高，這與鄭志華等對小菜蛾抗菌肽調控表達的研究結果高度相似，但與牛麗洋的研究不同。后者的研究結果表明，Bt誘導的天蠶素轉錄上調在5h達到峰值，這種差異性可能與物種對Bt的敏感程度有關，也可能與經消化道誘導和血淋巴微注射誘導的方式有關。

為了明確Bt誘導下棉鈴蟲HacD基因在兩代間的轉錄特征，本研究利用Bt對其進行了持續誘導。結果發現，雖然子代（F1）棉鈴蟲初孵幼蟲、5齡幼蟲、蛹和成蟲的HacD轉錄水平相對于母代（F0）出現顯著下調，但均較對照高，而且F1代5齡幼蟲的轉錄水平顯著高于對照，這種現象可能與誘導轉錄在兩代間的傳遞有關。對黃粉蟲的適應性免疫研究表明，給黃粉蟲母代注射細菌脂多糖能夠增強后代血淋巴的抗菌肽活性，這有力地證明了適應性免疫可遺傳的存在可能。通常認為免疫特性在兩代間的傳遞主要涉及表觀修飾和卵黃原蛋白傳遞2個方面的機制。Eggert等利用雙雜交試驗發現赤擬谷盜子代中只有獲得免疫的雄蟲才能提升致病菌感染下的存活率，這表明對子代的免疫保護機制是通過精子傳遞的，而在這個過程中表觀修飾發揮著潛在作用，但是這種遺傳的論證目前還不充分。其次，大多數免疫特性的傳遞是從雌蟲傳遞給子代的，雌蟲除了傳遞遺傳信息外還將一些營養物質（如卵黃原蛋白）傳遞給子代，這些物質也能參與免疫效應的傳遞。另外，Salmela等證實了卵黃原蛋白在合成到轉運至卵巢的過程中可以與細菌或病原相關分子結合，并遺傳給下一代，從而實現昆蟲免疫特性在世代間的傳遞。截至目前，盡管昆蟲免疫響應的傳遞已經在多種昆蟲中報道，但免疫的傳遞涉及生殖和免疫兩個生理系統的共同作用，相關效應元件復雜且多樣化，導致系統免疫產生的抗性在親、子代傳遞的潛在機理仍然不清晰，多限于研究性推測，其中機理還有待進一步研究。